我们提出了一个评估GtACR1激活在兔子心肌细胞中的机电效应的协议。我们提供细胞分离、培养和抗病毒转导的详细信息,以及贴片夹和碳纤维技术的功能实验。
在过去的二十年里,光遗传学工具被确定为调节兴奋组织中细胞型特定活动(包括心脏)的有力手段。虽然Channelrhodopsin-2 (ChR2) 是消除心肌细胞(CM)膜电位的常用工具,但可能引起作用电位(AP),但一种有效工具,可以可靠地沉默CM活性一直缺失。有人建议使用Anion通道多普辛(ACR)进行光遗传学抑制。在这里,我们描述了一种协议,以评估激活天然ACR GtACR1的影响,从吉拉尔迪亚Ta在培养兔CM。 初级读出是电生理贴片夹记录和光学跟踪CM收缩,两者都执行,同时应用不同的光刺激模式。该协议包括CM从兔心分离,细胞播种和培养长达4天,通过光门氯化物通道腺病毒编码转导,配线夹和碳纤维设置的准备,数据收集和分析。在全单元配置中使用贴片夹技术,可以实时记录光激活电流(电压夹模式、V 型夹)和 AP(电流夹模式、I 型夹)。除了贴片夹实验外,我们还进行合同性测量,以在不干扰细胞内环境的情况下对CM活性进行功能评估。为此,使用碳纤维机械预装细胞,并通过跟踪沙康长和碳纤维距离的变化来记录收缩。数据分析包括从 I 夹记录评估 AP 持续时间、V 夹记录的峰值电流和碳纤维测量的力计算。所述协议可应用于不同光遗传学执行器对CM活性的生物物理效应测试,这是发展对心脏组织和整个心脏光遗传学实验的机械理解的先决条件。
ChR介导的光流首次记录在单细胞绿藻1、2的眼点中。在基因克隆和异质表达Chlamydomonas reinhardtii ChR1和ChR2后不久,ChR被用作工具,改变在Xenopus卵母细胞和哺乳动物细胞的膜潜力的光3,4。阳离子非选择性ChR使膜的膜去极化,其静止膜电位对ChR的逆转电位呈负。因此,它们可用于诱导兴奋细胞中的AP,包括神经元和CM,允许光学起搏5,6。
补充阳离子ChR,光驱动质子,氯化物和钠泵7,8,9已用于抑制神经元活动10,11,12。然而,后者有局限性,需要高光强度和持续照明,因为每个吸收的光子运输一个ion。2014年,Wietek等人和Berndt等人的两项独立研究描述了通过通道孔13、14的突变将阳离子传导ChR转化为ACR。一年后,天然ACR被发现在隐质吉拉尔迪亚塔(GtACR)15。由于工程ACR显示残余阳离子传导,它们被天然ACR所取代,其特征是大的单通道传导和高光灵敏度15。GtACR用于通过极化膜电位来抑制神经元活动,使氯化物16、17的逆转电位。Govorunova等人将GtACR1应用于培养的大鼠心室CM,并在低光强水平下表现出有效的光抑制作用,而低光强度水平不足以激活先前可用的抑制工具,如质子泵Arch18。我们小组最近报告说,GTACR1介导的CM光抑制是基于去极化,因此GtACR1也可用于CM19的光起搏。
在这里,我们提出了一个研究GtACR1光活化对培养兔心室CM的电生理和机械效应的协议。我们首先描述细胞分离、培养和转导。使用全细胞贴片夹记录测量电生理效应。在 V 夹模式下评估给定膜电压处的光介导电流。在电气或光学起搏 CM(I 夹模式)时测量膜电位动力学。使用持续光应用测试电触发 AP 的光学抑制。机械效应使用碳纤维与基于成像的沙康雷长度跟踪相结合进行测量。为此,光学可快步细胞通过将两个碳纤维连接到靠近相反细胞端的等离子膜进行机械预装。在光学或电气起搏过程中记录萨科雷长度变化。最后,在细胞电场刺激过程中测量光抑制,并分析产生的力。
该协议包括图1中流图中显示的以下步骤:兔深麻醉、硫丹病毒过量注射、心脏切除、朗根多夫灌注和组织消化、组织释放细胞的机械分离、CM产量的微观分析、CM的培养、腺病毒5型的转导,然后是孵化和功能实验。
图 1:用于获取电动和光学可快 CM 的协议的流程图。心脏从兔子9-10周大被切除,心脏组织被消化,同时使用兰根多夫设置渗透。细胞通过机械搅拌释放。CM 产量在显微镜下计数。CM培养,用腺病毒5型进行转导,并在转染后48-72小时进行功能实验。请点击此处查看此图形的较大版本。
光遗传学工具能够以非侵入性的方式调制兴奋细胞电生理学,但它们需要对不同细胞类型(例如CM)进行彻底的表征,以便为特定的实验设计选择最佳可用的工具。贴片夹技术是评估细胞电生理学的标准方法。在全细胞配置中,它允许记录等离子膜的光激活电流,或在光刺激/抑制后膜电压的时间变化。电激发的光遗传学操作也影响CM收缩。我们使用 sarcomere 跟踪和碳纤维辅助力测量来量化光学询问对肌细胞机械活性的影响。
我们描述了一种协议,用于描述CM中光门氯化通道GtACR1的基本效果。作为模型系统,我们选择兔子CM,因为他们的电生理特性(如AP形状和耐火期)比啮齿动物CM更接近于人类CM。此外,兔子CM可以培养几天,足够长的时间进行腺病毒的输送和GtACR1-eGFP的表达。值得注意的是,分离的CM会随时间而改变其在培养中的结构特性,包括细胞末梢的四舍五入和交叉分界逐渐丧失、T型管状系统和23、24号。为此,在培养的CM中报告了功能变化:休息膜电位去极化、AP延长和细胞Ca2+处理的变化。有关文化中细胞适应的回顾,请参阅 Louch 等人25。补充图 2显示了新隔离 CM 的模范 AP 和收缩测量值,以便与培养 CM 中观察到的 CM(图 6,图 7)中使用此处介绍的协议进行比较。
全细胞贴片夹片可直接测量光电流特性(例如,振幅和动力学)以及高时分辨率下膜电位或AP特性的光引起的变化。然而,这种记录有几个局限性:首先,细胞素被全细胞录音中的移液溶液所取代,这有利于控制离子电化学梯度,但具有洗出细胞细胞器、蛋白质和其他化合物的内在缺点,从而可能影响细胞电反应。其次,由于我们的方法只允许检测APD的变化,但无法直接测量与电生理相关的细胞舱中的离子浓度,因此难以评估非生理上长时间去极化(例如,光门离子通道的慢时间常数)引起的附加离子通道的激活。这可以通过荧光指示灯(例如 Ca2+传感器)或电子选择性电极来完成。进一步的表征可能包括光强度定位、确定pH依赖性、不同膜电位的光电流动力学以及重复光刺激期间的恢复动力学。
与贴片夹记录不同,单细胞力测量能够分析完整肌细胞的细胞收缩,而不会影响其细胞内环境。通过确定产生的力振幅和动力学(例如,收缩和放松的最大速度;此处不分析),可以间接评估对里昂浓度的次生影响(例如,Ca2+)。使用碳纤维技术进行力测量比自由收缩的细胞具有优势,因为它们提供有关预加载单元中的被动力和有源力的直接信息(即,在与原位或体内设置更相似的条件下)。机械预加载在分析细胞收缩性时尤其重要,因为拉伸会影响力生产和放松26、27。
光遗传学方法允许在单 CM 和完整的心脏组织中对细胞膜电位进行精确操作。传统上,ChR2是一种光门阳离子非选择性通道,用于膜电位的去极化,而光驱动质子和/或氯化物泵用于膜超极化。两组光遗传学执行器都需要高表达水平,因为 ChR2 的特点是具有本质上的低单通道电导28和光驱动泵,每吸收光子最大地传输一个电子。此外,在CM中长期激活ChR2可能导致Na+和/或Ca2+过载,光驱动泵可能改变跨sarmalH+或Cl-梯度29,30。为了寻找替代工具来控制CM活性,我们最近测试了天然的离子通道RhodopsinGtACR1,其特点是具有卓越的单通道传导和更高的光灵敏度,比阳型ChR(如ChR2)。我们发现,GtACR1 激活脱极化 CM,可用于光学起搏和抑制,具体取决于光脉冲正时和持续时间。与 Na+相比,使用 ACR 代替阳极 ChR 的另一个优点可能是 Cl的负反转电位更大,从而减少了人为引入的离子电流。正如我们之前所显示的,使用 GtACR1 的光学起搏可能导致由于 GtACR1 通道闭合的缓慢分量而导致 AP 延长,通过使用更快的 GtACR1 突变体19可以克服这一点。然而,AP延长在使用较低、更生理的细胞内Cl-浓度时就不那么明显了(见图6)。此外,GtACR1通过长时间照明介导的抑制会导致深度膜去极化,这再次可能激活二次Na+和Ca2+流入,从而改变电压门通道的活性。在我们的测量中,我们发现AP和收缩参数在光诱导抑制1分钟后恢复到基线(参见Kopton等人2018年图6,图7)。光门K+通道为沉默CM提供了一种有效的替代方案,而不影响CM静膜电位31。
将来,我们希望定量地比较不同的光遗传学工具,以寻找它们抑制心脏活动的潜力。为此,我们测试各种光门电道,包括ACR,ChR2和红移ChR变种32,以及超极化执行器,如卤素多辛或光门腺环酶bPAC结合钾通道SthK(PAC-K)31。
此处提出的协议可用于对CM的机电特性进行深入表征。它主要也适用于其他物种的CM,以及从患病心肌分离的CM。光学刺激允许一个人以不同的频率对CM进行步速调整,在碳纤维收缩实验中可以测试不同的预载量。一个有趣的实验是使用低强度照明进行亚阈值去极化,模拟静膜电位的逐渐增加,正如在疾病进展期间心脏组织重塑过程中观察到的。最后,功能测量可以与Ca2+成像相结合,以进一步深入了解激励-收缩耦合,或与药理学干预,以评估不同药物对CM活性的影响。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢斯特凡妮·佩雷斯-费利兹的出色技术援助, Jonas Wietek博士(德国柏林洪堡大学)为提供pUC57-GtACR1质粒,迈克尔·舒普博士(查理特-柏林大学,柏林联邦药学院)为腺病毒生产提供,阿纳斯塔西娅·霍赫洛娃博士(乌拉尔联邦大学)分享她的专业知识,以改善细胞分离协议,并重新设计管状装置。该项目由德国研究基金会资助(SPP1926:SCHN 1486/1-1;艾美-诺瑟奖学金:SCHN1486/2-1)和ERC高级助学金CardioNECT。
Equipment – Cell isolation/Culturing/Transduction | |||
Adeno-X Adenoviral System 3 CMV | TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, California, USA | ||
Aortic cannula | Radnoti | 4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L mm | |
Coverslips ø 16 mm, Thickness No. 0 | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 631-0151 | Borosilicate Glass |
Griffin Silk, Black, 2 m Length, Size 3, 0.5 mm | Samuel Findings, London, UK | TSGBL3 | |
Incubator | New Brunswick, Eppendorf, Schönenbuch, Switzerland | Galaxy 170S | |
Langendorff-perfusion set-up | Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbläserei, Freiburg, Germany | Custom-made | |
Langendorff-pump | Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Zürich, Switzerland | ISM444 | |
Mesh: Nylon Monodur filter cloth | Cadisch Precision Meshes Ltd | 800 µm holes, 1 m wide | |
Neubauer chamber | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 717806 | |
Rabbit, New Zealand White | Charles River | Strain Code: 052 | |
Scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BC774R | Bauchdeckenschere ger. 18cm |
Sterile filter, 0.22 µm | Merck, Darmstadt, Germany | SLGP033RB | |
Equipment – Patch-clamp | |||
Amplfier | AxonInstruments, Union City, CA, United States | Axopatch 200B | |
Coverslip ø 50 mm, Thickness No. 1 | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 631-0178 | Borosilicate Glass |
Digitizer Axon Digidata | Molecular Devices, San José, CA, United States | 1550A | |
Filter (530/20) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513878 | BZ:00 |
Filter (630/20) | Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States | 227155 | |
Headstage | AxonInstruments, Union City, CA, United States | CV203BU | |
Interface | Scientifica, Uckfield, UK | 1U Rack, 352036 | |
LED 525 nm | Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States | PT-120-G | |
LED control software | Essel Research and Development, Toronto, Canada | ||
LED control system | custom-made | ||
Micropipette Puller | Narishige Co., Tokyo, Japan | PP-830 | |
Microscope inverted | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI4000B | |
Motorised Micromanipulator | Scientifica, Uckfield, UK | PatchStar | |
Optical power meter | Thorlabs, Newton, NJ, United States | PM100D | |
Silicone Grease | RS Components, Corby, UK | 494-124 | |
Silver wire | A-M Systems, Sequim, WA, United States | 787500 | Silver, Bare 0.015'', Coated 0.0190'', Length 25 Feet |
Soda lime glass capillaries | Vitrex Medical A/S, Vasekaer, Denmark | 160213 BRIS, ISO12772 | 1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm |
Software Axon pClamp | Molecular Devices, San José, CA, United States | Version 10.5 | |
Software MatLab2017 | The MathWorks, Inc. | ||
Stage micrometer | Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK | 1 mm | |
Equipment – Carbon fiber | |||
Carbon fibers | provided from Prof. Jean-Yves Le Guennec | BZ:00 | |
Digitizer Axon Digidata | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, United States | 1550B | |
Filter (530/20) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513878 | |
Filter (630/20) | Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States | 227155 | |
Fluorescence System Interface | IonOptix, Milton, MA United States | FSI-800 | 2.0 OD x 1.16 ID x 100 L mm |
Force Transducer System | Aurora Scientific Inc., Ontario, Canada | 406A | |
Glass capillaries for force measurements | Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, United States | GC200F-10 | |
Interface National Instruments | National Instruments, Budapest, Hungary | BNC-2110 | |
LED 525 nm | Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States | PT-120-G | |
LED control box | Essel Research and Development, Toronto, Canada | ||
LED control system | custom-made | ||
Microcontroller | Parallax Inc., Rocklin, California, United States | Propeller | |
Micropipette Puller | Narishige Co., Tokyo, Japan | PC-10 | |
Microscope inverted | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI4000B | |
MyoCam-S camera | IonOptix, Dublin, Ireland | ||
MyoCam-S camera Power | IonOptix, Milton, MA, United States | MCS-100 | |
MyoPacer Field Stimulator | IonOptix Cooperation, Milton, MA, United States | MYP100 | |
Piezo Motor | Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | E-501.00 | |
Silicone Grease | RS Components, Corby, UK | 494-124 | |
Software Axon pClamp | Molecular Devices, San José, CA, United States | Version 10.5 | |
Software IonWizard | IonOptix, Dublin, Ireland | Version 6.6.10.125 | |
Software MatLab2017 | The MathWorks, Inc. | ||
Stage micrometer | Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK | 1 mm | |
Chemicals | |||
Adenosine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A9251-100G | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A7030-50G | |
CaCl2 | Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA | 21114-1L | |
L-Carnitine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C9500-25G | |
Collagenase type 2, 315 U/mg | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS004177 | |
Creatine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C0780-50G | |
Cytosine-β-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C1768-100MG | |
EGTA | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 3054.3 | |
Esketamine hydrochloride, Ketanest S 25 mg/mL | Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlin, Germany | PZN-07829486 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | F9665 | |
Gentamycin 50 mg/mL | Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA | 15750-037 | |
Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | G7021-1KG | |
Heparin-Sodium, 5,000 IU/mL | Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | PZN-03029843 | |
HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | H3375-1KG | |
Insulin (bovine pancreas) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | I6634-50MG | |
K-aspartate | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A6558-25G | |
KCl | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 26764.260 | 1 mg/mL |
KOH | Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA | 35113-1L | |
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | L2020-1MG | |
M199-Medium | Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, United States | M4530 | |
Mg-ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A9187-1G | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 63069-500ML | |
NaCl | Fisher Scientific, Loughborough, Leics., UK | 10428420 | |
NaCl-Solution 0.9%, Isotone Kochsalz-Lösung 0.9% | Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 3200950 | |
NaOH | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A6579 | without Ca2+/Mg2+ |
Na-pyruvat | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | P2256-100MG | |
Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | D1408-500ML | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma, Poole, UK | 192066 | |
Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | P5147-1G | |
Taurine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | T0625-500G | |
Thiopental Inresa 0.5 g | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | PZN-11852249 | |
Xylazine hydrochloride, Rompun 2% | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | PZN-01320422 |