Summary
我们提出了一个评估GtACR1激活在兔子心肌细胞中的机电效应的协议。我们提供细胞分离、培养和抗病毒转导的详细信息，以及贴片夹和碳纤维技术的功能实验。
Abstract
在过去的二十年里，光遗传学工具被确定为调节兴奋组织中细胞型特定活动（包括心脏）的有力手段。虽然Channelrhodopsin-2 （ChR2） 是消除心肌细胞（CM）膜电位的常用工具，但可能引起作用电位（AP），但一种有效工具，可以可靠地沉默CM活性一直缺失。有人建议使用Anion通道多普辛（ACR）进行光遗传学抑制。在这里，我们描述了一种协议，以评估激活天然ACR GtACR1的影响，从吉拉尔迪亚Ta在培养兔CM。 初级读出是电生理贴片夹记录和光学跟踪CM收缩，两者都执行，同时应用不同的光刺激模式。该协议包括CM从兔心分离，细胞播种和培养长达4天，通过光门氯化物通道腺病毒编码转导，配线夹和碳纤维设置的准备，数据收集和分析。在全单元配置中使用贴片夹技术，可以实时记录光激活电流（电压夹模式、V 型夹）和 AP（电流夹模式、I 型夹）。除了贴片夹实验外，我们还进行合同性测量，以在不干扰细胞内环境的情况下对CM活性进行功能评估。为此，使用碳纤维机械预装细胞，并通过跟踪沙康长和碳纤维距离的变化来记录收缩。数据分析包括从 I 夹记录评估 AP 持续时间、V 夹记录的峰值电流和碳纤维测量的力计算。所述协议可应用于不同光遗传学执行器对CM活性的生物物理效应测试，这是发展对心脏组织和整个心脏光遗传学实验的机械理解的先决条件。
Introduction
ChR介导的光流首次记录在单细胞绿藻1、2的眼点中。在基因克隆和异质表达Chlamydomonas reinhardtii ChR1和ChR2后不久，ChR被用作工具，改变在Xenopus卵母细胞和哺乳动物细胞的膜潜力的光3，4。阳离子非选择性ChR使膜的膜去极化，其静止膜电位对ChR的逆转电位呈负。因此，它们可用于诱导兴奋细胞中的AP，包括神经元和CM，允许光学起搏5，6。
补充阳离子ChR，光驱动质子，氯化物和钠泵7，8，9已用于抑制神经元活动10，11，12。然而，后者有局限性，需要高光强度和持续照明，因为每个吸收的光子运输一个ion。2014年，Wietek等人和Berndt等人的两项独立研究描述了通过通道孔13、14的突变将阳离子传导ChR转化为ACR。一年后，天然ACR被发现在隐质吉拉尔迪亚塔（GtACR）15。由于工程ACR显示残余阳离子传导，它们被天然ACR所取代，其特征是大的单通道传导和高光灵敏度15。GtACR用于通过极化膜电位来抑制神经元活动，使氯化物16、17的逆转电位。Govorunova等人将GtACR1应用于培养的大鼠心室CM，并在低光强水平下表现出有效的光抑制作用，而低光强度水平不足以激活先前可用的抑制工具，如质子泵Arch18。我们小组最近报告说，GTACR1介导的CM光抑制是基于去极化，因此GtACR1也可用于CM19的光起搏。
在这里，我们提出了一个研究GtACR1光活化对培养兔心室CM的电生理和机械效应的协议。我们首先描述细胞分离、培养和转导。使用全细胞贴片夹记录测量电生理效应。在 V 夹模式下评估给定膜电压处的光介导电流。在电气或光学起搏 CM（I 夹模式）时测量膜电位动力学。使用持续光应用测试电触发 AP 的光学抑制。机械效应使用碳纤维与基于成像的沙康雷长度跟踪相结合进行测量。为此，光学可快步细胞通过将两个碳纤维连接到靠近相反细胞端的等离子膜进行机械预装。在光学或电气起搏过程中记录萨科雷长度变化。最后，在细胞电场刺激过程中测量光抑制，并分析产生的力。
该协议包括图1中流图中显示的以下步骤：兔深麻醉、硫丹病毒过量注射、心脏切除、朗根多夫灌注和组织消化、组织释放细胞的机械分离、CM产量的微观分析、CM的培养、腺病毒5型的转导，然后是孵化和功能实验。
图 1：用于获取电动和光学可快 CM 的协议的流程图。心脏从兔子9-10周大被切除，心脏组织被消化，同时使用兰根多夫设置渗透。细胞通过机械搅拌释放。CM 产量在显微镜下计数。CM培养，用腺病毒5型进行转导，并在转染后48-72小时进行功能实验。请点击此处查看此图形的较大版本。
Protocol
所有兔子实验都是根据欧洲议会关于保护用于科学目的的动物的第2010/63/EU号指令所述的准则进行的，并经巴登-符腾堡州地方当局批准（德国纽伦堡，X-16/10R）。
1. 细胞隔离解决方案
- 准备与以下要求的水（表1）和表2中所列的离子组合物的细胞隔离解决方案。
注：从 1 M 库存解决方案中添加 CaCl2和 MgCl2。
| 水需求 | |
| 25 °C 时的电导率 [μS/cm] | 0.055 |
| 火焰原 [欧盟/mL] | < 0.001 |
| 颗粒（尺寸 > 0.22 μm） [1/mL] | • 1 |
| 有机碳总量 [ppb] | < 5 |
| 微生物 [CFU/mL] | • 1 |
| R纳塞 [ng/mL] | < 0.01 |
| D纳斯酶 [ng/mL] | < 4 |
表1：用水需求。
| 生理盐水溶液 （1） | 低钙，高钾溶液 （2） | 酶溶液 （3） | 阻止解决方案 | |
| NaCl [mM] | 137 | 137 | 137 | 137 |
| KCl [mM] | 4 | 14 | 14 | 14 |
| HEPES [mM] | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 肌酸 [mM] | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 牛磺酸 [mM] | 20 | 20 | 20 | 20 |
| 葡萄糖 [mM] | 10 | 10 | 10 | 10 |
| MgCl2 [mM] | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 腺苷 [mM] | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 左旋肉碱 [mM] | 2 | 2 | 2 | 2 |
| CaCl2 [mM] | 1 | - | 0.1 | 0.1 |
| 纳-赫帕林 [IU/L] | 5000 | - | - | - |
| EGTA [mM] | - | 0.096 | ||
| 胶原酶类型 2， 315 U/mg [g/L] | - | - | 0.6 | - |
| 蛋白酶十四 [g/L] | - | - | 0.03 | - |
| 牛血清白蛋白 [%] | - | - | - | 0.5 |
| 肌醇 [mOsmol/L] | 325 × 5 | 345 × 5 | 345 × 5 | 345 × 5 |
表 2：CM 隔离解决方案。
- 在 37 °C 下将所有溶液调整到 pH 7.4，并检查渗透度。
注：在心脏切除前直接溶解酶（胶原酶2型和蛋白酶XIV）。使用前对所有溶液进行氧合。
2. 准备兰根多夫灌注装置
注： 使用的设置是定制的。如图2所示，该设置包括三个水套式储层（1-3）、一个螺旋反流热交换器 （4） 和一个水套灌注灌注容器 （5）。
图2：兰根多夫灌注设置针对兔细胞分离进行了优化。（1-3） 水套水库，有（1）生理盐水溶液，（2）低钙，高钾溶液和（3）含酶的心胸溶液。（4）螺旋反流热交换器和（5）水套收集罐。水套系统流入的是螺旋热交换器（溶液的温度，使热交换器末端的灌注管在37°C处应保持不变），然后是灌注容器和三个储层。所有溶液均含氧（虚线）。请点击此处查看此图形的较大版本。
- 在热交换系统中打开水浴泵以 38°C 循环水，并将所有溶液预热至 37°C。
注：流出 （4） 时的温度必须控制和恒定在 37 °C。 - 用相应的溶液填充三个储液罐，用相应的溶液清洗每条线（黑色）。使用溶液 （1） 填充末端的主（蓝色）线，无气泡。
注：在使用前（10 分钟）和使用期间对溶液进行氧化。用低钙、高钾溶液从储液罐 （3） 到水龙头填充生产线。 - 准备缝合线，将心脏系在主声箱的周围。
3. 细胞隔离
- 准备以下注射器。
- 镇静/麻醉：混合0.5 mL/kg体重甲酸酯（25毫克/米）和0.2 mL/kg体重盐酸二甲酸（2%）。
- 用 12 mL NaCl 溶液填充两个注射器 （0.9%）。
- 制备6 mL的12.5mg/mL纳硫丹，溶解在0.9%的NaCl溶液中。
- 在注射器中填充0.2 mL的盐酸氯酮（25毫克/米） 。
- 在 1 mL 0.9% NaCl 溶液（端浓度 1，000 IU/mL）中稀释 0.2 mL 的纳肝素（5，000 IU/mL）。
- 通过注射盐酸烷酮和盐酸乙烷（步骤3.1.1），使兔子（9-10周、新西兰白兔、雌兔或雄性、+2公斤）进行麻醉/麻醉。
注：兔子至少需要10分钟才能完全麻醉;确切的持续时间取决于他们的体重。确认麻醉与右反射的丧失。 - 在静脉所在的位置，切下胸部和耳朵。
- 将柔性管状物插入耳静脉，用胶带固定，然后用 0.9% NaCl 溶液冲洗。
- 静脉注射1 mL的纳肝素溶液，用0.9%的NaCl溶液冲洗。
- 注射0.2 mL的盐酸氯酮，再次用0.9%NaCl溶液冲洗，并注射纳硫酮，直到呼吸暂停。
注：兔子不应响应踏板退出反射。 - 打开左侧的箱子并取出心瓣。
- 心脏被切除时启动计时器，在生理盐水溶液中洗两次心脏。
注：使用带圆尖的剪刀，防止心脏组织意外损坏。 - 用生理盐水溶液在浴缸中对主主塔进行加努，并保持所有组织在溶液中。打开朗根多夫灌注系统（生理盐水溶液（1），速度24 mL/min）。
- 将心脏转移到兰根多夫灌注装置，将主菜连接到渗透喷嘴，并将心脏与主塔周围的缝合线紧密地绑在导管上（< 1 分钟）。
注：用生理盐水溶液预填导管，确保从罐管到朗根多夫设置的运输过程中，没有气泡进入导管，无气泡连接。 - 注入心脏，直到所有血液被冲走（2-3分钟）。
- 切换到低钙、高钾溶液（2）。心脏停止跳动并切换到酶溶液后，再注入2分钟。
- 开始循环酶溶液，从开始消化2分钟后，回到储液罐中。消化5分钟后将速度降至16mL/min。
- 当组织出现软（消化40-50分钟），切断心脏从导管和分离左心室。
- 在阻塞溶液中，通过机械分离（用移液器和细钳子轻轻拉开组织以容纳组织）释放细胞。
- 通过网状（孔径为 1 mm2）和离心机在 22 x g（重力加速度）下过滤细胞悬浮液 2 分钟。
- 取出含有非肌酸的上清液，并在阻塞溶液中重新挂起CM。
4. CM 的培养
注：在无菌条件下执行以下步骤。
- 稀释拉米宁（从恩格尔布雷斯-霍尔姆-斯温鼠肉瘤基膜，1毫克/米L）1：10在无菌磷酸盐缓冲盐水（不含Ca2+/Mg2+）到最终浓度为100微克/米。
- 准备培养介质在M199-Medium与补充，如表3所示。
| M199-介质中的细胞培养基 | |
| 肌酸 [mM] | 5 |
| 左碳碱盐酸盐 [mM] | 2 |
| 牛磺酸 [mM] | 5 |
| 纳-皮鲁瓦特 [mM] | 1 |
| 胰岛素（牛胰腺） [U/L] | 0.25 |
| 西托西因-β-D-阿拉比诺诺方 [mM] | 0.01 |
| 根塔霉素 [毫克/mL] | 0.05 |
表3：细胞培养介质。
- 无菌过滤溶液（0.22 μm），加入5%的胎儿牛血清。
- 对于贴片夹式实验，高压灭菌器盖玻片 = 16 mm，厚度为 0，在培养前直接涂上 100 μg/mL 层宁。
- 对于碳纤维实验，在95：5 EtOH：H20中涂覆在Petri盘表面，涂上聚（2-羟基苯甲酸酯）（聚-HEMA，0.12克/mL），然后使其凝固。
注：细胞不"粘"到多HEMA涂层的培养皿;这对细胞力学研究中的无摩擦收缩至关重要。 - 重新挂起 CM 结算（约 10-15 分钟）后，取出上清液，然后在培养介质中重新挂起 CM。
- 在层膜涂层盖玻片或聚HEMA涂层培养皿中，将具有 Neubauer 腔室和种子的 CM 计数，目标密度为 17，500 细胞/mL。
- 在37°C下孵育细胞，在3-4小时内孵育5%的CO2。交换盖玻片种子细胞的介质（37°C）。
- 在75的多种感染 （MOI） 中为 GtACR1-eGFP 添加腺病毒 （类型 5） 编码，并在 48 小时后开始功能实验。
注：转导后，细胞保持在黑暗中。使用蓝色或绿色光激活蛋白时使用红色照明。一种商用腺病毒输送系统（参见材料表）用于将编码GtACR1-eGFP的基因克隆到腺病毒载体中。感兴趣的插入，在这里GtACR1-eGFP，是PCR放大，然后结合腺病毒载体，包括CMV促进剂在IN-Fusion克隆反应。CMV（人类巨细胞病毒）促进剂通常用于驱动哺乳动物细胞中转基因的过度表达。eGFP 是一种增强的绿色荧光蛋白，源自维多利亚，激发最大值为 488 nm，最大发射为 507 nm。腺病毒（第5型）是在柏林查里特-大学柏林制药研究所外部生产的，迈克尔·舒普教授。
注意：脱病毒转导被归类为BSL-2安全级工作，法律要求采取适当的安全措施。
5. 功能实验
注：使用倒置荧光显微镜进行记录。通过冷凝器中的红色带通滤波器（630/20 nm）过滤传输灯，以避免 GtACR1 共同激活。
-
配线夹设置
- 将放大器与模拟到数字转换器结合使用。使用数据采集软件记录电流和电压数据（参见材料表）。
注：记录的数据在 10 kHz 时进行数字化，并在 5 kHz 下进行过滤。
- 将放大器与模拟到数字转换器结合使用。使用数据采集软件记录电流和电压数据（参见材料表）。
-
碳纤维设置
- 使用相机通过跟踪光学对比度的变化来检测碳纤维位置和沙康龙长度（碳纤维显示为较暗的结构，覆盖在纹状细胞图案上）。设置的原理图表示形式如图3所示。
注：Sarcomere 长度使用分纹模式功率频谱的快速傅立叶变换 （FFT） 实时计算。
- 使用相机通过跟踪光学对比度的变化来检测碳纤维位置和沙康龙长度（碳纤维显示为较暗的结构，覆盖在纹状细胞图案上）。设置的原理图表示形式如图3所示。
图3：描述碳纤维测量实验设置的方案。（绘制不缩放）。两个碳纤维被连接在一个细胞上，它们的位置由压电定位器控制。起搏器用于电场刺激。多色 LED 耦合到倒置显微镜的出物端口中，用于对象平面上的细胞照明。LED 电源通过专用控制盒控制，通过数字模拟转换器 （DAC） 的数字输出接收数字脉冲。DAC 通过模拟输出与荧光系统接口进行通信。用于蜂窝成像的黑白摄像机（774 像素 x 245 线）连接到计算机，以跟踪 sarcomere 长度和碳纤维弯曲。请点击此处查看此图形的较大版本。
- 时时照明
- 通过外部定制的 LED 控制箱，提供荧光显微镜和光门烟道激活的光，包括三个不同颜色的 LED（460 nm、525 nm、640 nm，参见材料表）。
- 修改控制盒的微控制器和图形用户界面 （GUI） 代码，以便通过数据采集软件协议中生成的外部实时 （TTL） 脉冲控制 LED（参见材料表）。通过数字模拟转换器将 TTL 脉冲传输到 LED 控制盒。
- 驱动 LED 并通过 GUI 选择脉冲数。从 GUI 收到命令后，微控制器将启动新内核的进程。在此过程中，将持续检查来自 GUI 的 TTL 输入以及控制开关集。
- 当 TTL 输入为正时，微控制器将打开 LED，然后继续检查 TTL 输入。TTL 信号返回零后，微控制器将关闭 LED 并减少剩余脉冲数 1。如果控制开关在任何时候为 false 或脉冲数为零，微控制器将停止此过程，直到从 GUI 收到新命令。
- 将 LED 直接耦合到显微镜的后端口中。
- 物体平面的光强度测定
- 使用级千分尺测量照明区域（目标放大倍率 40 倍，A = 0.8 mm2）。
- 使用光功率计（参见材料表）。
- 定义实验的设置：激发波长（525 nm）、目标放大倍率（40 倍）、激励滤波器 （530/20 nm） 或镜像，并在各种 LED 输入电压下读取光功率 [W]。
- 通过将光功率 [W] 除以照明区域 [mm2]（此处：0.8 mm2），计算光强 [W/mm2]。
注： 使用步骤 5.6 中的相应协议测量实际光功率，以检查短光脉冲持续时间为 10 m 达到和长持续时间是否保留设定值（补充图 1）。
- 修补夹实验的准备
- 准备以下外部和内部解决方案（表 4;关于水需求，请参见表 1）。
- 将葡萄糖的渗透度调整到300~5毫摩尔/L.Aliquot的内部溶液，并储存在-20°C。
注：在录制当天将内部解决方案保存在冰上。将外部溶液保持在室温下。这里描述的贴片夹溶液是基于以前使用的解决方案和Cl浓度改为较低，更多的生理水平7。对于相关光遗传学执行器离子选择性的表征，我们建议改变细胞外和细胞内溶液19中主要离子（如Cl-、Na+、K+、H+）的浓度。 - 从移液器支架上取下记录电极，用非常细的砂纸从银丝中取出氯化银层。
注：在每个测量日的开头执行此步骤。 - 将导线连接到 1.5 V 蓄电池的正极，并浸入 3 M KCl 溶液中，用于镀银 10 分钟。
注：负极连接到浸没在 3 M KCl 溶液中的参考银丝。 - 准备测量室：将硅润滑脂放在测量室的机架上，并在造型室密封的机架顶部放置盖玻片（直径：50 mm，厚度为 0）。
- 将参考银/氯化银颗粒电极放入浴缸中，并将其与头级连接。
- 用微移液器拉拔1.7 - 2.5 MΩ贴片移液器（外径：1.55毫米，内径：1.15毫米）与微移液器拉拔器（参见材料表）。
- 启动数据采集软件并调整膜测试（脉冲 10 mV，15 ms，基线 0 mV）。
| 外部沐浴解决方案 | 内部移液器解决方案 | |
| NaCl [mM] | 140 | - |
| KCl [mM] | 5.4 | 11 |
| CaCl2 [mM] | 1 | - |
| MgCl2 [mM] | 2 | 2 |
| 葡萄糖 [mM] | 10 | - |
| HEPES [mM] | 10 | 10 |
| K-阿斯巴酯 [mM] | - | 119 |
| Mg-ATP [mM] | - | 3 |
| EGTA [mM] | - | 10 |
| Ph | 7.4 （南欧） | 7.2 （KOH） |
| 肌醇性（用葡萄糖调节） [肌醇/L] | 300 × 5 | 300 × 5 |
表 4：贴片夹紧解决方案。
- 贴片夹测量协议
- 在 V 夹钳模式下记录照片激活协议，保持电位为 -74 mV。使用 300 毫秒的光脉冲。
注：我们建议在培养CM的静膜电位附近进行V夹板录音（在I型夹中建立;在我们手中，在-79 mV和-77 mV之间，用于转导和非转导CM19）。新鲜分离的细胞显示平均静膜电位为-79 mV（补充图2，液体结电位校正后的所有值）。 - 在 0 pA 处将 AP 记录在 I 夹模式。
- 对于电起搏，将电流脉冲喷射 10 ms（从 0 pA 到 10 ms 内的设定值），0.25 Hz 并找到引出 AP 的阈值。
- 对于光学起搏，使用 10 ms 的光脉冲，在最小光强度下 0.25 Hz 以引出可靠的 AP。
- 在 0 pA 时在 I 夹模式中记录照片抑制。引出 AP 如步骤 5.6.2.1 中所述，在 15 次电气触发 AP 后，在 4 mW/mm2下对 64 s 应用持续光。
注：图 6F显示了在持续光下应用更高电流喷射的光抑制协议。从阈值的 1.5 倍（此处： 0.7 nA）开始，注入电流以 0.1 nA（最终电平：2.2 nA）的步骤增加。在所有测试的电流振幅中，持续光应用抑制了 AP 生成。- 作为一项控制实验，暂停64s的电刺激，无需轻应用。
- 在 V 夹钳模式下记录照片激活协议，保持电位为 -74 mV。使用 300 毫秒的光脉冲。
- 贴片夹实验
注：在黑暗中执行以下实验（红灯可用于蓝色/绿色光激活工具）。- 将带细胞的盖玻片放在具有外部溶液的测量室中，并选择荧光 CM。
注：可以使用蓝色 LED （460 nm） 与带通激励滤波器 （450 nm - 490 nm）、510 nm 二色镜和 515 nm 长通发射滤光片组合检测 eGFP 阳性电池。如果使用其他荧光标签，请使用相应的 LED 和荧光过滤器集。如果达到高转导效率（在我们手中，使用GtACR1腺病毒达到>99%），则无需在功能实验之前检查 eGFP 荧光;这样可以避免潜在的 GtACR1 预激活。 - 使用内部解决方案填充贴片移液器。确保尖端没有气泡。
- 将移液器连接到移液器支架上，将记录的氯化银涂层银丝插入内部溶液中。
- 达到单元连接配置后，在保持电位为-74 mV的数据采集软件中切换到全单元模式。通过轻轻施加负压来接触全细胞配置，使膜破裂。这一点通过立即增加测量的电容表示。
- 运行第 5.6 节中介绍的协议。
- 将带细胞的盖玻片放在具有外部溶液的测量室中，并选择荧光 CM。
- 碳纤维技术
- 生产碳纤维。
- 使用玻璃毛细血管具有以下参数：外径：2.0毫米，内径：1.16毫米，长度：100毫米（见材料表）。使用微移液拉拔器，将玻璃毛细管拉入两个长度相同的移液器（总细长 ±11 mm，图 5），最终内径为 ±30 μm。
注：用于第一次和第二次拉拔的设置分别为 85.2%（与拉拔器的最大输出成比例）和 49.0%（取决于拉拔器、灯丝的类型和年龄）。 - 使用 12 V、24 A 的设置，使用自制的微型锻造将移液器弯曲至 45°（有关移液器弯曲设置的详细信息，请参阅图 4）。
- 在方向圈 （5） 中对齐红线上的毛细管 （2），保持毛细管常数的定位，以便在方向圆中心（半径为 4.5 mm）后，折弯零件的长度始终相同。
- 通过用弯管 （3） 向下推毛细管的尖端，并通过加热细丝 （4） 来弯曲毛细管高达 45°（绿线），直到毛细管在除掉弯管后捕获 45° 角。
- 在立体显微镜下，将碳纤维（由让-伊夫·勒盖内克教授提供）放入玻璃毛细管的细尖中。使用末端带有软管的细钳子来增加抓地力，降低损坏纤维的风险。
注：这些纤维的特点是微观结构，增加纤维和细胞之间的接触面，从而提高粘附性20。 - 将碳纤维切割为 2 mm，并使用超级胶水（氰丙烯酸酯）将纤维固定到毛细管的前部。
注：纤维的时间越长，在施加相同力时弯曲的越多。
- 使用玻璃毛细血管具有以下参数：外径：2.0毫米，内径：1.16毫米，长度：100毫米（见材料表）。使用微移液拉拔器，将玻璃毛细管拉入两个长度相同的移液器（总细长 ±11 mm，图 5），最终内径为 ±30 μm。
- 校准碳纤维。
- 使用灵敏度为 0.05 mN/V 且力范围为 0 - 0.5 mN 的力传感器校准碳纤维（参见材料表）。
注： 此设置是定制的，目的是测量压缩而不是"拉" - 将毛细管与碳纤维连接到由微操纵器和压电电机控制的支架上。
- 将光纤尖端与力传感器接触，但不产生任何力，以 10 μm（总运动 60 μm）的步数向传感器移动压电电机，并在伏特中读取测量电压（E）。
注：确保通过碳纤维自由端的尖端接触力传感器。 - 重复这些测量三次。
- 使用公式 1 计算每个压电位置的力（= 压
电电机步长之间测量电压差）：
注：力传感器的灵敏度取决于传感器的型号（此处：0.05 mN/V = 50 μN/V）。增益可以在控制器处设置。 - 将力 [N] 绘制到压电位置。斜率对应于光纤刚度 [μN/μm]。
- 使用灵敏度为 0.05 mN/V 且力范围为 0 - 0.5 mN 的力传感器校准碳纤维（参见材料表）。
- 记录签约 CM 的力。
注：在黑暗中执行以下实验（红灯可用于蓝色/绿灯激活工具）。- 用聚HEMA涂抹测量室的表面。在测量室中填充外部沐浴溶液，并在造型室中滴几滴培养细胞悬浮液（步骤 4.9）。
- 将毛细血管与碳纤维连接到舞台微机械手。通过检查通过应用短绿光脉冲诱导收缩的能力，选择 GtACR1 表示 CM。将碳纤维几乎水平地与测量室表面对齐。
- 将第一根纤维降低到细胞表面。将第二根光纤平行连接到 CM 另一端的第一根光纤。理想对齐方式接近垂直于细胞轴。
注：通过将电池轻轻推到底部表面来连接光纤。在连接第二根光纤之前释放压力。不要通过连接第二根光纤来拉伸细胞。 - 将两根纤维附在电池上后，抬起纤维，使电池不再与腔室表面接触，并且能够在没有任何摩擦的情况下收缩。
- 聚焦数据采集软件中的 sarcomere（参见材料表），并在光纤之间设置 sarcomere 长度跟踪窗口（图 7AI （3）。
注： 生成的 FFT 功率频谱 （图 7AI （2）） 理想情况下显示一个尖峰，表示平均 sarcomere 长度。 - 使用边缘检测模块跟踪光纤弯曲。使用红色和绿色窗口设置检测区域，并在光强跟踪的第一个导数上定义阈值（红色和绿色水平线）（图 7A III）。
- 开始在 0.25 Hz（如果可能，尝试更快的起搏速率）以光学速度调整细胞的速度，并跟踪 sarcomere 长度和光纤弯曲。
注：光纤支架位置、LED触发器和电刺激脉冲通过数据采集软件进行控制（参见材料表）。 - 在记录至少15个光学诱导收缩后，以电方式对细胞进行场刺激（参见材料表）。通过应用阈值电压的 1.5 倍，查找引出收缩和记录的阈值。
- 对于抑制协议，应用电刺激诱导收缩，然后暴露在64s的持续光（在各种光强度下）。
- 生产碳纤维。
电电机步长之间测量电压差）：
图 4：移液器弯曲设置。（1） 左侧的微操纵器用于控制毛细管的位置，右侧的第二个微操纵器用于弯曲毛细管。（2） 毛细管。（3） 本德。（4） 微型锻造。（5） 方向圆。请点击此处查看此图形的较大版本。
图5：用碳纤维移液器。请点击此处查看此图形的较大版本。
6. 数据分析
-
补丁夹式录制
注：在实验后，校正液体结电位的所有记录并命令电压。使用工具结电位计算器（对于表 4中所述的配线夹式解决方案，在 21°C 下），确定数据采集软件中的液体结位电位。从记录/命令电压中减去液体结电位。- 对于 I 夹紧 AP 录像，检查电气起搏与光学起搏。使用自定义编写的脚本（补充材料）在 20% 和 90% 重极化时计算 AP 持续时间 （APD）。确定静止膜电位和 AP 振幅。
注： 确定 APD，如 Wang K. 等人21所述加载 .abf 文件的脚本通常可以通过以下链接访问：https://de.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/22114-fcollman-abfload。至少 6 个 AP 的平均 APD 值。 - 对于 V 夹照片激活，检查基线是否位于 0 pA。如果不将基线调整为零。分析在 -74 mV 时由 300 ms 光脉冲触发的记录电流。将数据传输到数据分析软件，并确定峰值和平均固定电流。
- 对于 I 夹紧 AP 录像，检查电气起搏与光学起搏。使用自定义编写的脚本（补充材料）在 20% 和 90% 重极化时计算 AP 持续时间 （APD）。确定静止膜电位和 AP 振幅。
-
碳纤维实验
- 光学起搏过程中的收缩记录：在数据采集软件中加载记录的数据，并读取碳纤维弯曲和沙康长度变化的基线和最大值。
注：稳定记录 10 次收缩的平均值。 - 测量单元格宽度并计算假设椭圆横截面的单元格的横截面面积（图 7B II）。
注： 椭圆区域的公式为 A = _a_b （公式 2），其中 a 是从中心到顶点的距离，b 是从中心到协顶点的距离。在我们的例子中，这意味着 a = （单元格的宽度）/2 和 b = （单元格的厚度）/2。根据西村等人22，CM的厚度可以估计是细胞宽度的三分之一，因此A = |（1/2）*宽度*（1/2）[厚度]（1/4）*宽度*（1/3）[宽度]（1/12）*宽度2。 - 计算端收缩力 （F）：
- 计算端收缩细胞变形 （ESD）：
注：可分析进一步收缩参数：休息沙康米长度、时间达到峰值、放松时间至 90%，小片沙康缩短、最大收缩速度和松弛速度（参见软件采集手册）。
- 光学起搏过程中的收缩记录：在数据采集软件中加载记录的数据，并读取碳纤维弯曲和沙康长度变化的基线和最大值。
Representative Results
GtACR1-eGFP以培养兔CM（图6插入）表示，光电流用贴片夹技术测量。GtACR1 的光活化显示在 -74 mV 处的大向导电流。在图 6中，4 mW/mm2处的峰值电流 （IP） 为 245 pA。AP的电（图6B）或光学（图6C）分别触发电流喷射1.5倍的阈值，或短的去极化光脉冲为10 ms。分析 APD 值， 电气步速 CM 显示 APD 20 的 0.24 ± 0.08 s 和 APD 90 的 0.75 ± 0.17 s， 而光学定速 CM 显示 APD 20 0.31 × 0.08 s 和 APD 90 0.81 ± 0.19 s （SE， n = 5， N = 2， 此处介绍的示例 A 20电气= 0.17 s;APD 20光学= 0.27 s 和 APD 90电气= 0.61 s;APD 90光学= 0.68 s;图 6D。光学步速 CM 显示较慢的 AP 开始（图 6D）。CM激活在持续照明时（64 s，4 mW/mm2）通过极化膜电位对氯化物的反转电位，在这里 -58 mV（图6E）抑制。高于阈值 1.5 倍的电流注入不会引出 AP 生成（图 6F）。产生的峰值力由碳纤维弯曲（图7B，C，E）确定。CM在电气起搏（图7B）和261 μN/mm 2后，在光起搏（图7C）下生成232μN/mm2。长时间的绿灯脉冲抑制收缩（图7E）。在64 s的光学抑制下，复发的收缩产生较低的收缩力，在 ±10 收缩（以 0.25 Hz，图 7D）与兔子 CM 的舒张钙损失保持一致后，强制值向基线恢复。
图 6：电气和光学步速/抑制 CM 的代表性贴片夹式记录。（A） 代表光电流在 -74 mV 下使用光脉冲 300 m，4 mW/mm2。IP指示峰值电流。插入显示 GtACR1-eGFP 正极电池。（B） 代表 AP 记录在 0 pA 使用电流斜坡 10 ms， 0.6 nA 电步 CM. （C） 代表 AP 记录在 0 pA 使用光脉冲 10 ms， 0.4 mW/mm2.（D） 上图显示了电气（蓝色）和光学（绿色）激活的 CM 的第 10个AP 的叠加。 AP 由膜电位的最大变化（dV/dt max）对齐。下图显示了光学和电气触发 AP（E光学-E电气） 之间的膜电位差异。（E） 电动触发 AP 在持续光 64 s、 4 mW/mm2下被抑制.（F） AP 在持续光下受到高于阈值（从 0.7 nA（步数为 0.1 nA 到 2.2 nA）的电流喷射抑制。请点击此处查看此图形的较大版本。
图7：来自光学和电气步速/抑制CM的碳纤维记录的代表性数据。（A） 在数据采集软件中显示。图像 （I） 显示测量的 CM 与用于计算 sarcomere 长度的窗口。单元格宽度以橙色标记。（1） 相关频率范围。（2） FFT 功率谱显示电池上沙康雷间距的频率。平均sarcomere长度是根据峰值频率计算的。（3） 萨科雷长度跟踪窗口。（4） 强度跟踪。（5） 强度曲线乘以哈明窗口是窗口强度跟踪。方案 （II） 显示单元格的椭圆横截面。橙色宽度，蓝色厚度。图像 （III） 显示了碳纤维的位置，其检测箱为红色，右侧为绿色。（6） 强度跟踪。（7） 强度跟踪的第一个导数（参见数据采集软件手册）。（B） 电引收缩的代表性痕迹。面板 （I） 显示两个碳纤维之间的距离，面板（II）显示沙康长缩短。（C） 光学引出收缩的代表性痕迹（525 nm、0.25 Hz、10 ms、6 mW/mm2）。面板 （I） 显示两个碳纤维之间的距离，面板（II）显示沙康长缩短。（D） 在因抑制 AP 生成而暂停后，产生从收缩 1 到 11 的峰值力。（E） 在持续照明下，光学抑制收缩的代表性痕迹（525 nm、64 s、6 mW/mm2）。面板 （I） 显示两个碳纤维之间的板长度缩短，面板 （II） 长度。请点击此处查看此图形的较大版本。
| A | 地区 |
| Acr | 安尼恩通道多普辛 |
| 美联社 | 行动潜力 |
| Apd | 动作潜在持续时间 |
| CFU | 菌落形成单元 |
| ChR | 通道多普辛 |
| 厘米 | 心肌 |
| eGFP | 增强型绿色荧光蛋白 |
| Esd | 端收缩细胞变形 |
| 欧盟 | 内毒素装置 |
| F | 力 |
| Fft | 快速富里尔变换 |
| GtACR | 吉拉尔迪亚·阿伊恩·通道多普辛 |
| Gui | 图形用户界面 |
| I 夹 | 电流夹 |
| IU | 国际单位 |
| 莫伊 | 多种感染 |
| 多赫马 | 聚（2-羟基苯甲酸酯） |
| V 型夹 | 电压夹 |
表 5：缩写列表。
补充图1：光功率计的光强度测量。（A） 测量 10 ms 光脉冲在 4 mW/mm2。（B） 测量在 4 mW/mm2下持续照明 64 s .请点击此处查看此图形的较大版本。
补充图2：新隔离的CM特性及其在培养中的结构适应。（A） AP 记录新隔离的 CM（APD 20 的 1.11 ± 0.34 s，APD 90 的 1.96 = 0.32 s，n = 7，N = 2）。平均静膜电位为-79.3 ± 0.8 mV（n = 7，N = 2）。（B） 碳纤维记录电步新分离的 CM. 平均峰值力为 205 ± 78 μN/mm2 （n = 7， N = 2）。（C） 新隔离的 CM （I） 的共聚焦图像;在培养48小时后，未转导（II）和转导（III）CM。请点击此处查看此图形的较大版本。
补充材料：MatLab 脚本，以确定 APD 和静膜电位。请点击此处下载此文件。
Discussion
光遗传学工具能够以非侵入性的方式调制兴奋细胞电生理学，但它们需要对不同细胞类型（例如CM）进行彻底的表征，以便为特定的实验设计选择最佳可用的工具。贴片夹技术是评估细胞电生理学的标准方法。在全细胞配置中，它允许记录等离子膜的光激活电流，或在光刺激/抑制后膜电压的时间变化。电激发的光遗传学操作也影响CM收缩。我们使用 sarcomere 跟踪和碳纤维辅助力测量来量化光学询问对肌细胞机械活性的影响。
我们描述了一种协议，用于描述CM中光门氯化通道GtACR1的基本效果。作为模型系统，我们选择兔子CM，因为他们的电生理特性（如AP形状和耐火期）比啮齿动物CM更接近于人类CM。此外，兔子CM可以培养几天，足够长的时间进行腺病毒的输送和GtACR1-eGFP的表达。值得注意的是，分离的CM会随时间而改变其在培养中的结构特性，包括细胞末梢的四舍五入和交叉分界逐渐丧失、T型管状系统和23、24号。为此，在培养的CM中报告了功能变化：休息膜电位去极化、AP延长和细胞Ca2+处理的变化。有关文化中细胞适应的回顾，请参阅 Louch 等人25。补充图 2显示了新隔离 CM 的模范 AP 和收缩测量值，以便与培养 CM 中观察到的 CM（图 6，图 7）中使用此处介绍的协议进行比较。
全细胞贴片夹片可直接测量光电流特性（例如，振幅和动力学）以及高时分辨率下膜电位或AP特性的光引起的变化。然而，这种记录有几个局限性：首先，细胞素被全细胞录音中的移液溶液所取代，这有利于控制离子电化学梯度，但具有洗出细胞细胞器、蛋白质和其他化合物的内在缺点，从而可能影响细胞电反应。其次，由于我们的方法只允许检测APD的变化，但无法直接测量与电生理相关的细胞舱中的离子浓度，因此难以评估非生理上长时间去极化（例如，光门离子通道的慢时间常数）引起的附加离子通道的激活。这可以通过荧光指示灯（例如 Ca2+传感器）或电子选择性电极来完成。进一步的表征可能包括光强度定位、确定pH依赖性、不同膜电位的光电流动力学以及重复光刺激期间的恢复动力学。
与贴片夹记录不同，单细胞力测量能够分析完整肌细胞的细胞收缩，而不会影响其细胞内环境。通过确定产生的力振幅和动力学（例如，收缩和放松的最大速度;此处不分析），可以间接评估对里昂浓度的次生影响（例如，Ca2+）。使用碳纤维技术进行力测量比自由收缩的细胞具有优势，因为它们提供有关预加载单元中的被动力和有源力的直接信息（即，在与原位或体内设置更相似的条件下）。机械预加载在分析细胞收缩性时尤其重要，因为拉伸会影响力生产和放松26、27。
光遗传学方法允许在单 CM 和完整的心脏组织中对细胞膜电位进行精确操作。传统上，ChR2是一种光门阳离子非选择性通道，用于膜电位的去极化，而光驱动质子和/或氯化物泵用于膜超极化。两组光遗传学执行器都需要高表达水平，因为 ChR2 的特点是具有本质上的低单通道电导28和光驱动泵，每吸收光子最大地传输一个电子。此外，在CM中长期激活ChR2可能导致Na+和/或Ca2+过载，光驱动泵可能改变跨sarmalH+或Cl-梯度29，30。为了寻找替代工具来控制CM活性，我们最近测试了天然的离子通道RhodopsinGtACR1，其特点是具有卓越的单通道传导和更高的光灵敏度，比阳型ChR（如ChR2）。我们发现，GtACR1 激活脱极化 CM，可用于光学起搏和抑制，具体取决于光脉冲正时和持续时间。与 Na+相比，使用 ACR 代替阳极 ChR 的另一个优点可能是 Cl的负反转电位更大，从而减少了人为引入的离子电流。正如我们之前所显示的，使用 GtACR1 的光学起搏可能导致由于 GtACR1 通道闭合的缓慢分量而导致 AP 延长，通过使用更快的 GtACR1 突变体19可以克服这一点。然而，AP延长在使用较低、更生理的细胞内Cl-浓度时就不那么明显了（见图6）。此外，GtACR1通过长时间照明介导的抑制会导致深度膜去极化，这再次可能激活二次Na+和Ca2+流入，从而改变电压门通道的活性。在我们的测量中，我们发现AP和收缩参数在光诱导抑制1分钟后恢复到基线（参见Kopton等人2018年图6，图7）。光门K+通道为沉默CM提供了一种有效的替代方案，而不影响CM静膜电位31。
将来，我们希望定量地比较不同的光遗传学工具，以寻找它们抑制心脏活动的潜力。为此，我们测试各种光门电道，包括ACR，ChR2和红移ChR变种32，以及超极化执行器，如卤素多辛或光门腺环酶bPAC结合钾通道SthK（PAC-K）31。
此处提出的协议可用于对CM的机电特性进行深入表征。它主要也适用于其他物种的CM，以及从患病心肌分离的CM。光学刺激允许一个人以不同的频率对CM进行步速调整，在碳纤维收缩实验中可以测试不同的预载量。一个有趣的实验是使用低强度照明进行亚阈值去极化，模拟静膜电位的逐渐增加，正如在疾病进展期间心脏组织重塑过程中观察到的。最后，功能测量可以与Ca2+成像相结合，以进一步深入了解激励-收缩耦合，或与药理学干预，以评估不同药物对CM活性的影响。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢斯特凡妮·佩雷斯-费利兹的出色技术援助， Jonas Wietek博士（德国柏林洪堡大学）为提供pUC57-GtACR1质粒，迈克尔·舒普博士（查理特-柏林大学，柏林联邦药学院）为腺病毒生产提供，阿纳斯塔西娅·霍赫洛娃博士（乌拉尔联邦大学）分享她的专业知识，以改善细胞分离协议，并重新设计管状装置。该项目由德国研究基金会资助（SPP1926：SCHN 1486/1-1;艾美-诺瑟奖学金：SCHN1486/2-1）和ERC高级助学金CardioNECT。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment - Cell isolation/Culturing/Transduction | |||
| Adeno-X Adenoviral System 3 CMV | TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, California, USA | ||
| Aortic cannula | Radnoti | 4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L mm | |
| Coverslips ø 16 mm, Thickness No. 0 | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 631-0151 | Borosilicate Glass |
| Griffin Silk, Black, 2 m Length, Size 3, 0.5 mm | Samuel Findings, London, UK | TSGBL3 | |
| Incubator | New Brunswick, Eppendorf, Schönenbuch, Switzerland | Galaxy 170S | |
| Langendorff-perfusion set-up | Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbläserei, Freiburg, Germany | Custom-made | |
| Langendorff-pump | Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Zürich, Switzerland | ISM444 | |
| Mesh: Nylon Monodur filter cloth | Cadisch Precision Meshes Ltd | 800 µm holes, 1 m wide | |
| Neubauer chamber | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 717806 | |
| Rabbit, New Zealand White | Charles River | Strain Code: 052 | |
| Scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BC774R | Bauchdeckenschere ger. 18cm |
| Sterile filter, 0.22 µm | Merck, Darmstadt, Germany | SLGP033RB | |
| Equipment - Patch-clamp | |||
| Amplfier | AxonInstruments, Union City, CA, United States | Axopatch 200B | |
| Coverslip ø 50 mm, Thickness No. 1 | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 631-0178 | Borosilicate Glass |
| Digitizer Axon Digidata | Molecular Devices, San José, CA, United States | 1550A | |
| Filter (530/20) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513878 | BZ:00 |
| Filter (630/20) | Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States | 227155 | |
| Headstage | AxonInstruments, Union City, CA, United States | CV203BU | |
| Interface | Scientifica, Uckfield, UK | 1U Rack, 352036 | |
| LED 525 nm | Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States | PT-120-G | |
| LED control software | Essel Research and Development, Toronto, Canada | ||
| LED control system | custom-made | ||
| Micropipette Puller | Narishige Co., Tokyo, Japan | PP-830 | |
| Microscope inverted | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI4000B | |
| Motorised Micromanipulator | Scientifica, Uckfield, UK | PatchStar | |
| Optical power meter | Thorlabs, Newton, NJ, United States | PM100D | |
| Silicone Grease | RS Components, Corby, UK | 494-124 | |
| Silver wire | A-M Systems, Sequim, WA, United States | 787500 | Silver, Bare 0.015'', Coated 0.0190'', Length 25 Feet |
| Soda lime glass capillaries | Vitrex Medical A/S, Vasekaer, Denmark | 160213 BRIS, ISO12772 | 1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm |
| Software Axon pClamp | Molecular Devices, San José, CA, United States | Version 10.5 | |
| Software MatLab2017 | The MathWorks, Inc. | ||
| Stage micrometer | Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK | 1 mm | |
| Equipment - Carbon fiber | |||
| Carbon fibers | provided from Prof. Jean-Yves Le Guennec | BZ:00 | |
| Digitizer Axon Digidata | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, United States | 1550B | |
| Filter (530/20) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513878 | |
| Filter (630/20) | Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States | 227155 | |
| Fluorescence System Interface | IonOptix, Milton, MA United States | FSI-800 | 2.0 OD x 1.16 ID x 100 L mm |
| Force Transducer System | Aurora Scientific Inc., Ontario, Canada | 406A | |
| Glass capillaries for force measurements | Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, United States | GC200F-10 | |
| Interface National Instruments | National Instruments, Budapest, Hungary | BNC-2110 | |
| LED 525 nm | Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States | PT-120-G | |
| LED control box | Essel Research and Development, Toronto, Canada | ||
| LED control system | custom-made | ||
| Microcontroller | Parallax Inc., Rocklin, California, United States | Propeller | |
| Micropipette Puller | Narishige Co., Tokyo, Japan | PC-10 | |
| Microscope inverted | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI4000B | |
| MyoCam-S camera | IonOptix, Dublin, Ireland | ||
| MyoCam-S camera Power | IonOptix, Milton, MA, United States | MCS-100 | |
| MyoPacer Field Stimulator | IonOptix Cooperation, Milton, MA, United States | MYP100 | |
| Piezo Motor | Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | E-501.00 | |
| Silicone Grease | RS Components, Corby, UK | 494-124 | |
| Software Axon pClamp | Molecular Devices, San José, CA, United States | Version 10.5 | |
| Software IonWizard | IonOptix, Dublin, Ireland | Version 6.6.10.125 | |
| Software MatLab2017 | The MathWorks, Inc. | ||
| Stage micrometer | Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK | 1 mm | |
| Chemicals | |||
| Adenosine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A9251-100G | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A7030-50G | |
| CaCl2 | Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA | 21114-1L | |
| L-Carnitine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C9500-25G | |
| Collagenase type 2, 315 U/mg | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS004177 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C0780-50G | |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C1768-100MG | |
| EGTA | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 3054.3 | |
| Esketamine hydrochloride, Ketanest S 25 mg/mL | Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlin, Germany | PZN-07829486 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | F9665 | |
| Gentamycin 50 mg/mL | Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA | 15750-037 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | G7021-1KG | |
| Heparin-Sodium, 5,000 IU/mL | Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | PZN-03029843 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | H3375-1KG | |
| Insulin (bovine pancreas) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | I6634-50MG | |
| K-aspartate | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A6558-25G | |
| KCl | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 26764.260 | 1 mg/mL |
| KOH | Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA | 35113-1L | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | L2020-1MG | |
| M199-Medium | Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, United States | M4530 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A9187-1G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 63069-500ML | |
| NaCl | Fisher Scientific, Loughborough, Leics., UK | 10428420 | |
| NaCl-Solution 0.9%, Isotone Kochsalz-Lösung 0.9% | Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 3200950 | |
| NaOH | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A6579 | without Ca2+/Mg2+ |
| Na-pyruvat | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | P2256-100MG | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | D1408-500ML | |
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma, Poole, UK | 192066 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | P5147-1G | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | T0625-500G | |
| Thiopental Inresa 0.5 g | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | PZN-11852249 | |
| Xylazine hydrochloride, Rompun 2% | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | PZN-01320422 |
References
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