Presentiamo un protocollo per valutare gli effetti elettromeccanici dell’attivazione di GtACR1 nei cardiomiociti del coniglio. Forniamo informazioni dettagliate sull’isolamento cellulare, la coltura e la trasduzione adenovirale, e sugli esperimenti funzionali con le tecniche patch-clamp e fibra di carbonio.
Negli ultimi due decenni, sono stati istituiti strumenti optogenetici come potenti mezzi per modulare l’attività specifica di tipo cellulare nei tessuti eccitabili, compreso il cuore. Mentre la Channelrhodopsin-2 (ChR2) è uno strumento comune per depolarizzare il potenziale della membrana nei cardiomiociti (CM), potenzialmente suscitando potenziali di azione (AP), uno strumento efficace per un silenziamento affidabile dell’attività CM è mancato. È stato suggerito di utilizzare le channelrhodopsins di anion (ACR) per l’inibizione optogenetica. Qui, descriviamo un protocollo per valutare gli effetti dell’attivazione dell’ACR GtACR1 naturale da Guillardia theta in CM coniglio coltivato. Il protocollo include l’isolamento CM dal cuore di coniglio, la semina e la coltura delle cellule per un massimo di 4 giorni, la trasduzione tramite codifica adenovirus per il canale cloruro illuminato, la preparazione di patch-clamp e configurazioni in fibra di carbonio, la raccolta e l’analisi dei dati. L’utilizzo della tecnica patch-clamp nella configurazione a celle intere consente di registrare le correnti attivate dalla luce (in modalità morso di tensione, V-clamp) e AP (modalità di morsetto di corrente, I-clamp) in tempo reale. Oltre agli esperimenti di patch-clamp, conduciamo misurazioni di contrattilità per la valutazione funzionale dell’attività CM senza disturbare l’ambiente intracellulare. Per fare ciò, le cellule vengono precaricate meccanicamente utilizzando fibre di carbonio e le contrazioni vengono registrate monitorando i cambiamenti nella lunghezza del sarcomere e nella distanza della fibra di carbonio. L’analisi dei dati include la valutazione della durata degli AP dalle registrazioni i-clamp, le correnti di picco dalle registrazioni dei morsetti a V e il calcolo della forza dalle misurazioni della fibra di carbonio. Il protocollo descritto può essere applicato alla sperimentazione degli effetti biofisici di diversi attuatori optogenetici sull’attività della CM, un prerequisito per lo sviluppo di una comprensione meccanicistica degli esperimenti optogenetici nel tessuto cardiaco e nei cuori interi.
Le fotocorrenti mediate da ChR sono state registrate per la prima volta nell’oculare delle alghe verdi unicellulari1,2. Poco dopo la clonazione genetica e l’espressione eteologa di Chlamydomonas reinhardtii ChR1 e ChR2, ChR sono stati utilizzati come strumenti per alterare il potenziale della membrana negli ovociti Xenopus e nelle cellule dei mammiferi dalla luce3,4. Cation CR non-selettivo depolarizzare la membrana delle cellule con un potenziale di membrana a riposo che è negativo per il potenziale di inversione di ChR. Essi possono quindi essere utilizzati per suscitare AP in cellule eccitabili, compresi neuroni e CM, permettendo ritmo ottico5,6.
Complementare alla cation ChR, protone leggero, cloruro e pompe di sodio7,8,9 sono stati utilizzati per inibire l’attività neuronale10,11,12. Tuttavia, questi ultimi hanno limitazioni, che richiedono un’elevata intensità luminosa e un’illuminazione sostenuta, poiché uno ione viene trasportato per fotone assorbito. Nel 2014, due studi indipendenti di Wietek et al. Un anno dopo, ACR naturale sono stati scoperti nel cryptophyte Guillardia theta (GtACR)15. Poiché l’ACR ingegnerizzato ha mostrato una conduttanza residua, sono stati sostituiti da ACR naturale, caratterizzato da una grande conduttanza a canale singolo e ad alta sensibilità alla luce15. I GtACR sono stati utilizzati per silenziare l’attività neuronale polarizzando il potenziale della membrana verso il potenziale di inversione del cloruro16,17. Govorunova et al. applicato GtACR1 a massa CM ventricolare di ratto coltivato e ha mostrato una fotoinibizione efficiente a bassi livelli di intensità luminosa che non erano sufficienti per attivare gli strumenti di inibizione precedentemente disponibili, come la pompa protone Arch18. Il nostro gruppo ha recentemente riferito che la fotoinibizione mediata da GtACR1 di CM si basa sulla depolarizzazione e che GtACR1 può anche essere utilizzato, quindi, per il ritmo ottico di CM19.
Qui presentiamo un protocollo per studiare gli effetti elettrofisiologici e meccanici della fotoattivazione GtACR1 sul cm ventricolare del coniglio coltivato. Descriviamo prima l’isolamento cellulare, la coltura e la trasduzione. Gli effetti elettrofisiologici sono misurati utilizzando registrazioni di morsetti a tutta cellula. Le correnti mediate dalla luce in una determinata tensione della membrana sono valutate in modalità morsetto a V. Le dinamiche potenziali della membrana vengono misurate durante la stimolazione elettrica o ottica di CM (modalità I-clamp). L’inibizione ottica dell’AP attivato elettricamente viene testata mediante un’applicazione di luce sostenuta. Gli effetti meccanici sono misurati utilizzando fibre di carbonio in combinazione con il tracciamento basato sull’imaging della lunghezza del sarcomere. Per farlo, le cellule otticamente misurabili vengono precaricate meccanicamente collegando due fibre di carbonio alla membrana plasmatica vicino alle estremità cellulari opposte. I cambiamenti di lunghezza di Sarcomere vengono registrati durante il ritmo ottico o elettrico. Infine, la fotoinibizione viene misurata durante la stimolazione del campo elettrico delle cellule e le forze generate vengono analizzate.
Il protocollo include i seguenti passaggi illustrati nel diagramma di flusso nella Figura 1: anestesia profonda del coniglio, iniezione di sovradosaggio tiopentale, escissione cardiaca, perfusione Langendorff e digestione dei tessuti, dissociazione meccanica del tessuto per rilasciare le cellule, analisi microscopica della resa CM, coltura di CM, trasduzione con adenovirus di tipo 5, seguita da incubazione e esperimenti funzionali.
Figura 1: Diagramma di flusso del protocollo utilizzato per ottenere CM elettricamente e otticamente utilizzabile. I cuori vengono astenuti dai conigli di 9-10 settimane di età e il tessuto cardiaco viene digerito mentre viene perfuso utilizzando una configurazione Langendorff. Le cellule vengono rilasciate per agitazione meccanica. La resa CM viene conteggiata al microscopio. I CM sono coltivati, trasdotti con adenovirus di tipo 5 e gli esperimenti funzionali vengono eseguiti 48-72 ore dopo la trasduzione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Mentre gli strumenti optogenetici consentono la modulazione dell’elettrofisiologia delle cellule eccitabili in modo non invasivo, hanno bisogno di una caratterizzazione completa in diversi tipi di cellule (ad esempio, CM) per consentire di scegliere il miglior strumento disponibile per un progetto sperimentale specifico. La tecnica patch-clamp è un metodo standard per valutare l’elettrofisiologia cellulare. Nella configurazione dell’intera cellula, permette di registrare correnti foto-attivate attraverso la membrana plasmatica o cambiamenti temporali nella tensione della membrana a seguito di stimolazione/inibizione della luce. La manipolazione optogenetica dell’eccitazione elettrica influisce anche sulle contrazioni CM. Utilizziamo il tracciamento dei sarcomeri e le misurazioni della forza assistita da fibra di carbonio per quantificare gli effetti dell’interrogatorio ottico sull’attività meccanica dei miociti.
Descriviamo un protocollo per caratterizzare gli effetti di base di un canale di cloruro protetto, GtACR1, in CM. Come sistema modello, abbiamo scelto il coniglio CM, poiché le loro caratteristiche elettrofisiologiche (ad esempio, la forma AP e il periodo refrattario) assomigliano a quelle osservate nella CM umana più da vicino rispetto al roditore CM. Inoltre, il coniglio CM può essere coltivato per diversi giorni, abbastanza a lungo per la consegna adenovirale e l’espressione di GtACR1-eGFP. In particolare, CM isolato cambiare le loro proprietà strutturali nella coltura nel corso del tempo, tra cui l’arrotondamento delle terminazioni cellulari e la graduale perdita di striatura incrociata, sistema T-tubaree e caveolae23,24. In linea con questo, sono state segnalate alterazioni funzionali nella CM coltivata: depolarizzazione del potenziale della membrana a riposo, prolungamento dell’AP e cambiamenti nella manipolazione cellulare Ca2. Per la revisione degli adattamenti cellulari nella cultura, vedere Louch etal. Figura supplementare 2 Mostra esempi AP e misurazioni di contrazione di CM appena isolato per il confronto con quelli osservati in CM coltivato (Figura 6, Figura 7) utilizzando il protocollo qui presentato.
Le registrazioni dei morsetti a celle intere consentono misurazioni dirette delle proprietà fotocorrenti (ad esempio, ampiezze e cinetiche) e di cambiamenti indotti dalla luce nel potenziale della membrana o nelle caratteristiche di AP ad alta risoluzione temporale. Tuttavia, tali registrazioni hanno diverse limitazioni: in primo luogo, il citosol viene sostituito dalla soluzione pipetta nelle registrazioni intere cellulari, che è vantaggiosa per controllare i gradienti elettrochimici ionici, ma ha lo svantaggio intrinseco di lavare gli organelli cellulari, le proteine e altri composti, influenzando così potenzialmente le risposte elettriche cellulari. In secondo luogo, gli effetti collaterali come l’attivazione di canali ionici aggiuntivi derivanti da depolarizzazione non fisiologicamente lunga (ad esempio, le costanti temporali lente dei canali ionici con porte di luce) sono difficili da valutare in quanto il nostro metodo consente solo di rilevare i cambiamenti nell’APD, ma non di condurre misurazioni dirette delle concentrazioni ioniche nei compartimenti cellulari elettrofisiologicamente rilevanti. Questo potrebbe essere fatto con indicatori fluorescenti (ad esempio, sensori Ca 2 opiù selettivi) o elettrodi ioni-selettivi. Un’ulteriore caratterizzazione può includere titrazioni dell’intensità della luce, determinazione della dipendenza da pH, cinetica fotocorrente a diversi potenziali di membrana e cinetica di recupero durante la stimolazione della luce ripetitiva.
A differenza delle registrazioni patch-clamp, le misurazioni della forza cellulare consentono l’analisi delle contrazioni cellulari di miociti intatti senza influenzare il loro ambiente intracellulare. Gli effetti secondari sulle concentrazioni di ioni (ad es., Ca2 )possono essere valutati indirettamente determinando l’ampiezza e la dinamica della forza generata (ad esempio, la massima velocità di contrazione e rilassamento; qui non analizzata). Le misurazioni della forza con la tecnica della fibra di carbonio hanno un vantaggio rispetto alle cellule che contraggono liberamente in quanto forniscono informazioni dirette sulle forze passive e attive nelle celle precaricate (cioè in condizioni più simili alle impostazioni in situ o in vivo). Il precaricamento meccanico è particolarmente importante quando si analizza la contrattilità cellulare, in quanto stretch colpisce la produzione di forza e il rilassamento26,27.
Gli approcci optogenetici consentono una manipolazione spatiotemporale del potenziale della membrana cellulare, sia nel singolo CM che nel tessuto cardiaco intatto. Classicamente, ChR2, un canale non selettivo di cation alla luce, è stato utilizzato per la depolarizzazione del potenziale della membrana, mentre sono state utilizzate pompe protoniche e/o cloruro guidate dalla luce per l’iperpolarizzazione della membrana. Entrambi i gruppi di attuatori optogenetici richiedono alti livelli di espressione, poiché ChR2 è caratterizzato da una conduttanza a canale singolo intrinsecamente bassa28 e pompe a guida leggera trasportano al massimo uno ione per fotone assorbito. Inoltre, l’attivazione prolungata di ChR2 in CM può portare al sovraccarico diNa e/o Ca2, e le pompe a guida leggera possono cambiare le pendenze trans-sarcolemmalH o Cl– 29,30. Alla ricerca di strumenti alternativi per il controllo optogenetico dell’attività CM, abbiamo recentemente testato la channelrhodopsin GtACR1 ad anione naturale, caratterizzata da una conduttanza a canale singolo superiore e da una maggiore sensibilità alla luce rispetto alla cation ChR come ChR2. Abbiamo scoperto che l’attivazione di GtACR1 depolarizza CM e può essere utilizzata per il ritmo ottico e l’inibizione, a seconda della tempistica e della durata dell’impulso luminoso. Un ulteriore vantaggio dell’utilizzo di ACR al posto di cation ChR potrebbe essere il potenziale di inversione più negativo di Cl– rispetto a Na,riducendo artificialmente le correnti ioniche. Come abbiamo già dimostrato, il ritmo ottico con GtACR1 può portare al prolungamento di AP a causa della componente lenta della chiusura del canale GtACR1, che potrebbe essere superata utilizzando mutanti GtACR1 più veloci19. Tuttavia, il prolungamento di AP è molto meno pronunciato quando si utilizza una concentrazione inferiore, più fisiologica intracellulare Cl(vedere Figura 6). Inoltre, l’inibizione mediata da GtACR1 dall’illuminazione prolungata provoca una profonda depolarizzazione della membrana, che potrebbe nuovamente attivare l’afflusso secondario diNa e Ca2, alterando così l’attività dei canali legati alla tensione. Nelle nostre misurazioni, troviamo che i parametri AP e contrazione recuperano alla linea di base entro 40 s dopo un’inibizione indotta dalla luce per 1 min (vedi Kopton et al. 2018, Figura 6, Figura 7). Icanali Light-gated K offrono una potente alternativa per mettere a tacere cm senza influenzare il potenziale della membrana a riposo CM31.
In futuro vorremmo confrontare quantitativamente diversi strumenti optogenetici per il loro potenziale di inibire l’attività cardiaca. A tal fine, testiamo una varietà di canali ionici con problemi di luce, tra cui ACR, ChR2 e varianti ChR in rosso32, così come attuatori iperpolarizzanti come halorhodopsin o la luce gated adenyl ciclosie bPAC in combinazione con il canale di potassio SthK (PAC-K)31.
Il protocollo qui presentato può essere utilizzato per una caratterizzazione approfondita delle proprietà elettromeccaniche di CM. È principalmente applicabile anche a CM di altre specie, e alla CM isolata dal miocardio malato. La stimolazione ottica consente di ritmo CM a frequenze diverse, e diversi precarichi possono essere testati durante gli esperimenti di contrazione della fibra di carbonio. Un esperimento interessante potrebbe essere quello di utilizzare l’illuminazione a bassa intensità per la depolarizzazione subsoglia, per imitare un graduale aumento del potenziale della membrana a riposo, come si può osservare durante lo sviluppo del rimodellamento del tessuto cardiaco durante la progressione della malattia. Infine, le misurazioni funzionali potrebbero essere combinate con l’imaging Ca2 per ulteriori informazioni sull’accoppiamento eccitazione-contrazione o con interventi farmacologici per valutare gli effetti di diversi farmaci sull’attività CM.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Stefanie Perez-Feliz per l’eccellente assistenza tecnica, Dr. Jonas Wietek (Humboldt-University, Berlino, Germania) per la fornitura del pLAsmide pUC57-GtACR1, il Prof. Il progetto è stato finanziato dalla Fondazione tedesca per la ricerca (SPP1926: SCHN 1486/1-1; Borsa di studio Emmy-Noether: SCHN1486/2-1) e il CER Advanced Grant CardioNECT.
Equipment – Cell isolation/Culturing/Transduction | |||
Adeno-X Adenoviral System 3 CMV | TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, California, USA | ||
Aortic cannula | Radnoti | 4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L mm | |
Coverslips ø 16 mm, Thickness No. 0 | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 631-0151 | Borosilicate Glass |
Griffin Silk, Black, 2 m Length, Size 3, 0.5 mm | Samuel Findings, London, UK | TSGBL3 | |
Incubator | New Brunswick, Eppendorf, Schönenbuch, Switzerland | Galaxy 170S | |
Langendorff-perfusion set-up | Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbläserei, Freiburg, Germany | Custom-made | |
Langendorff-pump | Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Zürich, Switzerland | ISM444 | |
Mesh: Nylon Monodur filter cloth | Cadisch Precision Meshes Ltd | 800 µm holes, 1 m wide | |
Neubauer chamber | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 717806 | |
Rabbit, New Zealand White | Charles River | Strain Code: 052 | |
Scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BC774R | Bauchdeckenschere ger. 18cm |
Sterile filter, 0.22 µm | Merck, Darmstadt, Germany | SLGP033RB | |
Equipment – Patch-clamp | |||
Amplfier | AxonInstruments, Union City, CA, United States | Axopatch 200B | |
Coverslip ø 50 mm, Thickness No. 1 | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 631-0178 | Borosilicate Glass |
Digitizer Axon Digidata | Molecular Devices, San José, CA, United States | 1550A | |
Filter (530/20) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513878 | BZ:00 |
Filter (630/20) | Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States | 227155 | |
Headstage | AxonInstruments, Union City, CA, United States | CV203BU | |
Interface | Scientifica, Uckfield, UK | 1U Rack, 352036 | |
LED 525 nm | Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States | PT-120-G | |
LED control software | Essel Research and Development, Toronto, Canada | ||
LED control system | custom-made | ||
Micropipette Puller | Narishige Co., Tokyo, Japan | PP-830 | |
Microscope inverted | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI4000B | |
Motorised Micromanipulator | Scientifica, Uckfield, UK | PatchStar | |
Optical power meter | Thorlabs, Newton, NJ, United States | PM100D | |
Silicone Grease | RS Components, Corby, UK | 494-124 | |
Silver wire | A-M Systems, Sequim, WA, United States | 787500 | Silver, Bare 0.015'', Coated 0.0190'', Length 25 Feet |
Soda lime glass capillaries | Vitrex Medical A/S, Vasekaer, Denmark | 160213 BRIS, ISO12772 | 1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm |
Software Axon pClamp | Molecular Devices, San José, CA, United States | Version 10.5 | |
Software MatLab2017 | The MathWorks, Inc. | ||
Stage micrometer | Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK | 1 mm | |
Equipment – Carbon fiber | |||
Carbon fibers | provided from Prof. Jean-Yves Le Guennec | BZ:00 | |
Digitizer Axon Digidata | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, United States | 1550B | |
Filter (530/20) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513878 | |
Filter (630/20) | Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States | 227155 | |
Fluorescence System Interface | IonOptix, Milton, MA United States | FSI-800 | 2.0 OD x 1.16 ID x 100 L mm |
Force Transducer System | Aurora Scientific Inc., Ontario, Canada | 406A | |
Glass capillaries for force measurements | Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, United States | GC200F-10 | |
Interface National Instruments | National Instruments, Budapest, Hungary | BNC-2110 | |
LED 525 nm | Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States | PT-120-G | |
LED control box | Essel Research and Development, Toronto, Canada | ||
LED control system | custom-made | ||
Microcontroller | Parallax Inc., Rocklin, California, United States | Propeller | |
Micropipette Puller | Narishige Co., Tokyo, Japan | PC-10 | |
Microscope inverted | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI4000B | |
MyoCam-S camera | IonOptix, Dublin, Ireland | ||
MyoCam-S camera Power | IonOptix, Milton, MA, United States | MCS-100 | |
MyoPacer Field Stimulator | IonOptix Cooperation, Milton, MA, United States | MYP100 | |
Piezo Motor | Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | E-501.00 | |
Silicone Grease | RS Components, Corby, UK | 494-124 | |
Software Axon pClamp | Molecular Devices, San José, CA, United States | Version 10.5 | |
Software IonWizard | IonOptix, Dublin, Ireland | Version 6.6.10.125 | |
Software MatLab2017 | The MathWorks, Inc. | ||
Stage micrometer | Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK | 1 mm | |
Chemicals | |||
Adenosine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A9251-100G | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A7030-50G | |
CaCl2 | Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA | 21114-1L | |
L-Carnitine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C9500-25G | |
Collagenase type 2, 315 U/mg | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS004177 | |
Creatine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C0780-50G | |
Cytosine-β-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C1768-100MG | |
EGTA | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 3054.3 | |
Esketamine hydrochloride, Ketanest S 25 mg/mL | Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlin, Germany | PZN-07829486 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | F9665 | |
Gentamycin 50 mg/mL | Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA | 15750-037 | |
Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | G7021-1KG | |
Heparin-Sodium, 5,000 IU/mL | Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | PZN-03029843 | |
HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | H3375-1KG | |
Insulin (bovine pancreas) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | I6634-50MG | |
K-aspartate | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A6558-25G | |
KCl | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 26764.260 | 1 mg/mL |
KOH | Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA | 35113-1L | |
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | L2020-1MG | |
M199-Medium | Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, United States | M4530 | |
Mg-ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A9187-1G | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 63069-500ML | |
NaCl | Fisher Scientific, Loughborough, Leics., UK | 10428420 | |
NaCl-Solution 0.9%, Isotone Kochsalz-Lösung 0.9% | Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 3200950 | |
NaOH | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A6579 | without Ca2+/Mg2+ |
Na-pyruvat | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | P2256-100MG | |
Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | D1408-500ML | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma, Poole, UK | 192066 | |
Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | P5147-1G | |
Taurine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | T0625-500G | |
Thiopental Inresa 0.5 g | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | PZN-11852249 | |
Xylazine hydrochloride, Rompun 2% | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | PZN-01320422 |