Wir präsentieren ein Protokoll zur Bewertung der elektromechanischen Wirkungen der GtACR1-Aktivierung in Kaninchen-Kardiomyozyten. Wir bieten detaillierte Informationen über Zellisolation, Kultivierung und adenovirale Transduktion sowie über funktionelle Experimente mit den Patch-Clamp- und Carbonfaser-Techniken.
In den letzten zwei Jahrzehnten wurden optogenetische Werkzeuge als potente Mittel etabliert, um zelltypspezifische Aktivität in erregbarem Gewebe, einschließlich des Herzens, zu modulieren. Während Channelrhodopsin-2 (ChR2) ein gängiges Werkzeug zur Depolarisierung des Membranpotenzials in Kardiomyozyten (CM) ist, fehlt möglicherweise ein wirksames Werkzeug zur zuverlässigen Silencing von CM-Aktivitäten. Es wurde vorgeschlagen, Anionenkanalrhodopsine (ACR) zur optogenetischen Hemmung zu verwenden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Bewertung der Auswirkungen der Aktivierung der natürlichen ACR GtACR1 von Guillardia theta in kultivierten Kaninchen CM. Primäre Auslesungen sind elektrophysiologische Patch-Clamp-Aufnahmen und optische Verfolgung von CM-Kontraktionen, die beide unter Anwendung verschiedener Muster der Lichtstimulation durchgeführt werden. Das Protokoll umfasst die CM-Isolierung vom Kaninchenherz, das Säen und Kultivieren der Zellen für bis zu 4 Tage, die Transduktion über adenovirus-Codierung für den lichtverzerten Chloridkanal, die Vorbereitung von Patch-Clamp- und Carbonfaser-Setups, die Datenerfassung und -analyse. Mit der Patch-Clamp-Technik in ganzzelliger Konfiguration kann man lichtaktivierte Ströme (im Spannungsklemmenmodus, V-Klemmung) und AP (Stromklemmenmodus, I-Klemme) in Echtzeit aufzeichnen. Zusätzlich zu Patch-Clamp-Experimenten führen wir Kontraktilitätsmessungen zur funktionellen Beurteilung der CM-Aktivität durch, ohne das intrazelluläre Milieu zu stören. Dazu werden Zellen mechanisch mit Kohlefasern vorbelastet und Kontraktionen werden aufgezeichnet, indem Änderungen der Sarcomere-Länge und des Kohlenstofffaserabstandes nachverfolgt werden. Die Datenanalyse umfasst die Bewertung der AP-Dauer aus I-Klemmenaufzeichnungen, Spitzenströmen aus V-Klemmenaufzeichnungen und Kraftberechnung aus Kohlefasermessungen. Das beschriebene Protokoll kann auf die Prüfung biophysikalischer Wirkungen verschiedener optogenetischer Aktoren auf die CM-Aktivität angewendet werden, eine Voraussetzung für die Entwicklung eines mechanistischen Verständnisses optogenetischer Experimente im Herzgewebe und im ganzen Herzen.
ChR-vermittelte Fotoströme wurden zuerst im Augenfleck der einzelligen Grünalgen1,2aufgezeichnet. Bald nach dem genetischen Klonen und der heterologen Expression von Chlamydomonas reinhardtii ChR1 und ChR2 wurden ChR als Werkzeuge verwendet, um das Membranpotenzial in Xenopus-Oozyten und Säugetierzellen durch Licht3,4zu verändern. Kation nicht-selektive ChR depolarisieren die Membran von Zellen mit einem ruhenden Membranpotential, das negativ auf das Umkehrpotenzial von ChR ist. Sie können somit verwendet werden, um AP in erregbaren Zellen zu entlocken, einschließlich Neuronen und CM, so dass optisches Tempo5,6.
Ergänzend zu Kation ChR, lichtbetriebene Proton, Chlorid und Natriumpumpen7,8,9 wurden verwendet, um neuronale Aktivität zu hemmen10,11,12. Letztere haben jedoch Einschränkungen, die hohe Lichtintensitäten und eine anhaltende Beleuchtung erfordern, da ein Ion pro absorbiertem Photon transportiert wird. Im Jahr 2014 beschrieben zwei unabhängige Studien von Wietek et al. und Berndt et al. die Umwandlung von kationleitender ChR in ACR über Mutationen in der Kanalpore13,14. Ein Jahr später wurden natürliche ACR im Kryptophyten Guillardia theta (GtACR)15entdeckt. Da die konstruierte ACR eine Restkationsleitfähigkeit zeigte, wurden sie durch natürliche ACR ersetzt, die sich durch eine große einkanalige Leitfähigkeit und eine hohe Lichtempfindlichkeit15auszeichneten. GtACR wurden verwendet, um neuronale Aktivität zum Schweigen zu bringen, indem das Membranpotential in Richtung des Umkehrpotentials von Chlorid16,17polarisiert wurde. Govorunova et al. wandtegten GtACR1 auf kultivierte Rattenventrikuläre CM an und zeigten eine effiziente Photohemmung bei niedriger Lichtintensität, die nicht ausreichte, um zuvor verfügbare Hemmwerkzeuge wie die Protonenpumpe Arch18zu aktivieren. Unsere Gruppe berichtete kürzlich, dass die GtACR1-vermittelte Photoinhibition von CM auf Depolarisation basiert und dass GtACR1 daher auch für optisches Tempo von CM19verwendet werden kann.
Hier stellen wir ein Protokoll zur Untersuchung der elektrophysiologischen und mechanischen Auswirkungen der GtACR1-Photoaktivierung auf kultivierte Kaninchenventrikuläre CM vor. Wir beschreiben zunächst die Zellisolation, Kultivierung und Transduktion. Elektrophysiologische Effekte werden mit Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen gemessen. Lichtvermittelte Ströme bei einer bestimmten Membranspannung werden im V-Klemmmodus bewertet. Die Membranpotentialdynamik wird beim elektrisch- oder optisch-temporierenden CM (I-Clamp-Modus) gemessen. Die optische Hemmung des elektrisch ausgelösten AP wird mit einer dauerhaften Lichtanwendung getestet. Mechanische Effekte werden mit Kohlefasern in Kombination mit der bildgebenden Verfolgung der Sarcomere-Länge gemessen. Dazu werden optisch bewegsame Zellen mechanisch vorbelastet, indem zwei Kohlefasern an der Plasmamembran in der Nähe gegenüberliegender Zellenden befestigt werden. Sarcomere Längenänderungen werden während des optischen oder elektrischen Tempos aufgezeichnet. Schließlich wird die Photoinhibition während der elektrischen Feldstimulation der Zellen gemessen und erzeugte Kräfte analysiert.
Das Protokoll enthält die folgenden Schritte im Flussdiagramm in Abbildung 1:Kaninchentiefanästhesie, Thiopental-Überdosis-Injektion, Herzexzision, Langendorff-Perfusion und Gewebeverdauung, mechanische Dissoziation des Gewebes zur Freisetzung von Zellen, mikroskopische Analyse der CM-Ausbeute, Kultivierung von CM, Transduktion mit Adenovirus Typ 5, gefolgt von Inkubation und funktionellen Experimenten.
Abbildung 1: Flussdiagramm des Protokolls, das verwendet wird, um elektrisch und optisch beweglich CM zu erhalten. Herzen werden von Kaninchen entfernt, die 9-10 Wochen alt sind, und Herzgewebe wird verdaut, während es mit einem Langendorff-Setup durchnässt wird. Zellen werden durch mechanische Sergung freigesetzt. Die CM-Ausbeute wird unter dem Mikroskop gezählt. CM werden kultiviert, mit Adenovirus Typ 5 transduziert und funktionelle Experimente werden 48-72 Stunden nach der Transduktion durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Während optogenetische Werkzeuge die Modulation der erregbaren Zellelektrophysiologie auf nicht-invasive Weise ermöglichen, benötigen sie eine gründliche Charakterisierung in verschiedenen Zelltypen (z. B. CM), damit man das beste verfügbare Werkzeug für ein spezifisches experimentelles Design auswählen kann. Die Patch-Clamp-Technik ist eine Standardmethode zur Beurteilung der zellulären Elektrophysiologie. In der Ganzzellkonfiguration ermöglicht es, photoaktivierte Ströme über die Plasmamembran oder zeitliche Veränderungen der Membranspannung nach Lichtstimulation/Hemmung aufzuzeichnen. Optogenetische Manipulation der elektrischen Anregung wirkt sich auch auf CM Kontraktionen. Wir verwenden Sarcomere-Tracking und Kohlefaser-unterstützte Kraftmessungen, um die Auswirkungen optischer Verhöre auf die mechanische Aktivität von Myozyten zu quantifizieren.
Wir beschreiben ein Protokoll, um die grundlegenden Effekte eines lichtverorgattenden Chloridkanals, GtACR1, in CM zu charakterisieren. Als Modellsystem haben wir uns für Kaninchen CM entschieden, da ihre elektrophysiologischen Eigenschaften (z. B. AP-Form und feuerfeste Periode) denen ähneln, die im menschlichen CM beobachtet wurden, näher als Nagetier CM. Darüber hinaus kann Kaninchen CM für mehrere Tage kultiviert werden, lang genug für adenovirale Lieferung und Expression von GtACR1-eGFP. Insbesondere isolierte CM ändern ihre strukturellen Eigenschaften in der Kultur im Laufe der Zeit, einschließlich Rundung von Zellendenden und allmählichen Verlust der Kreuz-Striation, T-tubular System undCaveolae 23,24. In diesem Einklang wurden funktionelle Veränderungen in kultivierten CM berichtet: Depolarisation des ruhenden Membranpotentials, Verlängerung des AP und Veränderungen in der zellulären Ca2+ Handhabung. Für eine Überprüfung der zellulären Anpassungen in der Kultur, siehe Louch et al.25. Ergänzende Abbildung 2 zeigt beispielhafte AP- und Kontraktionsmessungen von frisch isoliertem CM zum Vergleich mit denen, die in kultiviertem CM beobachtet wurden (Abbildung 6, Abbildung 7) unter Verwendung des hier vorgestellten Protokolls.
Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahmen ermöglichen direkte Messungen von Photostromeigenschaften (z. B. Amplituden und Kinetik) und lichtinduzierten Veränderungen des Membranpotentials oder der AP-Eigenschaften bei hoher zeitlicher Auflösung. Solche Aufnahmen haben jedoch mehrere Einschränkungen: Erstens wird das Zytosol durch die Pipettenlösung in Ganzzellaufnahmen ersetzt, was vorteilhaft ist, ionische elektrochemische Gradienten zu kontrollieren, aber den intrinsischen Nachteil des Auswaschens von Zellorganellen, Proteinen und anderen Verbindungen hat, wodurch sich die zellulären elektrischen Reaktionen potenziell auswirken. Zweitens sind Nebenwirkungen wie die Aktivierung zusätzlicher Ionenkanäle infolge einer nicht physiologisch langen Depolarisation (z. B. langsame Zeitkonstanten von lichtgated Ionenkanälen) schwer einzuschätzen, da unsere Methode es nur ermöglicht, Veränderungen in APD zu erkennen, aber keine direkten Messungen der ionenförmigen Konzentrationen in elektrophysiologisch relevanten Zellkompartimen durchzuführen. Dies könnte mit Fluoreszenzindikatoren (z. B. Ca2+-Sensoren) oder ionenselektiven Elektroden erfolgen. Weitere Charakterisierungen können Lichtintensitätstitrationen, Bestimmung der pH-Abhängigkeit, photoaktuelle Kinetik an verschiedenen Membranpotentialen und Erholungskinetik bei sich wiederholender Lichtstimulation sein.
Im Gegensatz zu Patch-Clamp-Aufnahmen ermöglichen einzellige Kraftmessungen die Analyse zellulärer Kontraktionen intakter Myozyten, ohne ihr intrazelluläres Milieu zu beeinträchtigen. Sekundäre Auswirkungen auf Ionenkonzentrationen (z.B. Ca2+)können indirekt durch Bestimmung der erzeugten Kraftamplitude und Dynamik (z.B. maximale Kontraktions- und Entspannungsgeschwindigkeit; hier nicht analysiert) beurteilt werden. Kraftmessungen mit der Kohlefasertechnik haben einen Vorteil gegenüber frei kontrahierenden Zellen, da sie direkte Informationen über passive und aktive Kräfte in vorbelasteten Zellen liefern (d. h. bei Bedingungen, die eher den In-situ- oder in-vivo-Einstellungen ähneln). Mechanische Vorspannung ist besonders wichtig bei der Analyse der zellulären Kontraktilität, da Dehnung wirkt sich auf Kraftproduktion und Entspannung26,27.
Optogenetische Ansätze ermöglichen eine raumzeitlich präzise Manipulation des Zellmembranpotentials, sowohl in einzelm CM als auch im intakten Herzgewebe. Klassischerweise wurde ChR2, ein lichtverorsender Kationen-Nicht-selektiver Kanal, zur Depolarisation des Membranpotentials verwendet, während lichtbetriebene Protonen- und/oder Chloridpumpen für die Membranhyperpolarisation verwendet wurden. Beide Gruppen von optogenetischen Aktuatoren erfordern hohe Expressionsniveaus, da ChR2 durch eine intrinsisch niedrige einkanalige Leitfähigkeit28 gekennzeichnet ist und lichtbetriebene Pumpen maximal ein Ionen pro absorbiertem Photon transportieren. Darüber hinaus kann eine längere Aktivierung von ChR2 in CM zu Einer Überlastung von Na+ und/oder Ca2+ führen, und lichtbetriebene Pumpen können transsarkolimmales H+ oder Cl– Gradienten29,30ändern. Auf der Suche nach alternativen Werkzeugen zur optogenetischen Kontrolle der CM-Aktivität haben wir vor kurzem das natürliche Anionenkanalrhodopsin GtACR1 getestet, das sich durch eine überlegene einkanalige Leitfähigkeit und eine höhere Lichtempfindlichkeit im Vergleich zu Kation ChR wie ChR2 auszeichnet. Wir fanden heraus, dass die GtACR1-Aktivierung CM depolarisiert und je nach Lichtimpuls-Timing und -Dauer für optisches Tempo und Hemmung verwendet werden kann. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von ACR anstelle von kation ChR könnte das negativere Umkehrpotential von Clsein – im Vergleich zu Na+, um künstlich eingeführte Ionenströme zu reduzieren. Wie wir bereits gezeigt haben, kann optisches Tempo mit GtACR1 aufgrund der langsamen Komponente des GtACR1-Kanalverschlusses zu einer AP-Verlängerung führen, die durch den Einsatz schnellerer GtACR1-Mutationen19überwunden werden könnte. Die AP-Verlängerung ist jedoch bei Verwendung einer niedrigeren, physiologischeren intrazellulärenCl-Konzentration viel weniger ausgeprägt (siehe Abbildung 6). Darüber hinaus führt die GtACR1-vermittelte Hemmung durch längere Ausleuchtung zu einer tiefgreifenden Membrandepolarisation, die wiederum den sekundären Na+ und Ca2+ Zustrom aktivieren und damit die Aktivität von spannungsgebundenen Kanälen verändern könnte. In unseren Messungen stellen wir fest, dass sich AP- und Kontraktionsparameter nach einer lichtinduzierten Hemmung für 1 min auf Basislinie von 40 s erholen (siehe Kopton et al. 2018, Abbildung 6, Abbildung 7). Lichtgeorte K+ Kanäle bieten eine potente Alternative zum Silencing CM, ohne das CM-Ruhemembranpotential31zu beeinträchtigen.
In Zukunft möchten wir verschiedene optogenetische Werkzeuge quantitativ vergleichen, um ihre Fähigkeit zur Hemmung der Herzaktivität zu haben. Zu diesem Zweck testen wir eine Vielzahl von lichtverkabelten Ionenkanälen, einschließlich ACR, ChR2 und rot verschiebbaren ChR-Varianten32, sowie hyperpolarisierende Aktuatoren wie Halorhodopsin oder die lichtgated adenylyl cyclase bPAC in Kombination mit dem Kaliumkanal SthK (PAC-K)31.
Das hier vorgestellte Protokoll kann zur tiefen Charakterisierung der elektromechanischen Eigenschaften von CM verwendet werden. Es gilt hauptsächlich auch für CM von anderen Arten, und CM isoliert von krankem Myokard. Die optische Stimulation ermöglicht es, CM bei unterschiedlichen Frequenzen zu beschleunigen, und verschiedene Vorspannungen können bei Kohlefaserkontraktionsexperimenten getestet werden. Ein interessantes Experiment wäre die Verwendung von Beleuchtung mit geringer Intensität für die subschwellige Depolarisation, um eine allmähliche Zunahme des ruhenden Membranpotentials nachzuahmen, wie bei der Entwicklung des Herzgewebeumbaus während der Krankheitsprogression beobachtet werden kann. Schließlich könnten funktionelle Messungen mit Ca2+ Imaging kombiniert werden, um weitere Einblicke in die Anregungs-Kontraktionskopplung zu erhalten, oder mit pharmakologischen Interventionen, um die Auswirkungen verschiedener Medikamente auf die CM-Aktivität zu bewerten.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Stefanie Perez-Feliz für die hervorragende technische Unterstützung, Dr. Jonas Wietek (Humboldt-Universität, Berlin, Deutschland) für die Bereitstellung des pUC57-GtACR1-Plasmids, Prof. Dr. Michael Schupp (Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie, Berlin) für die Adenovirus-Produktion und Dr. Anastasia Khokhlova (Ural-Bundesuniversität) für den Austausch ihrer Expertise zur Verbesserung des Zellisolationsprotokolls und zur Neugestaltung der Pipette. Das Projekt wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft gefördert (SPP1926: SCHN 1486/1-1; Emmy-Noether Stipendium: SCHN1486/2-1) und das ERC Advanced Grant CardioNECT.
Equipment – Cell isolation/Culturing/Transduction | |||
Adeno-X Adenoviral System 3 CMV | TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, California, USA | ||
Aortic cannula | Radnoti | 4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L mm | |
Coverslips ø 16 mm, Thickness No. 0 | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 631-0151 | Borosilicate Glass |
Griffin Silk, Black, 2 m Length, Size 3, 0.5 mm | Samuel Findings, London, UK | TSGBL3 | |
Incubator | New Brunswick, Eppendorf, Schönenbuch, Switzerland | Galaxy 170S | |
Langendorff-perfusion set-up | Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbläserei, Freiburg, Germany | Custom-made | |
Langendorff-pump | Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Zürich, Switzerland | ISM444 | |
Mesh: Nylon Monodur filter cloth | Cadisch Precision Meshes Ltd | 800 µm holes, 1 m wide | |
Neubauer chamber | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 717806 | |
Rabbit, New Zealand White | Charles River | Strain Code: 052 | |
Scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BC774R | Bauchdeckenschere ger. 18cm |
Sterile filter, 0.22 µm | Merck, Darmstadt, Germany | SLGP033RB | |
Equipment – Patch-clamp | |||
Amplfier | AxonInstruments, Union City, CA, United States | Axopatch 200B | |
Coverslip ø 50 mm, Thickness No. 1 | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 631-0178 | Borosilicate Glass |
Digitizer Axon Digidata | Molecular Devices, San José, CA, United States | 1550A | |
Filter (530/20) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513878 | BZ:00 |
Filter (630/20) | Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States | 227155 | |
Headstage | AxonInstruments, Union City, CA, United States | CV203BU | |
Interface | Scientifica, Uckfield, UK | 1U Rack, 352036 | |
LED 525 nm | Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States | PT-120-G | |
LED control software | Essel Research and Development, Toronto, Canada | ||
LED control system | custom-made | ||
Micropipette Puller | Narishige Co., Tokyo, Japan | PP-830 | |
Microscope inverted | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI4000B | |
Motorised Micromanipulator | Scientifica, Uckfield, UK | PatchStar | |
Optical power meter | Thorlabs, Newton, NJ, United States | PM100D | |
Silicone Grease | RS Components, Corby, UK | 494-124 | |
Silver wire | A-M Systems, Sequim, WA, United States | 787500 | Silver, Bare 0.015'', Coated 0.0190'', Length 25 Feet |
Soda lime glass capillaries | Vitrex Medical A/S, Vasekaer, Denmark | 160213 BRIS, ISO12772 | 1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm |
Software Axon pClamp | Molecular Devices, San José, CA, United States | Version 10.5 | |
Software MatLab2017 | The MathWorks, Inc. | ||
Stage micrometer | Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK | 1 mm | |
Equipment – Carbon fiber | |||
Carbon fibers | provided from Prof. Jean-Yves Le Guennec | BZ:00 | |
Digitizer Axon Digidata | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, United States | 1550B | |
Filter (530/20) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513878 | |
Filter (630/20) | Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States | 227155 | |
Fluorescence System Interface | IonOptix, Milton, MA United States | FSI-800 | 2.0 OD x 1.16 ID x 100 L mm |
Force Transducer System | Aurora Scientific Inc., Ontario, Canada | 406A | |
Glass capillaries for force measurements | Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, United States | GC200F-10 | |
Interface National Instruments | National Instruments, Budapest, Hungary | BNC-2110 | |
LED 525 nm | Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States | PT-120-G | |
LED control box | Essel Research and Development, Toronto, Canada | ||
LED control system | custom-made | ||
Microcontroller | Parallax Inc., Rocklin, California, United States | Propeller | |
Micropipette Puller | Narishige Co., Tokyo, Japan | PC-10 | |
Microscope inverted | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI4000B | |
MyoCam-S camera | IonOptix, Dublin, Ireland | ||
MyoCam-S camera Power | IonOptix, Milton, MA, United States | MCS-100 | |
MyoPacer Field Stimulator | IonOptix Cooperation, Milton, MA, United States | MYP100 | |
Piezo Motor | Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | E-501.00 | |
Silicone Grease | RS Components, Corby, UK | 494-124 | |
Software Axon pClamp | Molecular Devices, San José, CA, United States | Version 10.5 | |
Software IonWizard | IonOptix, Dublin, Ireland | Version 6.6.10.125 | |
Software MatLab2017 | The MathWorks, Inc. | ||
Stage micrometer | Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK | 1 mm | |
Chemicals | |||
Adenosine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A9251-100G | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A7030-50G | |
CaCl2 | Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA | 21114-1L | |
L-Carnitine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C9500-25G | |
Collagenase type 2, 315 U/mg | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS004177 | |
Creatine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C0780-50G | |
Cytosine-β-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C1768-100MG | |
EGTA | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 3054.3 | |
Esketamine hydrochloride, Ketanest S 25 mg/mL | Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlin, Germany | PZN-07829486 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | F9665 | |
Gentamycin 50 mg/mL | Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA | 15750-037 | |
Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | G7021-1KG | |
Heparin-Sodium, 5,000 IU/mL | Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | PZN-03029843 | |
HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | H3375-1KG | |
Insulin (bovine pancreas) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | I6634-50MG | |
K-aspartate | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A6558-25G | |
KCl | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 26764.260 | 1 mg/mL |
KOH | Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA | 35113-1L | |
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | L2020-1MG | |
M199-Medium | Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, United States | M4530 | |
Mg-ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A9187-1G | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 63069-500ML | |
NaCl | Fisher Scientific, Loughborough, Leics., UK | 10428420 | |
NaCl-Solution 0.9%, Isotone Kochsalz-Lösung 0.9% | Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 3200950 | |
NaOH | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A6579 | without Ca2+/Mg2+ |
Na-pyruvat | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | P2256-100MG | |
Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | D1408-500ML | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma, Poole, UK | 192066 | |
Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | P5147-1G | |
Taurine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | T0625-500G | |
Thiopental Inresa 0.5 g | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | PZN-11852249 | |
Xylazine hydrochloride, Rompun 2% | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | PZN-01320422 |