Nous présentons un protocole pour évaluer les effets électromécaniques de l’activation de GtACR1 dans les cardiomyocytes de lapin. Nous fournissons des informations détaillées sur l’isolement cellulaire, la culture et la transduction adénoviraire, et sur des expériences fonctionnelles avec les techniques de correction-pince et de fibre de carbone.
Au cours des deux dernières décennies, des outils optogénétiques ont été établis comme des moyens puissants pour moduler l’activité spécifique de type cellulaire dans les tissus excitables, y compris le cœur. Alors que Channelrhodopsin-2 (ChR2) est un outil commun pour dépolariser le potentiel de membrane dans les cardiomyocytes (CM), potentiellement obtenir des potentiels d’action (AP), un outil efficace pour le silence fiable de l’activité CM a été manquant. Il a été suggéré d’utiliser des canalrhodopsins d’anion (ACR) pour l’inhibition optogénétique. Ici, nous décrivons un protocole pour évaluer les effets de l’activation de l’ACR GtACR1 naturel de Guillardia theta dans le lapin cultivé CM. Les lectures primaires sont des enregistrements électrophysiologiques de correction-pince et le suivi optique des contractions de CM, tous deux exécutés tout en appliquant différents modèles de stimulation lumineuse. Le protocole comprend l’isolement CM du cœur du lapin, l’ensemencement et la culture des cellules pendant un bon jusqu’à 4 jours, la transduction par le codage de l’adénovirus pour le canal de chlorure de lumière, la préparation de corrections de pinces et de fibres de carbone, la collecte et l’analyse de données. L’utilisation de la technique de pince de correction dans la configuration des cellules entières permet d’enregistrer les courants activés par la lumière (en mode tension-clamp, V-clamp) et AP (mode de pince actuelle, I-clamp) en temps réel. En plus des expériences de correction-pince, nous effectuons des mesures de contractilité pour l’évaluation fonctionnelle de l’activité de CM sans perturber le milieu intracellulaire. Pour ce faire, les cellules sont mécaniquement préchargées à l’aide de fibres de carbone et les contractions sont enregistrées en suivant les changements dans la longueur du sarcome et la distance de fibre de carbone. L’analyse des données comprend l’évaluation de la durée de l’AP à partir des enregistrements I-clamp, les courants de pointe des enregistrements de V-clamp et le calcul de la force à partir de mesures de fibre de carbone. Le protocole décrit peut être appliqué à l’essai des effets biophysiques de différents actionneurs optogénétiques sur l’activité de CM, une condition préalable pour le développement d’une compréhension mécaniste des expériences optogénétiques dans le tissu cardiaque et les coeurs entiers.
Des photocurrents à médiation ChR ont d’abord été enregistrés dans la tache oculaire des algues vertes unicellulaires1,2. Peu de temps après le clonage génétique et l’expression hétérogène de Chlamydomonas reinhardtii ChR1 et ChR2, ChR ont été utilisés comme outils pour modifier le potentiel de membrane dans les oocytes Xenopus et les cellules de mammifères par la lumière3,4. La Cation non sélective ChR dépolarise la membrane des cellules avec un potentiel de membrane de repos qui est négatif au potentiel d’inversion de ChR. Ils peuvent ainsi être utilisés pour obtenir AP dans les cellules excitables, y compris les neurones et CM, permettant le rythme optique5,6.
Complémentaire à la cation ChR, proton léger, chlorure et pompes à sodium7,8,9 ont été utilisés pour inhiber l’activité neuronale10,11,12. Cependant, ces derniers ont des limitations, nécessitant des intensités de lumière élevée et un éclairage soutenu, car un ion est transporté par photon absorbé. En 2014, deux études indépendantes menées par Wietek et coll. et Berndt et coll. ont décrit la conversion de ChR en ACR par le biais de mutations dans le canal pore13,14. Un an plus tard, ACR naturel ont été découverts dans le cryptophyte Guillardia theta (GtACR)15. Comme l’ACR conçu a montré la conductance résiduelle de cation, ils ont été remplacés par ACR naturel, caractérisé par une grande conductance à canal unique et une sensibilité élevée de lumière15. GtACR ont été utilisés pour réduire au silence l’activité neuronale en polarisant le potentiel de membrane vers le potentiel d’inversion du chlorure16,17. Govorunova et coll. ont appliqué GtACR1 à la CM ventriculaire de rat cultivée et ont montré la photoinhibition efficace à de faibles niveaux d’intensité lumineuse qui n’étaient pas suffisants pour activer des outils d’inhibition précédemment disponibles, tels que la pompe de proton Arch18. Notre groupe a récemment signalé que la photoinhibition de CM à médiation GtACR1 est basée sur la dépolarisation et que GtACR1 peut également être utilisé, par conséquent, pour le rythme optique de CM19.
Ici, nous présentons un protocole pour étudier les effets électrophysiologiques et mécaniques de la photoactivation GtACR1 sur le lapin cultivé ventriculaire CM. Nous décrivons d’abord l’isolement cellulaire, la culture et la transduction. Les effets électrophysiologiques sont mesurés à l’aide d’enregistrements de pinces à cellules entières. Les courants à médiation légère à une tension membrane donnée sont évalués en mode V-clamp. La dynamique du potentiel de membrane est mesurée tandis que le CM de rythme électrique ou optique (mode I-clamp). L’inhibition optique de l’AP déclenchée électriquement est testée à l’aide d’une application de lumière soutenue. Les effets mécaniques sont mesurés à l’aide de fibres de carbone en combinaison avec le suivi à base d’imagerie de la longueur du sarcome. Pour ce faire, les cellules optiquement rythmées sont mécaniquement préchargées en attachant deux fibres de carbone à la membrane plasmatique près des extrémités opposées des cellules. Les changements de longueur du sarcomère sont enregistrés lors du rythme optique ou électrique. Enfin, la photoinhibition est mesurée lors de la stimulation électrique du champ des cellules, et les forces générées sont analysées.
Le protocole comprend les étapes suivantes indiquées dans le flowchart de la figure 1: anesthésie profonde du lapin, injection de surdosage thiopental, excision cardiaque, langendorff-perfusion et digestion des tissus, dissociation mécanique du tissu pour libérer les cellules, analyse microscopique du rendement cm, culte du CM, transduction avec adénovirus de type 5, suivie d’incubation et d’expériences fonctionnelles.
Figure 1 : Flowchart du protocole utilisé pour obtenir un CM électriquement et optiquement rythmé. Les cœurs sont excisés à partir de lapins de 9 à 10 semaines, et le tissu cardiaque est digéré tout en étant perfusé à l’aide d’une configuration Langendorff. Les cellules sont libérées par l’agitation mécanique. Le rendement CM est compté au microscope. CM sont cultivés, transduits avec l’adénovirus de type 5 et les expériences fonctionnelles sont effectuées 48-72 heures après la transduction. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Alors que les outils optogénétiques permettent la modulation de l’électrophysiologie cellulaire excitable d’une manière non invasive, ils ont besoin d’une caractérisation approfondie dans différents types de cellules (par exemple, CM) pour permettre de choisir le meilleur outil disponible pour une conception expérimentale spécifique. La technique de la pince de correction est une méthode standard pour évaluer l’électrophysiologie cellulaire. Dans la configuration de toute la cellule, il permet d’enregistrer des courants photo-activés à travers la membrane plasmatique ou des changements temporels dans la tension de membrane suivant la stimulation/inhibition de la lumière. La manipulation optogène de l’excitation électrique affecte également les contractions de CM. Nous utilisons le suivi du sarcomère et les mesures de force assistées en fibre de carbone pour quantifier les effets de l’interrogatoire optique sur l’activité mécanique des myocytes.
Nous décrivons un protocole pour caractériser les effets de base d’un canal de chlorure à la lumière, GtACR1, en CM. En tant que système modèle, nous avons choisi le lapin CM, comme leurs caractéristiques électrophysiologiques (p. ex., forme AP et période réfractaire) ressemblent à celles observées chez le CM humain plus étroitement que le CM de rongeur. En outre, le lapin CM peut être cultivé pendant plusieurs jours, assez longtemps pour la livraison adénovirrielle et l’expression de GtACR1-eGFP. Notamment, CM isolé changer leurs propriétés structurelles dans la culture au fil du temps, y compris l’arrondissement des terminaisons cellulaires et la perte progressive de la lutte croisée, T-tubular système et caveolae23,24. Dans cette lignée, des altérations fonctionnelles ont été signalées dans CM cultivé : dépolarisation du potentiel de membrane de repos, prolongation de l’AP et changements dans la manipulation cellulaire ca2MD. Pour examen des adaptations cellulaires dans la culture, s’il vous plaît voir Louch et coll.25. La figure 2 supplémentaire montre des mesures exemplaires de l’AP et de la contraction de CM fraîchement isolées pour la comparaison avec celles observées dans le CM cultivé(figure 6, figure 7) en utilisant le protocole présenté ici.
Les enregistrements de pinces à cellules entières permettent des mesures directes des propriétés photocurrentes (p. ex., amplitudes et cinétique) et des changements induits par la lumière dans le potentiel membranaire ou les caractéristiques d’AP à haute résolution temporelle. Cependant, ces enregistrements ont plusieurs limites: Tout d’abord, le cytosol est remplacé par la solution pipette dans les enregistrements à cellules entières, ce qui est avantageux pour contrôler les gradients électrochimiques ioniques, mais a le désavantage intrinsèque de lavage des organites cellulaires, protéines et autres composés, affectant ainsi potentiellement les réponses électriques cellulaires. Deuxièmement, les effets secondaires comme l’activation de canaux ion supplémentaires résultant d’une dépolarisation non physiologiquement longue (p. ex., des constantes de temps lent des canaux ion ion élégés) sont difficiles à évaluer car notre méthode ne permet qu’à détecter les changements dans la DPA, mais pas à effectuer des mesures directes des concentrations ioniques dans les compartiments cellulaires électrophysioologiquement pertinents. Cela pourrait se faire avec des indicateurs fluorescents (p. ex. capteurs Ca2MD) ou des électrodes ion-sélectives. D’autres caractérisations peuvent inclure des titrations d’intensité lumineuse, la détermination de la dépendance au pH, la cinétique photocurrente à différents potentiels de membrane, et la cinétique de récupération pendant la stimulation répétitive de lumière.
Contrairement aux enregistrements de pinces à correction, les mesures de force à cellule unique permettent l’analyse des contractions cellulaires des myocytes intacts sans affecter leur milieu intracellulaire. Les effets secondaires sur les concentrations d’ions (p. ex., Ca2MD)peuvent être évalués indirectement en déterminant l’amplitude et la dynamique générées de force (p. ex., vitesse maximale de contraction et de relaxation; ici non analysées). Les mesures de force avec la technique de fibre de carbone ont un avantage sur les cellules de passation de marchés librement car elles fournissent des informations directes sur les forces passives et actives dans les cellules préchargées (c.-à-d. dans des conditions qui sont plus semblables aux milieux in situ ou in vivo). Le préchargement mécanique est particulièrement important lors de l’analyse de la contractilité cellulaire, car l’étirement affecte la production de force et la relaxation26,27.
Les approches optogénétiques permettent une manipulation spatiotemporally précise du potentiel de membrane cellulaire, à la fois dans le CM unique et le tissu cardiaque intact. Classiquement, ChR2, un canal non sélectif de cation à la lumière, a été employé pour la dépolarisation du potentiel de membrane, tandis que les pompes de proton et/ou de chlorure à propulsion légère ont été employées pour l’hyperpolarisation de membrane. Les deux groupes d’actionneurs optogénétiques exigent des niveaux d’expression élevés, car ChR2 est caractérisé par une conductance à canal unique intrinsèquement faible28 et des pompes à éclairage transportent au maximum un ion par photon absorbé. En outre, l’activation prolongée de ChR2 dans CM peut conduire àla surcharge na et/ou Ca2MD, et les pompes à éclairage peuvent changer leH trans-sarcolemmal ou cl– gradients29,30. À la recherche d’outils alternatifs pour le contrôle optogénétique de l’activité CM, nous avons récemment testé le canal d’anion naturel GtACR1, caractérisé par une conductance supérieure d’un seul canal et une sensibilité de lumière plus élevée par rapport à la cation ChR comme ChR2. Nous avons constaté que l’activation de GtACR1 dépolarise CM et peut être utilisée pour le rythme optique et l’inhibition, selon le calendrier et la durée de l’impulsion lumineuse. Un avantage supplémentaire de l’utilisation de l’ACR au lieu de cation ChR pourrait être le potentiel d’inversion plus négatif de Cl– par rapport à Na–, réduisant artificiellement introduit les courants d’ions. Comme nous l’avons déjà montré, le rythme optique avec GtACR1 peut conduire à la prolongation AP en raison de la composante lente de la fermeture du canal GtACR1, qui pourrait être surmontée en utilisant plus rapide GtACR1 mutants19. Cependant, la prolongation d’AP est beaucoup moins prononcée lors de l’utilisation d’une C cl intracellulaire plus faible et plus physiologique– concentration (voir la figure 6). En outre, l’inhibition à médiation GtACR1 par une illumination prolongée entraîne une dépolarisation profonde de la membrane, qui pourrait encore une fois activer l’afflux secondairede Na et Ca2, modifiant ainsi l’activité des canaux tension-fermés. Dans nos mesures, nous constatons que l’AP et les paramètres de contraction se rétablissent à la ligne de base dans les 40 s après une inhibition induite par la lumière pendant 1 min (voir Kopton et al. 2018, figure 6, figure 7). Les canaux Ket K légèrement fermés offrent une alternative puissante pour faire taire le CM sans affecter le potentiel de la membrane de reposCM 31.
À l’avenir, nous aimerions comparer quantitativement différents outils optogénétiques pour leur potentiel d’inhiber l’activité cardiaque. À cette fin, nous testons une variété de canaux d’ions ion à la lumière, y compris les variantes ACR, ChR2 et ChR32,ainsi que des actionneurs hyperpolarisants tels que l’halorhodopsine ou la lumière fermée cyclase d’adénylylique bPAC en combinaison avec le canal de potassium SthK (PAC-K)31.
Le protocole présenté ici peut être utilisé pour la caractérisation en profondeur des propriétés électromécaniques de CM. Il s’applique principalement aussi à LA CM d’autres espèces, et à CM isolé du myocarde malade. La stimulation optique permet de rythmer CM à différentes fréquences, et différentes précharges peuvent être testées lors d’expériences de contraction de la fibre de carbone. Une expérience intéressante serait d’utiliser l’éclairage de basse intensité pour la dépolarisation de subthreshold, pour imiter l’augmentation graduelle du potentiel de membrane de repos, comme on peut l’observer pendant le développement du tissu cardiaque remodelant pendant la progression de la maladie. Enfin, des mesures fonctionnelles pourraient être combinées à l’imagerie Ca2MD pour mieux comprendre le couplage de la contraction de l’excitation, ou avec des interventions pharmacologiques pour évaluer les effets de différents médicaments sur l’activité cm.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Stefanie Perez-Feliz pour son excellente assistance technique, Dr. Jonas Wietek (Humboldt-University, Berlin, Allemagne) pour la fourniture du pUC57-GtACR1 plasmide, Prof. Dr. Michael Schupp (Charité-Universit-tsmedizin Berlin, Institut f’r Pharmakologie, Berlin) pour la production d’adénovirus et le Dr Anastasia Khokhlova (Université fédérale de l’Oural) pour le partage de son expertise pour améliorer le protocole d’isolement cellulaire et de re-conception de la configuration de la pipette. Le projet a été financé par la Fondation allemande de la recherche (SPP1926: SCHN 1486/1-1; Bourse Emmy-Noether : SCHN1486/2-1) et l’ERC Advanced Grant CardioNECT.
Equipment – Cell isolation/Culturing/Transduction | |||
Adeno-X Adenoviral System 3 CMV | TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, California, USA | ||
Aortic cannula | Radnoti | 4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L mm | |
Coverslips ø 16 mm, Thickness No. 0 | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 631-0151 | Borosilicate Glass |
Griffin Silk, Black, 2 m Length, Size 3, 0.5 mm | Samuel Findings, London, UK | TSGBL3 | |
Incubator | New Brunswick, Eppendorf, Schönenbuch, Switzerland | Galaxy 170S | |
Langendorff-perfusion set-up | Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbläserei, Freiburg, Germany | Custom-made | |
Langendorff-pump | Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Zürich, Switzerland | ISM444 | |
Mesh: Nylon Monodur filter cloth | Cadisch Precision Meshes Ltd | 800 µm holes, 1 m wide | |
Neubauer chamber | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 717806 | |
Rabbit, New Zealand White | Charles River | Strain Code: 052 | |
Scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BC774R | Bauchdeckenschere ger. 18cm |
Sterile filter, 0.22 µm | Merck, Darmstadt, Germany | SLGP033RB | |
Equipment – Patch-clamp | |||
Amplfier | AxonInstruments, Union City, CA, United States | Axopatch 200B | |
Coverslip ø 50 mm, Thickness No. 1 | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 631-0178 | Borosilicate Glass |
Digitizer Axon Digidata | Molecular Devices, San José, CA, United States | 1550A | |
Filter (530/20) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513878 | BZ:00 |
Filter (630/20) | Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States | 227155 | |
Headstage | AxonInstruments, Union City, CA, United States | CV203BU | |
Interface | Scientifica, Uckfield, UK | 1U Rack, 352036 | |
LED 525 nm | Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States | PT-120-G | |
LED control software | Essel Research and Development, Toronto, Canada | ||
LED control system | custom-made | ||
Micropipette Puller | Narishige Co., Tokyo, Japan | PP-830 | |
Microscope inverted | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI4000B | |
Motorised Micromanipulator | Scientifica, Uckfield, UK | PatchStar | |
Optical power meter | Thorlabs, Newton, NJ, United States | PM100D | |
Silicone Grease | RS Components, Corby, UK | 494-124 | |
Silver wire | A-M Systems, Sequim, WA, United States | 787500 | Silver, Bare 0.015'', Coated 0.0190'', Length 25 Feet |
Soda lime glass capillaries | Vitrex Medical A/S, Vasekaer, Denmark | 160213 BRIS, ISO12772 | 1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm |
Software Axon pClamp | Molecular Devices, San José, CA, United States | Version 10.5 | |
Software MatLab2017 | The MathWorks, Inc. | ||
Stage micrometer | Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK | 1 mm | |
Equipment – Carbon fiber | |||
Carbon fibers | provided from Prof. Jean-Yves Le Guennec | BZ:00 | |
Digitizer Axon Digidata | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, United States | 1550B | |
Filter (530/20) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513878 | |
Filter (630/20) | Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States | 227155 | |
Fluorescence System Interface | IonOptix, Milton, MA United States | FSI-800 | 2.0 OD x 1.16 ID x 100 L mm |
Force Transducer System | Aurora Scientific Inc., Ontario, Canada | 406A | |
Glass capillaries for force measurements | Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, United States | GC200F-10 | |
Interface National Instruments | National Instruments, Budapest, Hungary | BNC-2110 | |
LED 525 nm | Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States | PT-120-G | |
LED control box | Essel Research and Development, Toronto, Canada | ||
LED control system | custom-made | ||
Microcontroller | Parallax Inc., Rocklin, California, United States | Propeller | |
Micropipette Puller | Narishige Co., Tokyo, Japan | PC-10 | |
Microscope inverted | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI4000B | |
MyoCam-S camera | IonOptix, Dublin, Ireland | ||
MyoCam-S camera Power | IonOptix, Milton, MA, United States | MCS-100 | |
MyoPacer Field Stimulator | IonOptix Cooperation, Milton, MA, United States | MYP100 | |
Piezo Motor | Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | E-501.00 | |
Silicone Grease | RS Components, Corby, UK | 494-124 | |
Software Axon pClamp | Molecular Devices, San José, CA, United States | Version 10.5 | |
Software IonWizard | IonOptix, Dublin, Ireland | Version 6.6.10.125 | |
Software MatLab2017 | The MathWorks, Inc. | ||
Stage micrometer | Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK | 1 mm | |
Chemicals | |||
Adenosine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A9251-100G | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A7030-50G | |
CaCl2 | Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA | 21114-1L | |
L-Carnitine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C9500-25G | |
Collagenase type 2, 315 U/mg | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS004177 | |
Creatine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C0780-50G | |
Cytosine-β-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C1768-100MG | |
EGTA | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 3054.3 | |
Esketamine hydrochloride, Ketanest S 25 mg/mL | Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlin, Germany | PZN-07829486 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | F9665 | |
Gentamycin 50 mg/mL | Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA | 15750-037 | |
Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | G7021-1KG | |
Heparin-Sodium, 5,000 IU/mL | Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | PZN-03029843 | |
HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | H3375-1KG | |
Insulin (bovine pancreas) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | I6634-50MG | |
K-aspartate | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A6558-25G | |
KCl | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 26764.260 | 1 mg/mL |
KOH | Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA | 35113-1L | |
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | L2020-1MG | |
M199-Medium | Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, United States | M4530 | |
Mg-ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A9187-1G | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 63069-500ML | |
NaCl | Fisher Scientific, Loughborough, Leics., UK | 10428420 | |
NaCl-Solution 0.9%, Isotone Kochsalz-Lösung 0.9% | Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 3200950 | |
NaOH | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A6579 | without Ca2+/Mg2+ |
Na-pyruvat | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | P2256-100MG | |
Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | D1408-500ML | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma, Poole, UK | 192066 | |
Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | P5147-1G | |
Taurine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | T0625-500G | |
Thiopental Inresa 0.5 g | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | PZN-11852249 | |
Xylazine hydrochloride, Rompun 2% | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | PZN-01320422 |