Vi presenterar ett protokoll för utvärdering av de elektromekaniska effekterna av GtACR1 aktivering i kanin kardiomyocyter. Vi ger detaljerad information om cellisolering, odling och adenoviral transduktion, och om funktionella experiment med patch-clamp och kolfiber tekniker.
Under de senaste två decennierna har optogenetiska verktyg etablerats som potenta medel för att modulera celltyp specifik aktivitet i retliga vävnader, inklusive hjärtat. Medan Channelrhodopsin-2 (ChR2) är ett vanligt verktyg för att depolarisera membranpotentialen i kardiomyocyter (CM), potentiellt framkalla nde potentialer (AP), ett effektivt verktyg för tillförlitlig tysta nde av CM aktivitet har saknats. Det har föreslagits att använda anjon channelrhodopsins (ACR) för optogenetisk hämning. Här beskriver vi ett protokoll för att bedöma effekterna av att aktivera den naturliga ACR GtACR1 från Guillardia theta i odlade kanin CM. Primära avläsningar är elektrofysiologiska patch-clamp inspelningar och optisk spårning av CM sammandragningar, båda utförs samtidigt tillämpa olika mönster av ljus stimulering. Protokollet omfattar CM isolering från kanin hjärta, sådd och odling av cellerna i upp till 4 dagar, transduktion via adenovirus kodning för ljus-gated klorid kanal, beredning av patch-clamp och kolfiber inställningar, datainsamling och analys. Med hjälp av patch-clamp teknik i hela cellkonfigurationen kan man spela in ljusaktiverade strömmar (i spänning-klämma läge, V-klämma) och AP (nuvarande klämma läge, I-klämma) i realtid. Förutom patch-clamp experiment, utför vi kontraktilitet mätningar för funktionell bedömning av CM aktivitet utan att störa den intracellulära miljön. För att göra detta, celler är mekaniskt förinstallerade med hjälp av kolfibrer och sammandragningar registreras genom att spåra förändringar i sarkomlängd och kolfiber avstånd. Dataanalys omfattar bedömning av AP varaktighet från I-clamp inspelningar, topp strömmar från V-clamp inspelningar och kraft beräkning från kolfiber mätningar. Det beskrivna protokollet kan tillämpas på testning av biofysiska effekter av olika optogenetiska ställdon på CM-aktivitet, en förutsättning för utveckling av en mekanistisk förståelse av optogenetiska experiment i hjärtvävnad och hela hjärtan.
ChR-medierade fotoströmmar spelades först in i ögonfläcken av encelliga gröna alger1,2. Strax efter genetisk kloning och heterolog uttryck för Klamydomonas reinhardtii ChR1 och ChR2, ChR användes som verktyg för att ändra membranpotential i Xenopus äggceller och däggdjursceller med ljus3,4. Katjon icke-selektiv ChR depolarisera membranet av celler med en vilande membran potential som är negativ till återföring potential ChR. De kan därmed användas för att framkalla AP i retliga celler, inklusive nervceller och CM, vilket möjliggör optisk pacing5,6.
Komplement till katjon ChR, ljusdriven proton, klorid och natriumpumpar7,8,9 har använts för att hämma neuronal aktivitet10,11,12. Men den senare har begränsningar, kräver höga ljusintensiteter och ihållande belysning, eftersom en jon transporteras per absorberad foton. I 2014, två oberoende studier av Wietek et al. och Berndt et al. beskrev omvandlingen av katjon-genomföra ChR till ACR via mutationer i kanalen por13,14. Ett år senare upptäcktes naturliga ACR i cryptophyte Guillardia theta (GtACR)15. Som konstruerad ACR visade kvarstående katjonresistans, ersattes de av naturliga ACR, som kännetecknas av en stor enkanalig resistans och hög ljuskänslighet15. GtACR användes för att tysta neuronal aktivitet genom att polarisera membranet potential mot återföring potential klorid16,17. Govorunova et al. appliceras GtACR1 på odlade råtta ventrikulärt CM och visade effektiv fotohämning vid låga ljusintensitetsnivåer som inte var tillräckliga för att aktivera tidigare tillgängliga hämningsverktyg, såsom protonpumpen Arch18. Vår grupp rapporterade nyligen att GtACR1-medierad fotohämning av CM är baserad på avpolbildning och att GtACR1 också kan användas, därför för optisk pacing av CM19.
Här presenterar vi ett protokoll för att studera de elektrofysiologiska och mekaniska effekterna av GtACR1 fotoaktivering på odlade kanin Ventrikulärt CM. Vi beskriver först cellisolering, odling och transduktion. Elektrofysiologiska effekter mäts med hjälp av helcells patch-clamp inspelningar. Ljusmedierade strömmar vid en given membranspänning bedöms i V-klämläge. Membranpotentialdynamikmäts medan cm med elektriskt eller optiskt tempo (I-clamp-läge). Optisk hämning av elektriskt utlöst AP testas med hjälp av ihållande ljusapplicering. Mekaniska effekter mäts med hjälp av kolfibrer i kombination med bildbaserad spårning av sarkomlängd. För att göra detta, optiskt paceable celler är mekaniskt förinstallerade genom att fästa två kolfibrer till plasmamembranet nära motsatta celländar. Sarcomere längdförändringar registreras under optisk eller elektrisk tempo. Slutligen mäts fotohämning under elektrisk fältstimulering av cellerna, och genererade krafter analyseras.
Protokollet innehåller följande steg som visas i flödesschemat i figur 1:kanindjup anestesi, tioöppnaren överdos injektion, hjärta excision, Langendorff-perfusion och vävnad matsmältning, mekanisk dissociation av vävnaden för att frigöra celler, mikroskopisk analys av CM avkastning, odling av CM, transduktion med adenovirus typ 5, följt av inkubation och funktionella experiment.
Figur 1: Flödesschema för det protokoll som används för att erhålla elektriskt och optiskt tempobart CM. Hjärtan är strukna från kaniner 9-10 veckor gammal, och hjärtvävnad smälts samtidigt som perfunderas med hjälp av en Langendorff setup. Celler frigörs av mekanisk agitation. CM-avkastningen räknas under mikroskop. CM odlas, transduced med adenovirus typ 5 och funktionella experiment utförs 48-72 timmar efter införlivandet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Optogenetiska verktyg möjliggör modulering av retlig cellelektrofysiologi på ett icke-invasivt sätt, men de behöver grundlig karakterisering i olika celltyper (t.ex. CM) för att man ska kunna välja det bästa tillgängliga verktyget för en specifik experimentell design. Patch-clamp-tekniken är en standardmetod för bedömning av cellulär elektrofysiologi. I hela cellkonfigurationen tillåter det en att spela in fotoaktiverade strömmar över plasmamembranet eller tidsmässiga förändringar i membranspänningen efter ljusstimulering/hämning. Optogenetisk manipulation av elektrisk excitation påverkar också CM sammandragningar. Vi använder sarkom spårning och kolfiber-assisterad kraft mätningar för att kvantifiera effekterna av optiska förhör på den mekaniska aktiviteten hos myocyter.
Vi beskriver ett protokoll för att karakterisera de grundläggande effekterna av en ljusgrindd kloridkanal, GtACR1, i CM. Som modellsystem valde vi kanin CM, eftersom deras elektrofysiologiska egenskaper (t.ex. AP-form och eldfast period) liknar de som observerats i mänskliga CM närmare än gnagare CM. Dessutom kankanin CM odlas i flera dagar, tillräckligt länge för adenoviral leverans och uttryck för GtACR1-eGFP. Särskilt isolerade CM ändra sina strukturella egenskaper i kulturen över tiden, inklusive avrundning av celländar och gradvis förlust av kors-strimmig, T-rörformiga system och caveolae23,24. I linje med detta har funktionella förändringar rapporterats i odlade CM: depolarisering av vilande membran potential, förlängning av AP och förändringar i cellulära Ca2 + hantering. För granskning av cellulära anpassningar i kultur, se Louch et al.25. Kompletterande figur 2 visar exemplariska AP och kontraktion mätningar av nyisolerade CM för jämförelse med dem som observerats i odlade CM(figur 6, figur 7) med hjälp av här presenterade protokollet.
Helcellsbandklämning möjliggör direkta mätningar av fotoströmsegenskaper (t.ex. amplituder och kinetik) och ljusinducerade förändringar i membranpotential eller AP-egenskaper vid hög tidsmässig upplösning. Sådana inspelningar har dock flera begränsningar: För det första ersätts cytosolet av pipettlösningen i helcellinspelningar, vilket är fördelaktigt att kontrollera joniska elektrokemiska gradienter, men har den inneboende nackdelen med att tvätta cellulära organeller, proteiner och andra föreningar, vilket kan påverka cellulära elektriska reaktioner. För det andra, biverkningar som aktivering av ytterligare jonkanaler till följd av icke-fysiologiskt lång depolarisering (t.ex. långsam tid konstanter av ljus-gated jonkanaler) är svåra att bedöma eftersom vår metod endast tillåter en att upptäcka förändringar i APD, men inte att genomföra direkta mätningar av joniska koncentrationer i elektrofysiologiskt relevanta cellfack. Detta kan göras med lysrörsindikatorer (t.ex. Ca2+ sensorer) eller jonselektiva elektroder. Ytterligare karakterisering kan omfatta ljusintensitetstitreringar, bestämning av pH-beroende, fotoströmskinetik vid olika membranpotentialer och återvinningskinetik under repetitiv ljusstimulering.
I motsats till patch-clamp inspelningar, encellig kraft mätningar möjliggör analys av cellulära sammandragningar av intakta myocyter utan att påverka deras intracellulära miljö. Sekundära effekter på jonkoncentrationer (t.ex. ca2+) kan indirekt bedömas genom att fastställa genererad kraftamplitud och dynamik (t.ex. maximal hastighet för kontraktion och avslappning; här inte analyseras). Kraftmätningar med kolfibertekniken har en fördel jämfört med fritt upphandlande celler eftersom de ger direkt information om passiva och aktiva krafter i förinstallerade celler (dvs. under förhållanden som är mer lika in situ- eller in vivo-inställningarna). Mekanisk förlastning är särskilt viktigt vid analys av cellulär kontraktilitet, eftersom stretch påverkar kraftproduktion och avkoppling26,27.
Optogenetiska metoder möjliggör spatiotemporally exakt manipulation av cellulärmembran potential, både i enstaka CM och intakt hjärtvävnad. Klassiskt har ChR2, en ljusgrindd katjon som inte selektiv kanal, använts för depolarisering av membranpotentialen, medan ljusdrivna proton- och/eller kloridpumpar användes för membranhyperpolarisering. Båda grupperna av optogenetiska ställdon kräver höga uttrycksnivåer, eftersom ChR2 kännetecknas av en egenlåg enkanalig ledningsförmåga28 och ljusdrivna pumpar transporterar maximalt en jon per absorberad foton. Dessutom kan långvarig aktivering av ChR2 i CM leda till Na+ och /eller Ca2 + överbelastning, och ljusdrivna pumpar kan ändra trans-sarcolemmal H+ eller Cl– lutningar29,30. I sökandet efter alternativa verktyg för optogenetisk kontroll av CM-aktivitet testade vi nyligen den naturliga anjonkanalenrhodopsin GtACR1, som kännetecknas av en överlägsen enkanalig konduktion och högre ljuskänslighet jämfört med katjonChR som ChR2. Vi fann att GtACR1 aktivering depolariserar CM och kan användas för optisk pacing och hämning, beroende på ljuspuls timing och varaktighet. En ytterligare fördel med att använda ACR istället för katjon ChR kan vara den mer negativa återföringspotentialen hos Cl– jämfört med Na+, vilket minskar artificiellt introducerade jonströmmar. Som vi tidigare har visat kan optisk pacing med GtACR1 leda till AP förlängning som ett resultat av den långsamma komponenten i GtACR1 kanal stängning, som kan övervinnas genom att använda snabbare GtACR1 mutanter19. Ap-förlängningen är dock mycket mindre uttalad när du använder en lägre, mer fysiologisk intracellulära Cl– koncentration (se figur 6). Dessutom resulterar GtACR1-medierad hämning av långvarig belysning i djupgående membrandepolarisering, som återigen kunde aktivera sekundära Na+ och Ca2 + tillströmning, vilket ändrar aktiviteten hos spänningsgated kanaler. I våra mätningar finner vi att AP- och kontraktionparametrar återhämtar sig till baslinjen inom 40 s efter en ljusinducerad hämning i 1 min (se Kopton et al. 2018, figur 6, figur 7). Ljusgated K+ kanaler erbjuder ett kraftfullt alternativ för att tysta CM utan att påverka CM vilomembran potential31.
I framtiden vill vi kvantitativt jämföra olika optogenetiska verktyg för deras potential att hämma hjärtaktivitet. För detta ändamål testar vi en mängd ljus-gated jonkanaler inklusive ACR, ChR2 och rödskiftade ChR varianter32, samt hyperpolariserande ställdon såsom halorhodopsin eller ljuset gated adenylyl cyklas bPAC i kombination med kaliumkanalen SthK (PAC-K)31.
Det här presenterade protokollet kan användas för djupgående karakterisering av CM:s elektromekaniska egenskaper. Det är huvudsakligen tillämpligt även på CM från andra arter, och cm isolerat från sjuka hjärtmuskeln. Optisk stimulering gör det möjligt för en att takten CM vid olika frekvenser, och olika förladdningar kan testas under kolfiber kontraktion experiment. Ett intressant experiment skulle vara att använda lågintensiv belysning för subthreshold depolarization, för att efterlikna gradvis ökning av vilomembranet potential, som kan observeras under utvecklingen av hjärtvävnad remodeling under sjukdomsprogression. Slutligen, funktionella mätningar kan kombineras med Ca2 + imaging för ytterligare insikt i excitation-kontraktion koppling, eller med farmakologiska insatser för att utvärdera effekterna av olika läkemedel på CM aktivitet.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Stefanie Perez-Feliz för utmärkt tekniskt bistånd, Dr Jonas Wietek (Humboldt-University, Berlin, Tyskland) för att tillhandahålla pUC57-GtACR1 plasmid, professor Dr Michael Schupp (Charité- Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie, Berlin) för adenovirus produktion och Dr Anastasia Khokhlova (Ural Federal University) för att dela sin expertis för att förbättra cellisoleringsprotokollet och att omforma pipette bending setuping. Projektet finansierades av Tyska forskningsstiftelsen (SPP1926: SCHN 1486/1-1; Emmy-Noeter gemenskap: SCHN1486/2-1) och ERC Advanced Grant CardioNECT.
Equipment – Cell isolation/Culturing/Transduction | |||
Adeno-X Adenoviral System 3 CMV | TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, California, USA | ||
Aortic cannula | Radnoti | 4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L mm | |
Coverslips ø 16 mm, Thickness No. 0 | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 631-0151 | Borosilicate Glass |
Griffin Silk, Black, 2 m Length, Size 3, 0.5 mm | Samuel Findings, London, UK | TSGBL3 | |
Incubator | New Brunswick, Eppendorf, Schönenbuch, Switzerland | Galaxy 170S | |
Langendorff-perfusion set-up | Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbläserei, Freiburg, Germany | Custom-made | |
Langendorff-pump | Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Zürich, Switzerland | ISM444 | |
Mesh: Nylon Monodur filter cloth | Cadisch Precision Meshes Ltd | 800 µm holes, 1 m wide | |
Neubauer chamber | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 717806 | |
Rabbit, New Zealand White | Charles River | Strain Code: 052 | |
Scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BC774R | Bauchdeckenschere ger. 18cm |
Sterile filter, 0.22 µm | Merck, Darmstadt, Germany | SLGP033RB | |
Equipment – Patch-clamp | |||
Amplfier | AxonInstruments, Union City, CA, United States | Axopatch 200B | |
Coverslip ø 50 mm, Thickness No. 1 | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 631-0178 | Borosilicate Glass |
Digitizer Axon Digidata | Molecular Devices, San José, CA, United States | 1550A | |
Filter (530/20) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513878 | BZ:00 |
Filter (630/20) | Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States | 227155 | |
Headstage | AxonInstruments, Union City, CA, United States | CV203BU | |
Interface | Scientifica, Uckfield, UK | 1U Rack, 352036 | |
LED 525 nm | Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States | PT-120-G | |
LED control software | Essel Research and Development, Toronto, Canada | ||
LED control system | custom-made | ||
Micropipette Puller | Narishige Co., Tokyo, Japan | PP-830 | |
Microscope inverted | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI4000B | |
Motorised Micromanipulator | Scientifica, Uckfield, UK | PatchStar | |
Optical power meter | Thorlabs, Newton, NJ, United States | PM100D | |
Silicone Grease | RS Components, Corby, UK | 494-124 | |
Silver wire | A-M Systems, Sequim, WA, United States | 787500 | Silver, Bare 0.015'', Coated 0.0190'', Length 25 Feet |
Soda lime glass capillaries | Vitrex Medical A/S, Vasekaer, Denmark | 160213 BRIS, ISO12772 | 1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm |
Software Axon pClamp | Molecular Devices, San José, CA, United States | Version 10.5 | |
Software MatLab2017 | The MathWorks, Inc. | ||
Stage micrometer | Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK | 1 mm | |
Equipment – Carbon fiber | |||
Carbon fibers | provided from Prof. Jean-Yves Le Guennec | BZ:00 | |
Digitizer Axon Digidata | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, United States | 1550B | |
Filter (530/20) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513878 | |
Filter (630/20) | Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States | 227155 | |
Fluorescence System Interface | IonOptix, Milton, MA United States | FSI-800 | 2.0 OD x 1.16 ID x 100 L mm |
Force Transducer System | Aurora Scientific Inc., Ontario, Canada | 406A | |
Glass capillaries for force measurements | Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, United States | GC200F-10 | |
Interface National Instruments | National Instruments, Budapest, Hungary | BNC-2110 | |
LED 525 nm | Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States | PT-120-G | |
LED control box | Essel Research and Development, Toronto, Canada | ||
LED control system | custom-made | ||
Microcontroller | Parallax Inc., Rocklin, California, United States | Propeller | |
Micropipette Puller | Narishige Co., Tokyo, Japan | PC-10 | |
Microscope inverted | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI4000B | |
MyoCam-S camera | IonOptix, Dublin, Ireland | ||
MyoCam-S camera Power | IonOptix, Milton, MA, United States | MCS-100 | |
MyoPacer Field Stimulator | IonOptix Cooperation, Milton, MA, United States | MYP100 | |
Piezo Motor | Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | E-501.00 | |
Silicone Grease | RS Components, Corby, UK | 494-124 | |
Software Axon pClamp | Molecular Devices, San José, CA, United States | Version 10.5 | |
Software IonWizard | IonOptix, Dublin, Ireland | Version 6.6.10.125 | |
Software MatLab2017 | The MathWorks, Inc. | ||
Stage micrometer | Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK | 1 mm | |
Chemicals | |||
Adenosine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A9251-100G | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A7030-50G | |
CaCl2 | Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA | 21114-1L | |
L-Carnitine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C9500-25G | |
Collagenase type 2, 315 U/mg | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS004177 | |
Creatine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C0780-50G | |
Cytosine-β-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C1768-100MG | |
EGTA | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 3054.3 | |
Esketamine hydrochloride, Ketanest S 25 mg/mL | Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlin, Germany | PZN-07829486 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | F9665 | |
Gentamycin 50 mg/mL | Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA | 15750-037 | |
Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | G7021-1KG | |
Heparin-Sodium, 5,000 IU/mL | Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | PZN-03029843 | |
HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | H3375-1KG | |
Insulin (bovine pancreas) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | I6634-50MG | |
K-aspartate | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A6558-25G | |
KCl | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 26764.260 | 1 mg/mL |
KOH | Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA | 35113-1L | |
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | L2020-1MG | |
M199-Medium | Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, United States | M4530 | |
Mg-ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A9187-1G | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 63069-500ML | |
NaCl | Fisher Scientific, Loughborough, Leics., UK | 10428420 | |
NaCl-Solution 0.9%, Isotone Kochsalz-Lösung 0.9% | Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 3200950 | |
NaOH | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A6579 | without Ca2+/Mg2+ |
Na-pyruvat | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | P2256-100MG | |
Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | D1408-500ML | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma, Poole, UK | 192066 | |
Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | P5147-1G | |
Taurine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | T0625-500G | |
Thiopental Inresa 0.5 g | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | PZN-11852249 | |
Xylazine hydrochloride, Rompun 2% | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | PZN-01320422 |