Forhøjede spinal Fluid protein niveauer kan enten være resultatet af diffusion af plasmaprotein på tværs af en ændret blod-hjerne barriere eller Intratekal syntese. En optimeret testprotokol er præsenteret i denne artikel, der hjælper med at diskriminere begge tilfælde og giver kvantitative målinger af intratekalt syntetiserede proteiner.
Cerebrospinalvæske (CSF), en væske, der findes i hjernen og rygmarven, er af stor betydning for både grundlæggende og klinisk videnskab. Analysen af CSF protein sammensætning leverer afgørende oplysninger i grundlæggende neurovidenskab forskning samt neurologiske sygdomme. En advarsel er, at proteiner målt i CSF kan stamme fra både Intratekal syntese og transudation fra serum, og proteinanalyse af CSF kan kun bestemme summen af disse to komponenter. At skelne mellem protein transudation fra blodet og intrathecalt producerede proteiner i dyremodeller såvel som hos mennesker CSF protein profilering målinger ved hjælp af konventionelle proteinanalyse værktøjer skal omfatte beregning af albumin CSF/serum kvotient (Qalbumin), en markør for integriteten af blod-hjerne-grænsefladen (BBI), og protein indekset (qprotein/qalbumin), et estimat af Intratekal proteinsyntese. Denne protokol illustrerer hele proceduren, fra CSF og blodindsamling til kvotienter og indekser beregninger, til kvantitativ måling af Intratekal proteinsyntese og BBI svækkelse i musemodeller af neurologiske lidelser.
Cerebrospinalvæske (CSF), en klar og farveløs væske omkring hjernen og rygmarven, besidder stor klinisk og grundlæggende videnskabelig betydning. CSF bevarer det elektrolytiske miljø i centralnervesystemet (CNS), afbalancerer systemisk syre-base status, leverer næringsstoffer til neuronal og gliaceller celler, fungerer som et lymfesystem for CNS, og transporterer hormoner, neurotransmittere, cytokiner og andre neuropeptider i hele CNS1. Således, som CSF sammensætningen afspejler aktiviteten af CNS, denne væske tilbyder en værdifuld, men indirekte, adgang til at karakterisere den fysiologiske og patologiske tilstand af CNS.
CSF er blevet brugt til at diagnosticere forhold, der påvirker CNS i over hundrede år, og for det meste af denne tid, det blev primært undersøgt af klinikere som et diagnostisk værktøj. Men, i de seneste år Neuro biologer har erkendt potentialet i CSF for at studere Patofysiologi af CNS. Især er der blevet introduceret adskillige proteinanalyse værktøjer med høj kapacitet i neurovidenskabens rige, som giver mulighed for en detaljeret undersøgelse af EFSR’S protein sammensætning med forventning om, at denne analyse kan bidrage til at give indsigt i de dynamiske ændringer opstår inden for CNS.
Teknologisk udvikling i multiplex immunassay teknikker som Luminex og Simoa Technologies2,3, giverforskerne i dag mulighed for at detektere hundredvis af proteiner ved meget lave koncentrationer. Desuden gør de samme teknologier det muligt at anvende små stikprøve mængder, hvilket fremmer undersøgelser af små dyr, herunder mus, hvor begrænsede prøvevolumener af CSF har forhindret detaljerede beskrivelser af væsken indtil for nylig.
Ikke desto mindre er en advarsel, at proteiner målt i CSF kan stamme fra intratalsyntese og/eller transudation fra serum på grund af en beskadiget blod-hjerne grænseflade (BBI). Desværre, proteinanalyse af CSF alene kan kun bestemme summen af disse to komponenter. For at skelne mellem transudat og intrathecalt producerede proteiner skal CSF-protein målinger ved hjælp af et tilgængeligt proteinanalyse værktøj justeres for individuel variation i serumkoncentrationer samt barriere integritet. Men selv om denne justering er almindeligt anvendt i klinisk praksis, f. eks, CSF IgG indeks, som har høj følsomhed for påvisning Intratekal IgG syntese4,5,6, til dato meget få undersøgelser har korrigeret CSF proteinkoncentrationer for serumkoncentration og barriere integritet7,8.
I øjeblikket reibergram tilgang er den bedste måde at bestemme barriere funktion og Intratekal syntese af proteiner. Det er en grafisk evaluering i CSF/serum kvotient diagrammer, som analyserer, på en integreret måde, både barriere (dys) funktion og Intratekal proteinsyntese, der refererer til en udelukkende blod-afledte protein9,10. Det meget rigelige protein albumin er normalt valgt som referenceprotein, fordi det kun produceres i leveren, og fordi dets størrelse, ca. 70 kDa, er mellemliggende mellem små og store proteiner11. Analysediagrammet blev først defineret af Reiber og Felgenhauer i 1987 for de store klasser af immunglobuliner (IGS)11, der er empirisk baseret på resultaterne fra analysen af tusinder af humane prøver9. Tilgangen blev efterfølgende bekræftet af anvendelsen af de to Fick’s diffusions lovgivning i teorien om Molekylær diffusion/strømningshastighed12. En sådan teori demonstrerer diffusion af et protein gennem barrieren har en hyperbolske fordeling og kan kvantitativt forklare dynamikken i proteiner i CNS9,13. Samlet, fordelen ved at bruge reibergram til påvisning Intratekal proteinsyntese er, at det samtidig identificerer proteinfraktionen, der kommer ind i CSF fra serum samt mængden af protein fundet i CSF på grund af lokal produktion.
Denne artikel og den tilhørende protokol beskriver hele proceduren, fra CSF og blod opsamling til de endelige beregninger korrigere CSF protein niveauer, for den kvantitative måling af intratalprotein syntese i musemodeller af neurologiske Lidelser. Denne procedure giver en baseline for at vurdere (1) den patofysiologiske oprindelse af enhver CSF protein og (2) stabiliteten og funktionelle betydning af barrieren integritet. Denne procedure og protokol er ikke kun nyttige til at vurdere mus CSF prøver, men er også nyttige i at analysere CSF i en lang række dyremodeller af neurologiske sygdomme og humane patienter.
Kvantitative metoder til evaluering af øgede CSF proteinkoncentrationer er nyttige værktøjer i karakterisering af den fysiologiske og patologiske tilstand af CNS. Men ud over pålidelig kvantificering af CSF protein niveauer, påvisning af CSF proteiner kræver et udtryk for resultater, der diskriminerer mellem blod-og CNS-afledte fraktioner i CSF. Men til dato, de almindeligt anvendte protein kvantificering assays ikke tillader diskrimination mellem de to protein komponenter, selv ved hjælp af High-gennemløb værkt…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker personalet i Center for sammenlignende medicin og forskning (CCMR) på Dartmouth for deres ekspert pleje af de mus, der anvendes til disse undersøgelser. Bornsteins forskningsfond finansierede denne forskning.
1 mL insulin syringe | BD | 329650 | |
1 mL syringe | BD | 329622 | |
25 gauge needle | BD | 305122 | |
3 mL syringe | BD | 309582 | |
30 gauge insulin needle | BD | 305106 | |
Absorbent pads | Any suitable brand | ||
Acepromazine | Patterson Vet Supply Inc | ||
BioPlex Handheld Magnetic Washer | BioRad | 171020100 | Magnet |
BioPlex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad | 171015001 | |
BioPlex Pro Flat Bottom Plates | BioRad | 171025001 | |
Biotinilated detection antibody | Any suitable source | The antibody has to be directed against the species of the protein of interest. | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
Buprenorphine hydrochloride | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
Capillary Tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller. |
Centrifuge tube, 0.2 mL | VWR | 20170-012 | |
Centrifuge tube, 0.5 mL | VWR | 87003-290 | |
Centrifuge tube, 1.5 mL | VWR | 87003-294 | |
Chlorhexidine diacetate | Nolvasan | E004272 | |
Disposable pipettes tips | Any suitable brand | ||
Ear bars | KOPF Instruments | 1921 or 1922 | |
Ethanol | Kopter | V1001 | |
Freezer | VWR | VWR32086A | |
Gauze | Medline | NON25212 | |
Heating pad | Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch | |
Induction Chamber | VETEQUIP | ||
Isoflurane | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
Ketamine (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
MagPlex Microspheres (antibody-coupled) | BioRad | Antibody-coupled magnetic bead | |
Microplate Shaker | Southwest Scientific | SBT1500 | |
Microretractors | Carfill Quality | ACD-010 | Blunt – 1 mm |
Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids. |
Mouse Albumin capture ELISA kit | Novus Biological | NBP2-60484 | Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids. |
Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000060 | |
Non-Sterile swabs | MediChoice | WOD1002 | Need to be autoclaved for sterility |
Oxygen | AIRGAS | OX USPEA | |
Pasteur Pippettes | Fisher | 13-678-20A | 5 & 3/4" |
PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Reverse Cutting, 18" |
PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
Pipetters | Eppendorf | Research seriers | |
Polyethylene tubing | |||
Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
Scale | Uline | H2716 | |
Scalpel | Feather | EF7281 | |
Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
Standard proteins | Any suitable source | The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest. | |
Stereotaxic instrument | KOPF Instruments | Model 900LS | Standard Accessories |
Sterile 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
Sterile saline | Baxter | 0338-0048-02 | 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP |
Surgical Forceps Curved, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Stainless 25x |
Vaporizer + Flow meter | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
Warming pad | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
Water Sonicator | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |