Summary
Den presenterte protokollen bruker flyt cytometri for å kvantifisere antall spre og døde celler i kultiverte mus enteroider. Denne metoden er nyttig for å evaluere effekten av medikamentell behandling på organoid spredning og overlevelse.
Abstract
Tarmepitelet fungerer som en barriere som forhindrer luminalt innhold, som patogen mikrobiota og toksiner, fra å komme inn i resten av kroppen. Epitelbarrierefunksjon krever integriteten til intestinale epitelceller. Mens epitelcellespredning opprettholder et kontinuerlig lag med celler som danner en barriere, fører epitelskade til barrieredysfunksjon. Som et resultat kan luminalt innhold over tarmbarrieren via en ubegrenset vei. Dysfunksjon av tarmbarrieren har vært forbundet med mange tarmsykdommer, som inflammatorisk tarmsykdom. Isolerte musetarmkrypter kan dyrkes og opprettholdes som krypt-villus-lignende strukturer, som kalles tarmorganoider eller "enteroider". Enteroider er ideelle for å studere spredning og celledød av intestinal epitetialceller in vitro. I denne protokollen beskriver vi en enkel metode for å kvantifisere antall proliferative og døde celler i kultiverte enteroider. 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) og propidium jodid brukes til å merke prolifererende og døde celler i enteroider, og andelen av prolifererende og døde celler analyseres deretter ved flyt cytometri. Dette er et nyttig verktøy for å teste effekten av legemiddelbehandling på intestinal epitelcellespredning og celleoverlevelse.
Introduction
En grunnleggende funksjon av intestinal epitetialceller er å beskytte oppføring av luminal innhold som patogene bakterier og giftstoffer1,2. For å utføre en slik funksjon sprer tarmstamceller kontinuerlig og differensierer seg til en rekke epitelceller, inkludert enterocytter og sekretoriske celler, som danner en barriere ved å danne stramme forbindelser3. Den raske fornyelsen av intestinale epitelceller krever streng koordinering av cellespredning, celledifferensiering og celledød4,5. Redusert cellespredning eller overdreven celledød fører til epitelskade og kompromittert barrierefunksjon1,6. Dysfunksjon av tarmbarrieren har vært forbundet med inflammatoriske tarmsykdommer7,8.
En metode for å kultur tarm krypter har tidligere blitt utviklet. Ved hjelp av denne teknikken vokser isolerte musekrypter til tarmorganoider (enteroider), som har krypt-villus som strukturer og inneholder alle intestinal epitetial celle avstamning9,10. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) er en tymidin analog som er i stand til å erstatte dinmin (T) i DNA som gjennomgår replikering under cellespredning. De proliferative cellene kan raskt og nøyaktig merkes av EdU-farging. Propidium jodid (PI) er en analog av ethidium bromid som frigjør rød fluorescens ved innsetting i dobbelt-strandet DNA. PI oppdager spesifikt døde celler, siden den bare passerer gjennom den skadede cellemembranen.
I denne protokollen beskriver vi først hvordan man isolerer krypter fra murine tynntarmen og deretter kultur dem som enteroider in vitro. Vi beskriver deretter hvordan du analyserer de proliferative og døde cellene i enteroider av EdU og PI inkorporering og flyt cytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen ble godkjent av Animal Care and Use Committee of Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) ved Soochow University.
1. Intestinal organoid isolasjon og kultur
- Isolering av tarmkrypter og enteroid kultur
- Euthanize en 8 uker gammel vill-type mus med CO2 innånding. Bruk vevtang og fin irissaks for å dissekere ut ca. 8 cm ileum.
- Skyll ut med en sprøyte med gavage fôring nål med ca 40 ml iskald Dulbeccofosfat-bufret saltvann (DPBS), deretter kuttet på langs med saks og åpne ileum.
- Skjær ileumet i små (0,5−1,0 cm) stykker. Plasser bitene i 5 ml steril iskald DPBS i et 15 ml konisk rør, og stein deretter i 5 min på is.
- Bruk en pipettekontroller til å aspirere DPBS og erstatte den med 10 ml kald buffer 1 (2 mM EDTA i DPBS). Stein i 30 min på is.
- Bruk pipetteregulatoren til å aspirere buffer 1 og erstatt med 10 ml kald buffer 2 (54,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM sukrose i DPBS). Rist i 2-3 min for hånd (~ 80 rister / min).
- Ta en 20 μL dråpe buffer 2 innhold etter risting og inspiser under et mikroskop.
- Filterbuffer 2 innhold med en 70 μm steril cellesil, og samle deretter den filtrerte bufferen med et 50 ml konisk rør.
- Pipette 20 μL filtrate på lysbildet for å telle kryptene. Overfør et tilstrekkelig volum av buffer 2 fra trinn 1.1.7 for å sikre at det er ~ 500 krypter / brønn.
- Spin ned ved 150 x g i 10 min ved 4 °C. Når spinning er ferdig, forsiktig aspirer supernatant.
- Heng krypter i 50 μL kjellermembranmatrise (f.eks. Matrigel) per 500 krypter, pipette opp og ned (vær forsiktig med å unngå bobler), og plasser deretter en 50 μL dråpe kjellermembranmatrise/kryptblanding i midten av en brønn i en 24-brønnplate. Inkuber i 30 min ved 37 °C for å polymerisere kjellermembranmatrisen.
- Etter 30 min polymerisering, legg forsiktig til 600 μL minigut media (avansert Dulbecco modifisert Eagle medium [DMEM]/F12, 2 mL-alanine-L-glutamin, penn / strep [100 enheter / ml], 10 mM Hepes, N2 supplement [1:100], B27 supplement [1:50] med epidermal vekstfaktor [EGF; 50 ng/ml], Noggin [100 ng/ml], R-spondin [500 ng/ml], og Y27632 [10 μM]) til hver brønn, og returner deretter platen til 37 °Cintor. Vær oppmerksom på under et mikroskop hver dag, og endre mediene hver 2-3 dager.
- Enteroid passaging
MERK: For lange kulturer bør enteroider deles omtrent hver uke.- For å passere enteroider, plasser vevkulturplaten på is. Aspirer media og legg til 1 ml kald DPBS til hver brønn. Bruk en P1000-spiss til å pipette opp og ned til det ikke gjenstår noen solide matrisebiter i kjelleren.
- Pass opp og ned én gang gjennom en 1 ml insulinsprøyte (27 G) og inn i et 15 ml konisk rør. Spin ned i 5 min ved 150 x g ved 4 °C.
- Bruk pipette til å fjerne DPBS. Resuspender i 50 μL kjellermembranmatrise/brønn.
- Plasser platen i en 37 °C inkubator i 30 min for å tillate kjellermembranmatrise å polymerisere. Overlegg hver brønn med 600 μL ENR media (minigut media, 50 ng /ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin), og returner deretter platen til inkubatoren.
2. Flow Cytometri Analyse av EdU-positive celler i Enteroider
MERK: Figur 1 viser arbeidsflyten for flytcytometrianalyse av EdU-positive celler i enteroider.
- Inkubasjon av enteroider med EdU
- Øk enteroider fra trinn 1.2.4 i 5–7 dager. Passasje enteroider i en ny 24 brønnplate i et kløyveforhold på 1:2. Tilsett 600 μL ENR medium til hver brønn. Inkubatenteroider i 4–5 dager i en 37 °C inkubator.
- Angi kontrollgruppen (ubehandlede enteroider) og eksperimentell gruppe (enteroider behandlet med 5 ng/ml interleukin 22 [IL-22]). Forbered minst tre replikeringer for hver gruppe.
- Tilsett EdU til ENR-mediet for å forberede EdU-mediet med en konsentrasjon på 50 μM. Tilsett 600 μL EdU medium til hver brønn og inkubator i 2 timer i en 37 °C inkubator. Sett en brønn av enteroider uten EdU-behandling som en negativ kontroll for bakgrunnssubtraksjon.
- Høsting av enteroider fra kjellermembranmatrise
- Bruk en pipettekontroller til å aspirere EdU medium og vask 1x med DPBS. Tilsett 1 ml DPBS.
- Bruk P1000 pipettespiss og pipette opp og ned til det ikke gjenstår noen solide matrisebiter i kjelleren. Overfør til et 15 ml rør og snurr ned ved 300 x g i 5 min. Kast supernatanten.
- Tilsett 500 μL celle-dissosiasjonenzymer (Materialtabell) og inkuber i 15 min ved 37 °C. Bruk P200 pipettespiss og pipette opp og ned for å bryte enteroider i enkeltceller.
- Tilsett 3 ml DMEM medium som inneholder 10% føtal storfe serum (FBS) og gjentatte ganger pipette med en P1000 pipette spiss.
- Spinn ned på 300 x g i 5 min og aspirere supernatant mediet. Resuspender cellene med 1 ml DPBS.
- Fiksering og permeabilisering av celler
- Overfør cellesuspensjonen til et 1,5 ml rør, spin ned ved 300 x g i 5 min, og kast supernatanten.
- Resuspendceller med 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA), fest for 15 min ved romtemperatur (RT), og spinn ned ved 300 x g i 5 min. Aspirer supernatanten med pipettespiss, vask 1x med DPBS, og spinn ned for å fjerne supernatanten.
- Resuspender celler med 1 ml 0,5 % nonionisk overflateaktivt middel. Inkuber i 10 min på RT.
- Spinn ned på 300 x g i 5 min og aspirer supernatanten. Vask 1x med DPBS og spinn ned for å fjerne supernatanten.
- Påvisning av EdU
- Forbered lagerløsninger for hver komponent på forhånd: 1) arbeidsløsning av Alexa Fluor azide, 2) arbeidsløsning av 1x EdU reaksjonsbuffer og 3) 10x lagerløsning av EdU buffer additiv.
- Forbered 1x EdU-buffertilsetningsstoffet ved å fortynne 10x-oppløsningen 1:10 i deionisert vann. Forbered denne løsningen frisk.
- Forbered reaksjonscocktailen i henhold til tabell 1.
MERK: Legg til ingrediensene i rekkefølgen som er oppført i tabellen. Bruk reaksjonscocktailen innen 15 minutter etter forberedelse. - Tilsett 100 μL reaksjonscocktailer til hvert 1,5 ml rør. Resuspender cellene, beskytt mot lys, inkuber i 30 min ved RT.
- Sentrifuge ved 300 x g i 5 min og aspirere reaksjonsløsningen med pipettespissen forsiktig.
- Tilsett 0,5% nonionic overflateaktivt anrant til hvert rør for å vaske 1x ved RT. Sentrifuge ved 300 x g i 5 min, aspirer supernatanten med pipettespiss forsiktig, og resuspender cellene i 1 ml DPBS.
- Analyse av celler etter flytcytometri
- Filtrer de resuspenderte cellene med en 40 μm sil, og samle deretter de filtrerte cellene med et 15 ml konisk rør. Utfør FACS på maskinen deteksjon så snart som mulig.
MERK: Hvis forholdene er begrenset, bør de cellefargede prøvene lagres i mørket ved 4 °C og strømningstestet innen 3 dager. - Velg riktig kanal (i henhold til typen Alexa Fluor azide i EdU-settet, her, rød kanal) og spenning (her, ~ 150–350 V) for flytcytometrianalyse.
- Gating strategi
- Tegn en FSC-A (x-akse) vs. SSC-A (y-akse) pseudocolor plott og distribuere de fleste cellene til det synlige området av punktkartet ved å justere spenningen. Merk cellepopulasjonen (R1) og ekskluder celleavfallet nederst til venstre.
- Fra R1-cellepopulasjonen oppretter du en FSC-A (x-akse) vs. FSC-H (y-akse) pseudocolor plot, og angi porten til å velge enkeltceller (R2) for å utelukke celleklumper.
- Fra R2 cellepopulasjonen, etablere fluorescens intensitet (x-akse) vs. cellenummer (y-akse) plott, og bruk den negative kontrollen til å stille inn porten. Regionen av fluorescerende signal er et positivt celleområde (R3). Sammenlign forholdet mellom EdU-positive celler (R3) mellom eksperimentelle og kontrollgrupper.
- Filtrer de resuspenderte cellene med en 40 μm sil, og samle deretter de filtrerte cellene med et 15 ml konisk rør. Utfør FACS på maskinen deteksjon så snart som mulig.
3. Flow Cytometri Analyse av PI-positive celler i Enteroids
MERK: Figur 2 viser arbeidsflyten for flytcytometrianalyse av PI-positive celler i enteroider.
- Inkubasjon av enteroidceller med PI
- Øk enteroider fra trinn 1.2.4 i 5–7 dager. Passasje enteroider i en ny 24 brønnplate i et kløyveforhold på 1:2. Tilsett 600 μL ENR medium til hver brønn. Inkubatenteroider i 4–5 dager i en 37 °C inkubator.
- Angi kontrollgruppen (ubehandlet) og eksperimentell gruppe (IL-22 behandlet), ved hjelp av minst tre replikeringer for hver gruppe.
- Tilsett PI til ENR-mediet for å forberede PI-medium med en konsentrasjon på 3 μM.
- Tilsett 600 μL PI medium til hver brønn og inkubator i 30 min i en 37 °C inkubator. Sett en brønn av enteroider uten PI-behandling som en negativ kontroll for bakgrunnssubtraksjon.
- Høst enteroider fra kjellermembranmatrise etter trinn 2.2.1−2.2.5.
- Analyse av celler etter flytcytometri
- Filtrer de resuspenderte cellene med en 40 μm sil og samle de filtrerte cellene med et 15 ml konisk rør.
- Utfør FACS på maskinen deteksjon så snart som mulig.
MERK: Hvis forholdene er begrenset, bør de cellefargede prøvene lagres i mørket ved 4 °C og strømningstestet innen 3 dager. - Velg riktig kanal (her, rød kanal) og spenning (her, ~ 150-350 V) for flyt cytometri analyse.
- Bruk samme gatingstrategi som beskrevet i pkt. 2.5.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Små tarmkrypter ble isolert og dyrket som enteroider i kjellermembranmatrisen. Enteroider begynte å danne knopper 2 dager etter isolasjon. På dag 6 hadde enteroider mange knopper med mye rusk (døde celler) i lumen. Enteroider var klare til å bli passasjer på dette stadiet (Figur 3).
Tallrike studier har vist at inflammatoriske cytokiner er avgjørende for vedlikehold av intestinal epitelial homeostase. Unormalt uttrykk for inflammatoriske cytokiner er nært forbundet med forekomsten av inflammatoriske tarmsykdommer11. For eksempel viste vår tidligere studie at IL-22 fremmer spredning av transittforsterkende celler, men også utarmer Lgr5+ stamceller12.
Enteroider ble behandlet med IL-22 i 3 dager, hvorpå det syntetiske DNA ble merket med EdU for å indikere cellespredning. IL-22-behandlede enteroider viste et økt antall EdU+ celler (Figur 4A). IL-22 økte prolifererende celler fra 40,1% til 83,5% som analysert av flytcytometri (Figur 4B). IL-22 behandling økte også celledød i enteroider, indikert av PI-farging (figur 5A). IL-22 økte døde celler fra 4,9% til 16,2% som analysert av flow cytometri (Figur 5B).
Figur 1: Arbeidsflytdiagram for flytcytometrianalyse av EdU-positive celler i enteroider. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Arbeidsflytdiagram for flytcytometrianalyse av PI-positive celler i enteroider. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Brightfield bilder av enteroider på 2, 4 og 6 dager etter krypt isolasjon. Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: IL-22 øker enteroider spredning. (A) Enteroider ble dyrket i medium uten eller med IL-22 (5 ng / ml) i 3 dager og inkubert med EdU (rød) i 1 t. Skala bar = 100 μm. (B) Flyt cytometridata fra enteroider dyrket uten (venstre) eller med (høyre) IL-22. Data er representative for tre separate eksperimenter. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 5: IL-22 fremmer celledød i enteroider. (A) Enteroider ble dyrket i medium uten eller med IL-22 (5 ng / ml) i 3 dager og farget med propidiumjodid (rød). Skala bar = 100 μm. (B) Flyt cytometridata fra enteroider dyrket uten (venstre) eller med (høyre) IL-22. Data er representative for tre separate eksperimenter. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| Reaksjonskomponenter | Antall brønner på 24-brønnplater | |||||
| 1 | 2 | 5 | 10 | 20 | 50 | |
| 1x Reaksjonsbuffer | 86 μL | 172 μL | 430 μL | 860 μL | 1,72 μL | 4,3 μL |
| CuSO4 (Andre) | 4 μL (4 μL) | 8 μL (8 μL) | 20 μL (20 μL) | 40 μL | 80 μL | 200 μL |
| Alexa Fluor azide | 0,25 μL | 0,5 μL | 1,25 μL | 2,5 μL | 5 μL (5 μL) | 12,5 μL |
| Tilsetningsstoff for reaksjonsbuffer | 10 μL (10 μL) | 20 μL (20 μL) | 50 μL (50 μL) | 100 μL | 200 μL | 500 μL |
| Totalt volum | 100 μL | 200 μL | 500 μL | 1 μL | 2 μL (2 μL) | 5 μL (5 μL) |
| MERK: Legg til ingrediensene i rekkefølgen som er oppført i tabellen. | ||||||
Tabell 1: EdU reaksjon cocktail.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver trinnene som er nødvendige for kulturen av enteroider in vitro og kvantifisering av EdU- og PI-positive celler i enteroider ved flyt cytometri. Det er flere fordeler med denne strategien. Først brukes EdU-merking til å oppdage prolifererende celler i enteroider. Sammenlignet med tradisjonell BrdU-analyse er EdU-merkingsmetoden raskere, mer følsom og mer nøyaktig. EdU er svært lik thymine (T), som erstatter dinin i DNA-syntese under celledeling. Sammenlignet med BrdU antistoff, Er EdU lettere å spre seg inn i cellen, og påvisning av EdU krever ikke DNA denatureation og en antigen-antistoff reaksjon. For det andre kan flow cytometrianalyse raskt og nøyaktig kvantifisere proliferering (EdU+) og døde (PI+) celler i enteroider.
For å utføre hele prosedyren, er det kritiske aspekter som skal vurderes. For det første er det viktig å kultur enteroider under tilstrekkelige forhold. Godt dyrkede enteroider bør ha mange knopper, som inneholder proliferative celler. For det andre er det viktig å dele enteroider i tide. Rusk akkumulert i lumen inneholder døde celler, som kan være farget med PI. Dette er skadelig for følgende flow cytometrianalyse. For det tredje, på grunn av flere trinn (dvs. cellefarging, cellefiksering, membranbrudd og sentrifugering), kan cellene lett gå tapt under prosedyren. Dermed er det viktig å samle et tilstrekkelig antall enteroider. Det er viktig å kombinere 2-3 brønner (i en 24 brønnplate) enteroider før fiksering. Til slutt er det viktig å legge til ingredienser i bufferen for å oppdage EdU, ellers vil reaksjonen ikke fortsette optimalt.
Oppsummert, protokollen detaljer trinn for kuling av mus enteroider in vitro og kvantifisering av spredning og døde celler ved flyt cytometri. Enteroider er nyttige verktøy for sykdomsmodellering og terapeutisk legemiddeloppdagelse. Denne protokollen hjelper utforskning av effekten av inflammatoriske cytokiner, patogenogen og legemidler på cellespredning og celleoverlevelse i enteroidkulturmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av The National Natural Science Foundation of China (31971062, 31900326 og 31601022), The Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190043, BK20180838), Research Fund of State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Nanjing Universitet (KF-GN-202004). Natural Science Foundation av Jiangsu Higher Education Institutions of China (19KJB320003), Levebrød og teknologi program av Suzhou City (SYS2019030), og The Research Innovation Program for College Graduates of Jiangsu-provinsen (KYCX19-1981) . Dette arbeidet støttes også av Tang Scholar of Soochow University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).
- Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
- Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
- Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).
