Summary
O protocolo apresentado utiliza citometria de fluxo para quantificar o número de células proliferantes e mortas em enteróides de camundongos cultivados. Este método é útil para avaliar os efeitos do tratamento medicamentoso sobre a proliferação organoide e a sobrevivência.
Abstract
O epitélio intestinal atua como uma barreira que impede a entrada de conteúdo luminal, como microbiota patogênica e toxinas, de entrar no resto do corpo. A função da barreira epitelial requer a integridade das células epiteliais intestinais. Enquanto a proliferação de células epiteliais mantém uma camada contínua de células que forma uma barreira, danos epiteliais levam à disfunção da barreira. Como resultado, o conteúdo luminal pode atravessar a barreira intestinal através de uma via irrestrita. A disfunção da barreira intestinal tem sido associada a muitas doenças intestinais, como doença inflamatória intestinal. As criptas intestinais de camundongos isolados podem ser cultivadas e mantidas como estruturas semelhantes a criptografia, que são chamadas de organoides intestinais ou "enteróides". Os enteróides são ideais para estudar a proliferação e a morte celular de células epiteliais intestinais in vitro. Neste protocolo, descrevemos um método simples para quantificar o número de células proliferativas e mortas em enteróides cultivados. 5-etilôndeus-2'-desoxuridina (EdU) e iodeto de propídio são usados para rotular células proliferantes e mortas em enteróides, e a proporção de proliferação e células mortas são então analisadas por citometria de fluxo. Esta é uma ferramenta útil para testar os efeitos do tratamento medicamentoso na proliferação de células epiteliais intestinais e na sobrevivência celular.
Introduction
Uma função fundamental das células epiteliais intestinais é proteger a entrada de conteúdos luminários como bactérias patogênicas e toxinas1,2. Para realizar tal função, as células-tronco intestinais proliferam e se diferenciam continuamente em uma variedade de células epiteliais, incluindo enterócitos e células secretas, que formam uma barreira formando conexões apertadas3. A rápida renovação das células epiteliais intestinais requer coordenação rigorosa da proliferação celular, diferenciação celular e morte celular4,5. A redução da proliferação celular ou a morte celular excessiva leva a danos epiteliais e a função de barreira comprometida1,6. A disfunção da barreira intestinal tem sido associada a doenças inflamatórias intestinais7,8.
Um método para cultivar criptas intestinais foi desenvolvido anteriormente. Usando essa técnica, as criptas de camundongos isolados crescem em organoides intestinais (enteróides), que possuem criptosas como estruturas e contêm toda a linhagem celular epitelial intestinal9,10. 5-Etilnyl-2'-deoxyuridina (EdU) é um analógico de timmidina capaz de substituir a timina (T) no DNA que está passando por replicação durante a proliferação celular. As células proliferativas podem ser rotuladas de forma rápida e precisa pela coloração de EdU. Propidium iodeto (PI) é um análogo de brometo de etídio que libera fluorescência vermelha após inserção em DNA de dupla cadeia. Pi detecta especificamente células mortas, uma vez que só passa pela membrana celular danificada.
Neste protocolo, primeiro descrevemos como isolar criptas do intestino delgado murina e depois cultimá-las como enteróides in vitro. Descrevemos então como analisar as células proliferativas e mortas em enteróides por incorporação e citometria de fluxo da EdU e PI.
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Protocol
Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) na Universidade Soochow.
1. Isolamento organoide intestinal e cultura
- Isolamento das criptas intestinais e da cultura enteróide
- Eutanize um rato selvagem de 8 semanas com inalação de CO2. Use fórceps de tecido e tesouras de íris finas para dissecar aproximadamente 8 cm de ileum.
- Saia usando uma seringa com agulha de alimentação de gavage com cerca de 40 mL de soro soro tampão de fesfato frio (DPBS), em seguida, corte longitudamente com tesouras e abra o íleum.
- Corte o ileum em pequenas peças (0,5-1,0 cm). Coloque as peças em 5 mL de DPBS frios estéreis em um tubo cônico de 15 mL, em seguida, rocha por 5 min no gelo.
- Use um controlador pipette para aspirar o DPBS e substituí-lo por 10 mL de tampão frio 1 (2 mM EDTA em DPBS). Pedra por 30 min no gelo.
- Use o controlador pipette para aspirar buffer 1 e substitua por 10 mL de tampão frio 2 (54,9 mM D-sorbitol, sacarose de 43,4 mM em DPBS). Agite por 2-3 min à mão (~80 shakes/min).
- Pegue uma gota de 20 μL de conteúdo buffer 2 depois de tremer e inspecione um microscópio.
- Filtrar o conteúdo buffer 2 com um filtro de célula estéril de 70 μm e, em seguida, coletar o buffer filtrado com um tubo cônico de 50 mL.
- Pipette 20 μL de filtragem no slide para contar as criptas. Transfira um volume suficiente de buffer 2 da etapa 1.1.7 para garantir que existam ~500 criptas/bem.
- Gire para baixo a 150 x g por 10 min a 4 °C. Uma vez que a fiação é concluída, cuidadosamente aspirar o supernatant.
- Suspenda as criptas em 50 μL de matriz de membrana do porão (por exemplo, Matrigel) por 500 criptas, pipette para cima e para baixo (tendo o cuidado de evitar bolhas), em seguida, coloque uma gota de 50 μL de matriz de membrana do porão/mistura de cripta no centro de um poço em uma placa de poço de 24. Incubar por 30 min a 37 °C para polimerizar a matriz de membrana do porão.
- Após 30 minutos de polimerização, adicione cuidadosamente 600 μL de mídia minigut (avançado o meio águia modificado de Dulbecco [DMEM]/F12, 2 mM L-alanine-L-glutamina, caneta/estreptococo [100 unidades/mL], 10 mM Hepes, Suplemento N2 [1:100], suplemento B27 [1:50] com fator de crescimento epidérmico [EGF; 50 ng/mL], Noggin [100 ng/mL], R-spondin [500 ng/mL], e Y27632 [10 μM]) para cada poço, em seguida, devolver a placa para a 37 °C/ incubadora C. Observe um microscópio todos os dias, e mude a mídia a cada 2-3 dias.
- Passaging enteróide
NOTA: Para culturas longas, os enteróides devem ser divididos aproximadamente a cada semana.- Para passar os enteróides, coloque a placa de cultura do tecido no gelo. Aspirar a mídia e adicionar 1 mL de DPBS frio a cada poço. Use uma ponta P1000 para pipette para cima e para baixo até que não restem pedaços sólidos de matriz de membrana do porão.
- Passe para cima e para baixo uma vez através de uma seringa de insulina de 1 mL (27 G) e em um tubo cônico de 15 mL. Gire para baixo por 5 min a 150 x g a 4 °C.
- Use pipeta para remover DPBS. Resuspender em 50 μL de matriz de membrana do porão/bem.
- Coloque a placa em uma incubadora de 37 °C por 30 min para permitir que a matriz de membrana do porão seja polimerizado. Sobreponha cada poço com 600 μL de mídia ENR (mídia de minigut, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 500 ng/mL R-spondin), em seguida, devolva a placa para a incubadora.
2. Análise de Citometria de Fluxo de Células EdU-positivas em Enteróides
NOTA: A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho para análise de citometria de fluxo de células EdU-positivas em enteróides.
- Incubação de enteróides com EdU
- Cresça enteróides da etapa 1.2.4 por 5 a 7 dias. Passagem enteróides em uma nova placa de poço 24 em uma proporção de divisão de 1:2. Adicione 600 μL de meio ENR a cada poço. Incubar enteróides por 4-5 dias em uma incubadora de 37 °C.
- Defina o grupo controle (enteróides não tratados) e o grupo experimental (enteróides tratados com interleucina de 5 ng/mL 22 [IL-22]). Prepare pelo menos três réplicas para cada grupo.
- Adicione EdU ao meio ENR para preparar o meio EdU com uma concentração de 50 μM. Adicione 600 μL de edu médio a cada poço e incuba por 2 h em uma incubadora de 37 °C. Estabeleça um poço de enteróides sem tratamento de UEd como um controle negativo para subtração de fundo.
- Colheita de enteróides da matriz de membrana do porão
- Use um controlador pipette para aspirar o meio EdU e lave 1x com DPBS. Adicione 1 mL de DPBS.
- Use ponta de pipeta P1000 e pipeta para cima e para baixo até que não restem pedaços sólidos de matriz de membrana do porão. Transfira para um tubo de 15 mL e gire para baixo a 300 x g por 5 min. Descarte o supernatante.
- Adicione 500 μL de enzimas de dissociação celular(Tabela de Materiais)e incuba por 15 min a 37 °C. Use ponta de pipeta P200 e pipeta para cima e para baixo para quebrar enteróides em células únicas.
- Adicione 3 mL de meio DMEM contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e repetidamente pipette com uma ponta de pipette P1000.
- Gire para baixo a 300 x g por 5 min e aspirar o meio supernatante. Resuspender as células com 1 mL de DPBS.
- Fixação e permeabilização das células
- Transfira a suspensão celular para um tubo de 1,5 mL, gire para baixo a 300 x g por 5 min e descarte o supernatante.
- Resuspender as células com 1 mL de 4% paraformaldeído (PFA), fixar por 15 min à temperatura ambiente (RT) e girar para baixo a 300 x g por 5 min. Aspirar o supernatante com uma ponta de pipeta, lavar 1x com DPBS, e girar para baixo para remover o supernatante.
- Resuspenda as células com 1 mL de 0,5% de surfactante nonionic. Incubar por 10 min na RT.
- Gire para baixo a 300 x g por 5 min e aspirar o supernatant. Lave 1x com DPBS e gire para baixo para remover o supernatante.
- Detecção de EdU
- Prepare soluções de estoque para cada componente com antecedência: 1) solução de trabalho do azide Alexa Fluor, 2) solução de trabalho do buffer de reação 1x EdU e 3) solução de estoque de 10x de aditivo tampão EdU.
- Prepare 1x aditivo tampão EdU diluindo a solução 10x 1:10 em água desionizada. Prepare esta solução de novo.
- Prepare o coquetel de reação de acordo com a Tabela 1.
NOTA: Adicione os ingredientes na ordem listada na tabela. Use o coquetel de reação dentro de 15 minutos de preparação. - Adicione 100 μL de coquetéis de reação a cada tubo de 1,5 mL. Resuspender as células, proteger da luz, incubar por 30 min na RT.
- Centrífuga a 300 x g por 5 min e aspirar a solução de reação com ponta de pipeta suavemente.
- Adicione 0,5% de penetrante surfactante nonionic a cada tubo para lavar 1x na RT. Centrifuge a 300 x g por 5 min, aspirar o supernatante com ponta de pipeette suavemente, e resuspender as células em 1 mL de DPBS.
- Análise das células por citometria de fluxo
- Filtre as células resuspensas com um filtro de 40 μm e, em seguida, colete as células filtradas com um tubo cônico de 15 mL. Realize a detecção de facs na máquina o mais rápido possível.
NOTA: Se as condições forem limitadas, as amostras manchadas de células devem ser armazenadas no escuro a 4 °C e testadas em até 3 dias. - Selecione o canal apropriado (de acordo com o tipo de Azide Alexa Fluor no kit EdU; aqui, canal vermelho) e tensão (aqui, ~150-350 V) para análise de citometria de fluxo.
- Estratégia gating
- Desenhe um gráfico pseudocolor FSC-A (eixo x) vs. SSC-A (eixo y) e distribua a maioria das células para a faixa visível do mapa de pontos ajustando a tensão. Selecione a população celular (R1) e exclua os detritos celulares no canto inferior esquerdo.
- A partir da população celular R1, estabeleça um FSC-A (eixo x) vs. FSC-H (eixo y) pseudocolor, e definir o portão para selecionar células únicas (R2) para excluir aglomerados celulares.
- A partir da população celular R2, estabeleça a intensidade da fluorescência (eixo x) vs. enredo de número de celular (eixo y) e use o controle negativo para definir o portão. A região do sinal fluorescente é uma região celular positiva (R3). Compare a proporção de células EdU-positivas (R3) entre os grupos experimentais e de controle.
- Filtre as células resuspensas com um filtro de 40 μm e, em seguida, colete as células filtradas com um tubo cônico de 15 mL. Realize a detecção de facs na máquina o mais rápido possível.
3. Análise de Citometria de Fluxo de Células PI-positivas em Enteróides
NOTA: A figura 2 mostra o fluxo de trabalho para análise de citometria de fluxo de células PI-positivas em enteróides.
- Incubação de células enteróides com PI
- Cresça enteróides da etapa 1.2.4 por 5 a 7 dias. Passagem enteróides em uma nova placa de poço 24 em uma proporção de divisão de 1:2. Adicione 600 μL de meio ENR a cada poço. Incubar enteróides por 4-5 dias em uma incubadora de 37 °C.
- Defina o grupo controle (não tratado) e o grupo experimental (tratado IL-22), usando pelo menos três réplicas para cada grupo.
- Adicione PI ao meio ENR para preparar o meio PI com uma concentração de 3 μM.
- Adicione 600 μL de pi médio a cada poço e incuba por 30 min em uma incubadora de 37 °C. Estabeleça um poço de enteróides sem tratamento de PI como um controle negativo para subtração de fundo.
- Colher enteróides da matriz de membrana do porão seguindo as etapas 2.2.1-2.2.5.
- Análise das células por citometria de fluxo
- Filtre as células resuspensas com um filtro de 40 μm e colete as células filtradas com um tubo cônico de 15 mL.
- Realize a detecção de facs na máquina o mais rápido possível.
NOTA: Se as condições forem limitadas, as amostras manchadas de células devem ser armazenadas no escuro a 4 °C e testadas em até 3 dias. - Selecione o canal apropriado (aqui, canal vermelho) e tensão (aqui, ~150-350 V) para análise de citometria de fluxo.
- Use a mesma estratégia de gating descrita na seção 2.5.3.
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Representative Results
Pequenas criptas intestinais foram isoladas e cultivadas como enteróides na matriz de membrana do porão. Os enteróides começaram a formar brotos 2 dias após o isolamento. No 6º dia, os enteróides tinham muitos botões com muitos detritos (células mortas) no lúmen. Os enteróides estavam prontos para serem passagens nesta fase (Figura 3).
Inúmeros estudos têm demonstrado que citocinas inflamatórias são essenciais para a manutenção da homeostase epitelial intestinal. A expressão anormal de citocinas inflamatórias está intimamente associada à ocorrência de doenças inflamatórias intestinais11. Por exemplo, nosso estudo anterior mostrou que o IL-22 promove a proliferação de células amplificadoras de trânsito, mas também depletes Lgr5+ células-tronco12.
Os enteróides foram tratados com IL-22 por 3 dias, após o qual o DNA sintético foi rotulado com EdU para indicar a proliferação celular. Enteróides tratados il-22 apresentaram um número aumentado de células EdU+ (Figura 4A). O IL-22 aumentou as células proliferando de 40,1% para 83,5% conforme analisado pela citometria de fluxo(Figura 4B). O tratamento IL-22 também aumentou a morte celular em enteróides, indicado pela coloração pi (Figura 5A). O IL-22 aumentou as células mortas de 4,9% para 16,2% conforme analisado pela citometria de fluxo (Figura 5B).
Figura 1: Diagrama de fluxo de trabalho para análise de citometria de fluxo de células EdU-positivas em enteróides. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Diagrama de fluxo de trabalho para análise de citometria de fluxo de células PI-positivas em enteróides. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Imagens de brightfield de enteróides a 2, 4 e 6 dias de isolamento pós-cripta. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: IL-22 aumenta a proliferação de enteróides. (A) Os enteróides foram cultivados em média sem ou com IL-22 (5 ng/mL) por 3 dias e incubados com EdU (vermelho) por 1 h. Barra de escala = 100 μm. (B) Fluxo de dados de citometria de enteróides cultivados sem (esquerda) ou com (direita) IL-22. Os dados são representativos de três experimentos separados. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 5: IL-22 promove morte celular em enteróides. (A) Os enteróides foram cultivados em média sem ou com IL-22 (5 ng/mL) por 3 dias e manchados com iodeto de propídio (vermelho). Barra de escala = 100 μm. (B) Fluxo de dados de citometria de enteróides cultivados sem (esquerda) ou com (direita) IL-22. Os dados são representativos de três experimentos separados. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
| Componentes de reação | Número de poços de placas de 24 poços | |||||
| 1 | 2 | 5 | 10 | 20 | 50 | |
| 1x tampão de reação | 86 μL | 172 μL | 430 μL | 860 μL | 1,72 μL | 4,3 μL |
| CuSO4 | 4 μL | 8 μL | 20 μL | 40 μL | 80 μL | 200 μL |
| Alexa Fluor azide | 0,25 μL | 0,5 μL | 1,25 μL | 2,5 μL | 5 μL | 12,5 μL |
| Aditivo tampão de reação | 10 μL | 20 μL | 50 μL | 100 μL | 200 μL | 500 μL |
| Volume total | 100 μL | 200 μL | 500 μL | 1 μL | 2 μL | 5 μL |
| NOTA: Adicione os ingredientes na ordem listada na tabela. | ||||||
Mesa 1: Coquetel de reação EdU.
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Discussion
Este protocolo detalha as etapas necessárias para a cultura de enteróides in vitro e quantificação de células EdU e PI-positivas nos enteróides por citometria de fluxo. Há várias vantagens dessa estratégia. Primeiro, a rotulagem EdU é usada para detectar células proliferadoras em enteróides. Em comparação com o ensaio tradicional da BrdU, o método de rotulagem EdU é mais rápido, mais sensível e mais preciso. EdU é muito semelhante à timina (T), que substitui a timina na síntese de DNA durante a divisão celular. Em comparação com o anticorpo BrdU, a EdU é mais fácil de difundir na célula, e a detecção de EdU não requer desnaturação de DNA e uma reação antigen-anticorpos. Em segundo lugar, a análise de citometria de fluxo pode quantificar de forma rápida e precisa as células proliferantes (EdU+) e mortas (PI+) em enteróides.
Para realizar com sucesso todo o procedimento, há aspectos críticos a serem considerados. Em primeiro lugar, é importante para os enteróides culturais em condições suficientes. Enteróides bem crescidos devem ter muitos botões, que contêm células proliferativas. Em segundo lugar, é importante dividir enteróides em tempo hábil. Os detritos acumulados no lúmen contêm células mortas, que podem ser manchadas com PI. Isso é prejudicial para a seguinte análise de citometria de fluxo. Terceiro, devido às múltiplas etapas (ou seja, coloração celular, fixação celular, ruptura da membrana e centrífuga), as células podem ser facilmente perdidas durante o procedimento. Assim, é importante coletar um número suficiente de enteróides. É importante combinar 2-3 poços (em uma placa de 24 poços) de enteróides antes da fixação. Por fim, é fundamental adicionar ingredientes ao buffer para detectar EdU, caso contrário, a reação não prosseguirá de forma ideal.
Em resumo, o protocolo detalha etapas para o culiculação de enteróides de camundongos in vitro e a quantificação de células proliferadas e mortas por citometria de fluxo. Enteróides são ferramentas úteis para modelagem de doenças e descoberta de drogas terapêuticas. Este protocolo ajuda na exploração dos efeitos de citocinas inflamatórias, patógenos e drogas na proliferação celular e sobrevivência celular em modelos de cultura enteróide.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31971062, 31900326 e 31601022), Fundação de CiênciaNatural da Província de Jiangsu (BK20190043, BK20180838), Fundo de Pesquisa do Laboratório Estadual-Chave de Biotecnologia Farmacêutica, Universidade de Nanjing (KF-GN-202004). A Fundação de CiênciaNatural das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu da China (19KJB320003), o Programa de Subsistência e Tecnologia da cidade de Suzhou (SYS2019030) e o Programa de Inovação em Pesquisa para Graduados Universitários da Província de Jiangsu (KYCX19-1981) . Este trabalho também é apoiado pela Tang Scholar da Universidade de Soochow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
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