Visualisering og kvantificering af Højdimensionale cytometri-data ved hjælp af Cytofast og upstream-klynge metoderne FlowSOM og Cytosplore

Summary

Cytofast er et visualiseringsværktøj, der bruges til at analysere output fra klyngedannelse. Cytofast kan bruges til at sammenligne to metoder til klyngedannelse: Flowsom og cytosplore. Cytofast kan hurtigt generere en kvantitativ og kvalitativ oversigt over massecytometri data og fremhæve de vigtigste forskelle mellem forskellige klynge algoritmer.

Abstract

Kompleksiteten af data genereret af massecytometri har nødvendiggjort nye værktøjer til hurtigt at visualisere analytiske resultater. Klyngedannelse metoder som Cytosplore eller flowsom bruges til visualisering og identifikation af celle klynger. For downstream analyse, en nyudviklet R-pakke, Cytofast, kan generere en hurtig visualisering af resultater fra klyngedannelse metoder. Cytofast tager hensyn til fænotypiske karakterisering af celle klynger, beregner celle klyngens overflod, derefter kvantitativt sammenlignes grupper. Denne protokol forklarer anvendelser af Cytofast til anvendelse af massecytometri data baseret på graduering af immunsystemet i tumor mikromiljø (dvs. den naturlige Killer [NK] celle respons) på tumor udfordring efterfulgt af immunterapi (PD-L1 blokade). Påvisning af nytten af Cytofast med Flowsom og cytosplore er vist. Cytofast genererer hurtigt visuelle repræsentationer af gruppe relaterede immuncelle klynger og korrelationer med immunsystemets sammensætning. Der observeres forskelle i klynge analysen, men adskillelsen mellem grupperne er synlig med begge klynge metoder. Cytofast viser visuelt de mønstre INDUCERET af PD-L1-behandling, der omfatter en højere overflod af aktiverede NK-celle undersæt, hvilket udtrykker en højere intensitet af aktiverings markører (dvs., CD54 eller CD11c).

Introduction

Masse cytometri (cytometri ved time-of-Flight, eller CyTOF) giver mulighed for påvisning af en bred vifte af intracellulære eller ekstracellulære biomarkører i millioner af enkeltceller. Den høje dimensionelle karakter af massecytometri data nødvendiggør visse analyseværktøjer, såsom celle klynge teknikker som spade¹, flowmaps², flowsom³, phenograph⁴, VorteX⁵og stilladser kort⁶. Desuden er forskellige dimensionalitets reduktions baserede teknikker blevet udviklet (dvs. vigtigste komponent analyse [PCA]⁷, t-distribueret stokastisk nabo indlejring [t-sne]⁸, hierarkisk stokastisk nabo indlejring [hsne]⁹, ensartet manifold tilnærmelse og projektion [UMAP]¹⁰, og diffusion Maps¹¹) for at forbedre hastigheden, fortolkning og visualisering af High-dimensionelle datasæt.

Downstream-analyse af højdimensionale flow og masse cytometriske data mangler ofte automatiske processer til at udføre statistiske tests på klynge frekvens og forbindelser med kliniske resultater. Tidligere udviklede vi en R-baseret arbejdsgang kendt som cytofast¹², som giver mulighed for visuelle og kvantitative downstream analyser af klyngedannelse teknikker ved cytosplore eller flowsom.

Den protokol, der er beskrevet her, tydeliggør brugen af Cytofast i R og viser, hvordan man genererer kvantitative og kvalitative Heatmaps og grafer. Desuden letter det bestemmelsen af forbindelser mellem observerede immun fænotyper og kliniske resultater. Denne rapport beskriver også analysen af et specifikt massecytometri-datasæt ved hjælp af to forskellige klynge procedurer: Flowsom og cytosplore. Ved at bruge Cytofast med begge klynge metoder er det tilsvarende vist, at aktiverings Fænotypen af NK-celler påvirkes af PD-L1-immun kontrolpunkts blokade.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af Animal eksperimenter Udvalget af LUMSK og blev udført i henhold til dyreforsøg retningslinjer for LUMC i overensstemmelse med retningslinjerne i hollandske og europæiske komitéer.

Bemærk: til eksperimentel opsætning blev C57BL/6-mus subkutant inokuleret på højre flanke med murine tyktarms tumor MC38 i en koncentration på 0,3 x 10⁶ celler/200 μl fosfat-bufferet saltvand (PBS). Efter 10 dage, da tumorer var håndgribelige, blev musene behandlet med PD-L1 blokerende antistoffer (klon MIH-5, 200 μg/mus, intra-peritoneal injektion) eller blev mock-behandlet. Tumorer blev gensendt 3 dage senere efter PD-L1 injektion, forarbejdet ex vivo, og analyseret af cytof Mass flowcytometri ved hjælp af 38 markører¹³.

1. udstyr og software til data analyse

Bemærk: Brug en computer (Windows 7 eller nyere) og processor I5 på 2,4 GHz eller tilsvarende, installeret hukommelse RAM 6 GB, og 10 GB ledig harddiskplads. R-pakken Cytofast bruger eksisterende funktioner: primært flowcore, pheatmapog ggplot. De kommandolinjer, der skal udføres i R, er inkluderet i protokollen. Ressourcen for R-instruktioner kan findes på https://Education.rstudio.com/.

1. Hvis du vil installere Cytofast -pakken, skal du starte R (version "3,6") og installere bioconductor version 3,9 ved at indtaste følgende kode:
   
   Hvis (! requireNamespace ("BiocManager", stille = TRUE))
   Installer. pakker ("BiocManager")
   BiocManager:: Installer ("cytofast")
2. Sørg for, at pakken er indlæst i det ønskede miljø ved at køre følgende:
   
   bibliotek (cytofast)

2. oprettelse af klynger

Bemærk: for at fremvise de to klynge metoder cytosplore og Flowsom med CYTOFAST, NK celler (CD161⁺) i tumor mikro-miljø 3 dage efter PD-L1 behandling analyseres.

1. Klyngedannelse udført afCytosplore
   1. Efter download og installation af Cytosplore, hostet på < www. Cytosplore. org >, uploade. FCS filer (supplerende filer 1.1 – 1.8 [cytosplore input files]) ved at klikke på fil | Åbn FCS-fil (er) i Cytosplore. Tilføj et entydigt eksempeltag som kanal ved at klikke på Tilføj entydigt eksempeltag som kanal, når du bliver bedt om det, og vælg en cofaktor for hyperbolske ARCSINH-transformation (standard er 5).
   2. Vælg Kør H-sne, Kør et hsne-niveau på 3, og vent på, at kortet genereres.
      Bemærk: dette trin kan kræve et stykke tid, afhængigt af antallet af analyserede celler og niveauet af hsne valgt.
   3. På det første HSNE-niveau kontrolleres de celler, der er positive for CD161. Vælg CD161⁺ cellerne, og højreklik på Zoom ind i Markeringen. På andet niveau skal du gentage proceduren for at nå det tredje niveau med kun CD161⁺ hændelser.
   4. Når det sidste tSNE-kort er genereret, Gem de klynger, der er defineret af Cytosplore , ved at højreklikke på tsne-kortet og vælge Gem klynger. Vælg den mappe af output-filer, som anmodet af Cytosplore og Bemærk denne placering, fordi denne mappe vil derefter blive brugt til at indlæse. FCS filer i R.
      Bemærk: antallet af undergrupper kan ændres manuelt ved at ændre Sigma-værdien. Sigma-værdien indstilles som standard til 30. det faktiske antal undersæt afhænger dog af input. Her, Cytosplore opdaget 10 forskellige delsæt, med hver fil, der repræsenterer en delmængde.
   5. Brug et simpelt navn (kun tegn), når du omdøber output-filer, som vil gøre identifikation og yderligere håndtering lettere. Gem output filerne ved at vælge Gem.
      Bemærk: efter at have gemt, en mappe er ved at blive skabt af cytosplore med. FCS filer, med hver fil, der svarer til de identificerede klynger i cytosplore. Det næste skridt vil være at indlæse filerne i R ved hjælp af Cytofast. Her leveres de genererede output filer i supplerende filer 2.1 – 2.10 (cytosplore output files).
   6. Indlæs output filer genereret af Cytosplore i R med den udpegede funktion: readCytosploreFCS.
      
      dirFCS <-"C:\brugere\\username\\desktop\\tostudy"
      cfData <-readCytosploreFCS (dir = dirFCS, colNames = "beskrivelse")
   7. Rengør dataene ved at fjerne nogle parametre som "tid" og "baggrund". Kontroller placeringen af kolonnen, der er relateret til dens unødvendige parametre, og fjern den fra matrixen.
      
      kolnames (cfData@expr)
      cfData@expr <-cfData@expr [,-c (3, 4, 6, 8:10, 46:49, 51:54)]
      
      Bemærk: de unødvendige kolonner kan ses ved at læse kolonnenavnene på den genererede matrix. Ved at køre colnames (cfData@expr) endnu en gang, Sørg for, at kun de ønskede parametre er opnået.
   8. Re-order markører, så Lineage markører vises først, efterfulgt af funktionelle markører.
      
      cfData@expr <-cfData@expr [, c (1, 2, 3, 35, 36, 31, 9, 10, 18, 8, 37, 20,
      29, 40, 5, 30, 33, 11, 34, 14, 19,
      32, 28, 6, 7, 4, 12, 13, 17, 16, 15,
      21, 22, 24, 25, 26, 27, 38, 39)]
      
      Bemærk: trin 2.1.8 er valgfrit.
   9. Link meta datafilen til de genererede data fra Cytosplore ved at uploade regnearkmetfilen indeholdende kliniske oplysninger (supplerende fil 3).
      
      Library (readxl)
      meta <-read_excel ("C:\brugere\brugernavn\\skriveprogrammer\\ sample_id. xlsx")
      cfData@samples <-data. frame (meta)
      
      Bemærk: den klyngedannelse, der udføres af cytosplore , er nu færdig. En alternativ klynge indstilling til Cytosplore er flowsom og er beskrevet i afsnit 2,2. Når en af de to klynge trin udføres, skal du fortsætte med visualiserings trinnet (afsnit 3).
2. Klyngedannelse udført afFlowSOM
   1. Først installere flowsom i R ved at køre følgende kommando:
      
      Hvis (! requireNamespace ("BiocManager", stille = TRUE))
      Installer. pakker ("BiocManager")
      BiocManager:: install ("FlowSOM")
      bibliotek (FlowSOM)
   2. Installer flowCore-pakken ved hjælp af en lignende metode, og Indlæs den i miljøet ved at køre følgende:
      
      Hvis (! requireNamespace ("BiocManager", stille = TRUE))
      Installer. pakker ("BiocManager")
      BiocManager:: Installer ("flowCore")
      bibliotek (FlowSOM)
   3. Indlæs de rå data, der findes i supplerende filer 4.1 – 4.8 (FCS flowsom input), som tidligere blev GATED på CD161 + events, i R med Read. flowset-funktionen.
      
      fcs_raw <-Læs. flowSet (Path = "C:\brugere\brugernavn\\desktop\\tocluster", mønster = ". FCS", transformation = falsk, truncate_max_range = falsk, Seed = 123)
   4. Vælg de relevante biologiske markører (Fjern "baggrund" eller "tid") ved at vælge de rigtige kolonner og omdanne dataene på en arcsinh5 måde som vist i koden nedenfor (her fjernes kolonne 1, 2, 4, 5, 6, 17, 21, 24, 25, 34, 35, 37, 38, 51, som ikke svarer til nogen biologisk markør). Anvend en cofaktor på 5 som tidligere anvendt med cytosploreved at vælge cofaktor = 5 i funktionen nedenfor.
      
      fcs_raw <-fsApply (fcs_raw, funktion (x, cofactor = 5) {
      colnames (x) <-fcs_raw [[1]] @parameters @data $ DESC
      udtryk <-exprs (x)
      udtryk <-asinh (udtryk [,-c (1, 2, 4, 5, 6, 17, 21, 24, 25, 34, 35, 37, 38, 51)]/cofactor)
      exprs (x) <-udtryk
      Return (x)})
   5. Klynge dataene ved hjælp af funktionen Flowsom . Hvis du vil sammenligne flowsom og cytosplore, skal du vælge at klynge dataene i ti delsæt som det output, som tidligere blev givet ved cytosplore.
      
      fsom <-FlowSOM (fcs_raw, Transformer funktion = falsk, skala = falsk,
      skaleret. Center = falsk, skaleret. Scale = FALSE, Silent = FALSE, colsToUse = c (1:37),
      nClus = 10, maxMeta = 10, vigtighed = NULL, Seed = 123)
      
      Bemærk: Dette kan ændres manuelt af brugeren.
   6. Tildel hver celle til den identificerede delmængde og eksempel-ID.
      
      subset_id <-as. Factor (fsom $ FlowSOM $ kort $ tilknytning [, 1])
      niveauer (subset_id) <-fsom $ metaclustering
      hoved (subset_id)
   7. Indlæs metadatafilen i R (findes i den supplerende fil 5), der indeholder gruppe tildelingen, og Sammenkæd den med. FCS-filerne.
      
      sampleid <-read_excel ("C:\brugere\brugernavn\\skriveprogrammer\\ sample_id. xlsx")
      sampleid <-na. udelade (sampleid)
      
      sampleid $ sampleID <-as. Factor (sampleid $ sampleID)
      sampleid $ gruppe <-as. Factor (sampleid $ gruppe)
      sampleid $ CSPLR_ST <-as. Factor (sampleid $ CSPLR_ST)
      
      sampleid <-as. data. frame (sampleid)
      navne (sampleid) [3] <-"sampleID"
      sampleID <-lapply (fsom $ FlowSOM $ metaData, funktion (x) {rep (x [1], hver = længde (x [1]: x [2]))})
      attr (sampleID, ' Names ') <-NULL
      sampleID <-as. Factor (unlist (sampleID))
      sampleid <-data. frame (sampleid)
      niveauer (sampleID) <-paste ("ID", 1: Dim (sampleid) [1], sep = "_")
      
      DF <-data. frame (subset_id, sampleID, fsom $ FlowSOM $ data [, c (1:37)])
      Omdøb <-data. frame (colpar = fcs_raw [[1]] @parameters @data $ DESC)
      colnames (DF) <-c ("clusterID", "sampleID", Omdøb $ colpar [c (1:37)])
      DF $ clusterID <-as. Factor (DF $ clusterID)
      DF $ sampleID <-as. Factor (DF $ sampleID)
   8. Opret en cfList baseret på dataframe opnået fra flowsom ved at køre følgende script:
      
      cfData <-cfList (samples = sampleid,
      udtryk = DF)
   9. Re-order markører til at fremstå på samme måde som output fra Cytosplore analyse.
      
      cfData@expr <-cfData@expr [, c (1, 2, 34, 36, 37, 10, 23, 24, 31, 22,
      38, 15, 8, 3, 27, 9, 11, 28, 35, 26,
      14, 33, 17, 20, 21, 18, 25, 29, 13,
      30, 12, 16, 32, 4, 5, 6, 7, 19, 39)]
      
      Bemærk: klyngedannelse af flowsom er nu færdig. Dernæst udføre visualisering af klyngedannelse output.

3. visualisering: analyse af klyngedannelse efter behandling

Bemærk: dette trin er en metode, der er fælles for begge klynge metoder. Derfor kan det udføres efter klyngedannelse enten med Flowsom eller cytosplore.

1. Før du opretter Heatmaps, generere tælle tabellen pr prøve ved hjælp af funktionen Cellcount som vist i koden nedenfor. Da nogle klynger indeholder færre celler end andre, skalerer dataene pr. klynge ved at angive "Scale = TRUE" inde i funktionens celletal, så spredningen blandt prøverne let kan ses.
   
   cfData <-cellCounts (cfData, frekvens = TRUE, skalering = TRUE)
   
   Bemærk: dataene kan nu visualiseres.
2. Visualiser med heatmap.
   Bemærk: en af de vigtigste funktioner i denne pakke er cytoHeatmaps, som bruges til at visualisere Fænotypen af de oprettede klynger samt deres heterogenitet med hensyn til prøverne.
   
   cytoHeatmaps (cfData, Group = "gruppe", Legend = TRUE)
3. Visualisering med Boxplots
   Bemærk: data kan repræsenteres på en kvantitativ måde ved at kalde funktionen cytoBoxplots. Outputtet af denne funktion repræsenterer andelen af hver prøve for hver klynge.
   1. Generer celletal som udført i trin 3,1, men skalerer ikke dataene for at opnå hyppigheden af hver klynge.
      
      cfData <-cellCounts (cfData, frekvens = TRUE, skalering = falsk)
      cytoBoxplots (cfData, gruppe = "gruppe")
4. Visualisering med signal histogram for median intensitet
   Bemærk: dataene kan også visualiseres ved at repræsentere median intensitet signal histogrammet.
   1. Visualiser udtryks intensiteten for tre markører: CD45, CD11c og CD54.
   2. Kontroller navnene på de ønskede markører ved at kalde følgende linje. Noter mærkenavnene, og Medtag det i funktionen msiPlot.
      
      navne (cfData@expr)
      
      Bemærk: her FOKUSERES på CD45, CD11C og CD54. Kontroller den nøjagtige stavning af mærkerne, og Juster om nødvendigt:
      
      msiPlot (cfData, markører = c ("89Y_CD45", "167Er_CD11c", "164Dy_CD54"), byGroup = ' gruppe ')

Representative Results

Workflow Cytofast (figur 1) er beregnet til at give et kvantitativt og kvalitativt overblik over de data, der oprindelig blev grupperet efter analyse software (f. eks. Flowsom eller cytosplore). Cytofast kører flere mulige udgange, herunder heatmap for alle klynger identificeret i analysen og baseret på markør udtryk (figur 2 og figur 3). Dendrogram øverst repræsenterer den hierarkiske lighed mellem de identificerede klynger. Det øverste panel viser en anden heatmap, der viser det relative antal af tilsvarende delmængder i hver prøve. Dendrogram til højre viser ligheden mellem prøverne og er baseret på hierarkisk klyngedannelse udført på euklidisk afstanden mellem prøverne. De kombinerede varmekort vises for Flowsom efterfulgt af cytofast i figur 2 og for Cytosplore efterfulgt af cytofast i figur 3. Cytofast kan også bruges til at præsentere data kvantitativt og vise resultaterne i Boxplots (ved hjælp af cytoboxplots funktion), som vist i figur 4 og figur 5.

Lignende klynger blev fundet mellem de to forskellige metoder (f. eks., klynge 8 fra Cytosplore svarer til klynge 10 fra flowsom), og co-ekspression af nogle hæmmende markører som PD-1 og lag-3 var stadig synlige i begge metoder). Begge klynge metoder tillod diskrimination mellem PD-L1 vs. PBS-behandlede mus. I modsætning hertil kan der fremhæves visse forskelle mellem de to metoder. Flowsom identificerer 2 klynger (MHC-II⁺), hvorimod cytosplore kun viser én klynge (MHC-II^{+ Dim}). Dette skyldes den indledende gating strategi, hvor NK celler blev manuelt gated på CD161⁺ celler, derefter yderligere behandlet af flowsom. Cytosplore indhegnet imidlertid automatisk celler fra CD45^+- populationen på det første hsne-niveau, som derefter blev grupperet i et højere hierarkisk niveau. Således, Cytosplore defineret NK celle undersæt mere præcist end hvordan manuel gating FOKUSERET på CD161. Ikke desto mindre blev de hierarkiske klynger af prøverne bevaret, som vist i dendrogram til højre, hvilket indikerer, at adskillelsen mellem de to grupper (PD-L1 og PBS) ikke var afhængig af den valgte klynge metode.

Antallet af klynger kan defineres manuelt ved hjælp af begge metoder. Cytofast gør det muligt for brugeren at vurdere heterogeniteten af deres data og kan give indsigt i, hvordan man vælger det antal klynger, som dataene skal opdeles i. Andre funktioner er inkluderet i Cytofast -pakken, såsom funktionen msiplot (trin 3.4.2), der viser den mediane signalintensitet (MSI) for hvert mærke pr. gruppe (figur 6 og figur 7). Denne funktion gør det muligt at opdage globale ændringer, såsom stigninger i ekspression af CD54 eller CD11c i NK-cellerne i den PD-L1-behandlede gruppe. Valgfrie funktioner kan inkorporeres i Cytofast -pakken, såsom visning af data i bjælkediagrammer og andre metoder til data repræsentation. Sidstnævnte kræver tilsætning af ggplot værktøjer, som kan genereres af R.

Figur 1: workflow af Cytofast -pakken. Dataene blev genereret af massecytometri fra en tumor 3 dage efter behandling med immunterapi eller venstre ubehandlet. To forskellige klyngedannelse teknikker blev sammenlignet: cytosplore og flowsom. Cytofast blev brugt til at visualisere forskelle mellem de to teknikker. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: klynge oversigt og klynge tæthed pr. gruppe som analyseret af Cytofast efter cytosplore. Heatmap af alle NK celle klynger (CD161⁺ celler defineret automatisk af cytosplore), som blev identificeret 3 dage efter immunterapi (PD-L1). De viste data er baseret på Cytosplinklynge dannelse og poolet fra de ubehandlede og PD-L1-behandlede grupper. Niveauer af ArcSinh5-transformerede udtryks markør vises på en regnbue skala. På det nederste panel repræsenteres den relative overflod af hver prøve af den grøn-til-lilla skala. Dendrogram til højre repræsenterer ligheden mellem prøver baseret på delmængde frekvenser. Frekvens skalaen repræsenterer spredningen af middelværdien. En lav eller en høj frekvens repræsenteres af henholdsvis en grøn eller lilla farve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: klynge oversigt og klynge tæthed pr. gruppe som analyseret af Cytofast efter flowsom. Heatmap af alle NK celle klynger (præ-gated på CD161⁺ hændelser), som blev identificeret 3 dage efter immunterapi (PD-L1). De viste data er baseret på flowsom -klyngedannelse og poolet fra de ubehandlede og PD-L1-behandlede grupper. Niveauer af ArcSinh5-transformerede udtryks markør vises på en regnbue skala. På det nederste panel repræsenteres den relative overflod af hver prøve af den grøn-til-lilla skala. Dendrogram til højre repræsenterer ligheden mellem prøver baseret på delmængde frekvenser. Frekvens skalaen repræsenterer spredningen af middelværdien. En lav eller en høj frekvens repræsenteres af henholdsvis en grøn eller lilla farve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Cytofast repræsentation med Boxplots af klynger defineret af cytosplore. Hyppigheden af hver klynge er repræsenteret i en boxplot, opdelt i de to grupper (PBS og PD-L1). En enkelt prik svarer til én mus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Cytofast repræsentation med Boxplots af klynger defineret af flowsom. Hyppigheden af hver klynge er repræsenteret i en boxplot, opdelt i de to grupper (PBS og PD-L1). En enkelt prik svarer til én mus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: fordeling af signalintensitet plot fra NK celler automatisk gated af Cytosplore. Fordelingen af signal intensiteterne vises i et histogram for tre specifikke markører: CD45, CD11c og CD54. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7: fordeling af signalintensitet plot fra NK celler automatisk gated af flowsom. Fordeling af signal intensiteter vises i et histogram for tre specifikke markører: CD45, CD11c og CD54, adskilt af gruppe PBS og PD-L1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende filer 1.1 – 1.8. Klik venligst her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).

Supplerende filer 2.1 – 2.10. Klik venligst her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).

Supplerende fil 3. Klik venligst her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).

Supplerende filer 4.1 – 4.8. Klik venligst her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).

Supplerende fil 5. Klik venligst her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).

Discussion

Cytofast er et hurtigt beregningsmæssige værktøj, der giver en hurtig og global udforskning af cytometriske data ved at fremhæve og kvantificere behandlings specifikke celle undersæt. Den beskrevne protokol har til formål at viderebehandle klynge analyser med Cytosplore eller flowsom. Andre analyseværktøjer til klyngedannelse er velegnede til cytofast, men dette kræver brug af cytofast for at tildele hver celle til en delmængde. Cytofaster imidlertid ikke en klynge metode, og kræver derfor klynge procedurer før brug.

Den analyse, der blev udført her, viste, at visse CD161⁺ NK-celle undersæt i Tumorens mikromiljø var følsomme over for en PD-L1-blokade. Dette fremgik af ændringer i deres fænotype og overflod, som blev observeret ved hjælp af både Cytosplore og flowsom som klyngedannelse metoder. Begge metoder udmærker de vigtigste NK celle klynge (CD11b⁺ NKG2A⁺) med lidt forskellige frekvenser (15% – 20% for cytosplore, 30% – 40% for flowsom). Forskellene i overflod og denne tilnærmelse påvirkede ikke det globale mønster, fordi begge dendrogrammer vises i de rigtige paneler i figur 2 og figur 3 viste lignende resultater. Ved at bruge Cytofaster det således muligt (uafhængigt af den valgte klynge metode) at UDSKILLER PD-L1-behandlede og ubehandlede mus baseret på analyser af NK-celle klynge fænotype og overflod.

Afhængigt af de registrerede parametre er der behov for ændringer af protokollen. Specifikt, visse parametre såsom tid og baggrund skal fjernes, mens du udfører klyngedannelse analyse. Desuden er det vigtigt, at hver celle er tildelt til en delmængde. Funktionen cfData vil blot tilføje RAW-celletal pr. klynge pr. prøve i cfList. Fra dette trin kan cytoheatmap bygges som forklaret i afsnit 3.

Cytofast er med held blevet brugt som et visualiserings-og kvantificerings værktøj til at sammenligne forskellige klynge metoder¹³. Denne R-pakke er også kompatibel med avancerede funktioner, såsom globaltest¹⁴, som kan teste foreninger mellem grupper af klynger ved hjælp af kliniske variabler. I fremtiden kan det globale test værktøj og andre algoritmer integreres med cytofast for mere dybtgående visualisering og kvantificering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Dell	NA	NA