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Immunology and Infection

साइटोफास्ट और अपस्ट्रीम क्लस्टरिंग मेथड्स फ्लोसोम और साइटोप्लर का उपयोग करके उच्च-आयामी साइटोमेट्री डेटा का दृश्यीकरण और क्वांटिफिकेशन

Published: December 12, 2019 doi: 10.3791/60525
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Immunohematology and Blood Transfusion, Leiden University Medical Center, 2Department of Parasitology, Leiden University Medical Center

Summary

साइटोफास्ट एक दृश्य उपकरण है जिसका उपयोग क्लस्टरिंग से आउटपुट का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। फ्लोसोम और साइटोप्लर: साइटोफास्ट का उपयोग दो क्लस्टरिंग तरीकों की तुलना करने के लिए किया जा सकता है। साइटोफास्ट तेजी से बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री डेटा का मात्रात्मक और गुणात्मक सिंहावलोकन उत्पन्न कर सकता है और विभिन्न क्लस्टरिंग एल्गोरिदम के बीच मुख्य मतभेदों को उजागर कर सकता है।

Abstract

मास साइटोमेट्री द्वारा उत्पन्न डेटा की जटिलता ने विश्लेषणात्मक परिणामों की तेजी से कल्पना करने के लिए नए उपकरणों की आवश्यकता की है। साइटोप्लर या फ्लोसोम जैसे क्लस्टरिंग तरीकों का उपयोग कोशिका समूहों के दृश्य और पहचान के लिए किया जाता है। डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए, एक नया विकसित आर पैकेज, साइटोफास्ट,क्लस्टरिंग विधियों से परिणामों का तेजी से दृश्य उत्पन्न कर सकता है। साइटोफास्ट सेल क्लस्टर के फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन को ध्यान में रखता है, सेल क्लस्टर बहुतायत की गणना करता है, फिर मात्रात्मक रूप से समूहों की तुलना करता है। यह प्रोटोकॉल ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट (यानी, प्राकृतिक हत्यारा [एनके] सेल प्रतिक्रिया) में प्रतिरक्षा चिकित्सा (पीडी-एल 1 नाकाबंदी) के बाद ट्यूमर चैलेंज पर बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री डेटा के उपयोग के लिए साइटोफास्ट के अनुप्रयोगों को बताता है। फ्लोसोम और साइटोप्लर के साथ साइटोफास्ट की उपयोगिता का प्रदर्शन दिखाया गया है। साइटोफास्ट तेजी से समूह से संबंधित प्रतिरक्षा कोशिका समूहों और प्रतिरक्षा प्रणाली संरचना के साथ सहसंबंधों के दृश्य अभ्यावेदन उत्पन्न करता है। क्लस्टरिंग विश्लेषण में मतभेद देखे जाते हैं, लेकिन समूहों के बीच अलगाव दोनों क्लस्टरिंग तरीकों के साथ दिखाई देता है। साइटोफास्ट नेत्रहीन पीडी-एल1 उपचार द्वारा प्रेरित पैटर्न दिखाता है जिसमें सक्रिय एनके सेल सबसेट की उच्च बहुतायत शामिल है, जो सक्रियण मार्कर (यानी, सीडी54 या सीडी11सी) की उच्च तीव्रता को व्यक्त करता है।

Introduction

मास साइटोमेट्री (समय-उड़ान या साइटोफ द्वारा साइटोमेट्री) लाखों एकल कोशिकाओं में इंट्रासेलर या एक्स्ट्रासेलुलर बायोमार्कर की एक विस्तृत श्रृंखला का पता लगाने की अनुमति देता है। मास साइटोमेट्री डेटा की उच्च-आयामी प्रकृति में कुछ विश्लेषण उपकरणों की आवश्यकता होती है, जैसे कुदाल1, फ्लोमैप्स2, फ्लोसोम3, फेनोग्राफ4, वोर्टेक्स5और पाड़ मानचित्र6। इसके अलावा, विभिन्न आयामीता में कमी आधारित तकनीकों को विकसित किया गया है (यानी, प्रमुख घटक विश्लेषण [पीसीए]7,टी-वितरित स्टोचस्टिक पड़ोसी एम्बेडिंग [टी-स्ने]8,पदानुक्रमित स्टोचस्टिक पड़ोसी एम्बेडिंग [एचएसएनई]9,समान कई गुना सन्निकटन और प्रक्षेपण [यूमैप]10,और प्रसार मानचित्र11)उच्च-आयामी डेटासेट की गति, व्याख्या और दृश्यमें सुधार करने के लिए।

उच्च आयामी प्रवाह और मास साइटोमेट्रिक डेटा के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में अक्सर क्लस्टर आवृत्ति और नैदानिक परिणामों के साथ लिंक पर सांख्यिकीय परीक्षण करने के लिए स्वचालित प्रक्रियाओं का अभाव होता है। इससे पहले, हमने साइटोफास्ट12के नाम से जाना जाने वाला आर-आधारित कार्यप्रवाह विकसित किया, जो साइटोप्लर या फ्लोसोमद्वारा क्लस्टरिंग तकनीकों के दृश्य और मात्रात्मक डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए अनुमति देता है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल आर में साइटोफास्ट के उपयोग को स्पष्ट करता है और यह दर्शाता है कि मात्रात्मक और गुणात्मक हीटमैप और ग्राफ कैसे उत्पन्न किया जाए। इसके अलावा, यह मनाया प्रतिरक्षा फेनोटाइप और नैदानिक परिणामों के बीच कनेक्शन के निर्धारण की सुविधा । इस रिपोर्ट में दो अलग-अलग क्लस्टरिंग प्रक्रियाओं का उपयोग करके एक विशिष्ट मास साइटोमेट्री डेटासेट के विश्लेषण का भी वर्णन किया गया है: फ्लोसोम और साइटोप्लर। दोनों क्लस्टरिंग तरीकों के साथ साइटोफास्ट का उपयोग करके, यह तदनुसार दिखाया गया है कि एनके कोशिकाओं की सक्रियता फेनोटाइप पीडी-एल1 प्रतिरक्षा चेकपॉइंट नाकाबंदी से प्रभावित होती है।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों को LUMC की पशु प्रयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और डच और यूरोपीय समितियों के दिशा निर्देशों के अनुपालन में LUMC के पशु प्रयोग दिशानिर्देशों के अनुसार निष्पादित किया गया था ।

नोट:प्रायोगिक सेट-अप के लिए, C57BL/6 चूहों को 0.3 x 106 कोशिकाओं/200 माइक्रोन फॉस्फेट-बफर लवण (पीबीएस) की एकाग्रता पर मुरिन कोलन ट्यूमर MC38 के साथ सही पार्श्व पर टीका लगाया गया था। 10 दिनों के बाद, जब ट्यूमर स्पष्ट थे, चूहों पीडी-L1 अवरुद्ध एंटीबॉडी (क्लोन MIH-5, २०० μg/माउस, अंतर पेरिटोनियल इंजेक्शन) के साथ इलाज किया गया या नकली इलाज किया गया । ट्यूमर को 3 दिन बाद पीडी-एल1 इंजेक्शन के बाद फिर से काट दिया गया, पूर्व वीवो को संसाधित किया गया, और 38 मार्कर13का उपयोग करके साइटोफ मास साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया।

1. डेटा विश्लेषण के लिए उपकरण और सॉफ्टवेयर

नोट:2.4 गीगाहर्ट्ज या समकक्ष पर कंप्यूटर (विंडोज 7 या नए) और प्रोसेसर I5 का उपयोग करें, मेमोरी रैम 6 जीबी और 10 जीबी मुफ्त हार्ड ड्राइव स्पेस स्थापित करें। आर पैकेज साइटोफास्ट मौजूदा कार्यों का उपयोग करता है: मुख्य रूप से फ्लोकोर, फेटमैप,और जीजीप्लॉट। आर में निष्पादित की जाने वाली कमांड लाइनों को प्रोटोकॉल में शामिल किया गया है। आर निर्देशों के लिए संसाधन https://education.rstudio.com/पर पाया जा सकता है ।

  1. साइटोफास्ट पैकेज इंस्टॉल करने के लिए, आर (संस्करण "3.6") शुरू करें और निम्नलिखित कोड दर्ज करके बायोकंडक्टर संस्करण 3.9 स्थापित करें:

    अगर (!Namespace की आवश्यकता है ("BiocManager", चुपचाप = सच है))
    इंस्टॉल.पैकेज ("बायोमैनेजर")
    बायोमैनेजर::इंस्टॉल ("साइटोफास्ट")
  2. सुनिश्चित करें कि पैकेज निम्नलिखित चलाकर वांछित वातावरण में लोड किया गया है:

    पुस्तकालय (साइटोफास्ट)

2. क्लस्टर बनाना

नोट:दो क्लस्टरिंग तरीकों साइटोप्लर और फ्लोसोम को साइटोफास्टके साथ प्रदर्शित करने के लिए, पीडी-एल1 उपचार का विश्लेषण करने के 3 दिन बाद ट्यूमर माइक्रो-वातावरण में एनके कोशिकाएं (CD161+)।

  1. द्वारा किया जाने वाला क्लस्टरिंगCytosplore
    1. साइटोप्लरडाउनलोड करने और स्थापित करने के बाद, साइटोप्लर.org>, फाइल पर क्लिक करके .fcs फाइलें(सप्लीमेंट्री फाइल्स 1.1-1.8 [साइटोप्लर इनपुट फाइल्स]) अपलोड करें । साइटोप्लरमें ओपन एफसीएस फाइल (एस) । चैनल के रूप में एक अद्वितीय नमूना टैग जोड़ें जब प्रेरित किया जाता है और हाइपरबोलिक आर्कसिंह परिवर्तन (डिफ़ॉल्ट 5 है) के लिए एक कोफैक्टर का चयन करें।
    2. भागो एच-SNEका चयन करें, 3 के एचएसएनई स्तर चलाने के लिए, और नक्शे के लिए प्रतीक्षा करने के लिए उत्पंन किया जाएगा ।
      नोट:इस कदम का विश्लेषण किया कोशिकाओं की संख्या और HSNE के स्तर के आधार पर कुछ समय की आवश्यकता हो सकती है चुना ।
    3. पहले एचएसएनई स्तर पर, सीडी 161 के लिए सकारात्मक कोशिकाओं की जांच करें। चयन में CD161+ कोशिकाओं और सही क्लिक ज़ूमका चयन करें । दूसरे स्तर पर, केवल CD161+ घटनाओं के साथ तीसरे स्तर तक पहुंचने की प्रक्रिया दोहराएं।
    4. एक बार जब अंतिम tSNE मानचित्र उत्पन्न हो जाता है, तो साइटोप्लर द्वारा परिभाषित समूहों को टीएसने मानचित्र पर सही क्लिक करके सहेजें और सेव क्लस्टरचुनें। साइटोप्लर द्वारा प्रेरित आउटपुट फ़ाइलों की निर्देशिका चुनें और इस स्थान पर ध्यान दें, क्योंकि इस निर्देशिका का उपयोग इसलिए .fcs फ़ाइलों को आर में लोड करने के लिए किया जाएगा।
      नोट:सिग्मा मूल्य को बदलकर सबसेट की संख्या को मैन्युअल रूप से बदला जा सकता है। सिग्मा मूल्य 30 पर डिफ़ॉल्ट रूप से निर्धारित किया गया है; हालांकि, सबसेट की वास्तविक संख्या इनपुट पर निर्भर करती है। यहां, साइटोप्लर ने 10 अलग-अलग सबसेट का पता लगाया, जिसमें प्रत्येक फ़ाइल एक सबसेट का प्रतिनिधित्व कर रही थी।
    5. आउटपुट फ़ाइलों का नाम बदलते समय एक साधारण नाम (केवल वर्ण) का उपयोग करें, जो पहचान और आगे आसान बना देगा। सेवका चयन करके आउटपुट फ़ाइलों को सहेजें।
      नोट:बचत के बाद, साइटोप्लर द्वारा .fcs फ़ाइलों के साथ एक फ़ोल्डर बनाया जा रहा है, जिसमें प्रत्येक फ़ाइल साइटोप्लरमें पहचाने गए समूहों के अनुरूप है। अगला कदम साइटोफास्टकी मदद से फाइलों को आर में लोड किया जाएगा । यहां, उत्पन्न आउटपुट फाइलें अनुपूरक फाइलों 2.1-2.10 (साइटोप्लर आउटपुट फाइल) में प्रदान की जाती हैं।
    6. साइटोप्लर द्वारा उत्पन्न आउटपुट फ़ाइलों को नामित फ़ंक्शन के साथ आर में लोड करें: readCytosploreFCS।

      dirFCS <- "C:\ \ उपयोगकर्ता उपयोगकर्ता नाम \ ' डेस्कटॉप \ tostudy"
      cfData <-readCytosploreFCS (dir = dirFCS, colName = "विवरण")
    7. "समय" और "पृष्ठभूमि" जैसे कुछ मापदंडों को हटाकर डेटा को साफ करें। इसके अनावश्यक मापदंडों से संबंधित कॉलम की स्थिति की जांच करें और मैट्रिक्स से हटा दें।

      कोलनाम (cfData@expr)
      cfData@expr और लेफ्टिनेंट:- cfData@expr [,-सी (3,4,6,8:10,46:49,51:54)]

      नोट:उत्पन्न मैट्रिक्स के कॉलम नाम पढ़कर अनावश्यक कॉलम देखे जा सकते हैं। एक बार फिर कोलनाम (cfData@expr) चलाकर, यह सुनिश्चित करें कि केवल वांछित पैरामीटर प्राप्त किए जाएं।
    8. मार्कर को फिर से ऑर्डर करें ताकि वंश मार्कर पहले प्रदर्शित हों, इसके बाद कार्यात्मक मार्कर हों।

      cfData@expr और लेफ्टिनेंट:- cfData@expr[, सी (1,2,3,35,36,31,9,10,18,8,37,20,
      29,40,5,30,33,11,34,14,19,
      32,28,6,7,4,12,13,17,16,15,
      21,22,24,25,26,27,38,39)]

      नोट:चरण 2.1.8 वैकल्पिक है।
    9. मेटा डाटाफाइल को क्लीनिकल इन्फॉर्मेशन(सप्लीमेंट्री फाइल 3)वाली स्प्रेडशीट मेटाफाइल अपलोड करसाइटोप्लर से जेनरेटेड डाटा से लिंक करें।

      पुस्तकालय (readxl)
      मेटा <-read_excel ("C:\ \ उपयोगकर्ता उपयोगकर्ता नाम\ ' डेस्कटॉप \\sample_id.xlsx")
      cfData@samples और एलटी;- डेटा.फ्रेम (मेटा)

      नोट: साइटोप्लर द्वारा किया जा रहा क्लस्टरिंग अब समाप्त हो गया है। साइटोप्लर के लिए एक वैकल्पिक क्लस्टरिंग विकल्प फ्लोसोम है और धारा 2.2 में वर्णित है। एक बार दो क्लस्टरिंग चरणों में से एक के प्रदर्शन के बाद, दृश्य चरण (धारा 3) के साथ आगे बढ़ें।
  2. द्वारा किया जाने वाला क्लस्टरिंगFlowSOM
    1. सबसे पहले निम्नलिखित आदेश चलाकर आर में फ्लोसोम स्थापित करें:

      अगर (!Namespace की आवश्यकता है ("BiocManager", चुपचाप = सच है))
      इंस्टॉल.पैकेज ("बायोमैनेजर")
      बायोमैनेजर::इंस्टॉल ("फ्लोसोम")
      पुस्तकालय (फ्लोसोम)
    2. इसी तरह की विधि का उपयोग करके फ्लोकोर पैकेज स्थापित करें और निम्नलिखित को चलाकर इसे पर्यावरण में लोड करें:

      अगर (!Namespace की आवश्यकता है ("BiocManager", चुपचाप = सच है))
      इंस्टॉल.पैकेज ("बायोमैनेजर")
      बायोमैनेजर::इंस्टॉल ("फ्लोकोर")
      पुस्तकालय (फ्लोसोम)
    3. पूरक फाइलों में प्रदान किए गए कच्चे डेटा को लोड करें 4.1-4.8 (एफसीएस फ्लोसोम इनपुट), जो पहले READ.flowSet फ़ंक्शन के साथ आर में CD161+ घटनाओं पर गेट किए गए थे।

      fcs_raw और लेफ्टिनेंट;- read.flowSet (path="C:\\ उपयोगकर्ता नाम\', डेस्कटॉप \\toक्लस्टर", पैटर्न = ".fcs", परिवर्तन = झूठी, truncate_max_range = झूठी, बीज =123)
    4. उचित कॉलम का चयन करके प्रासंगिक जैविक मार्कर (हटा दें"पृष्ठभूमि" या "समय") और नीचे दिए गए कोड में दिखाए गए आर्केड5 तरीके से डेटा को बदलें (यहां, कॉलम 1, 2, 4, 5, 6, 17, 21, 24, 25, 34, 35, 37, 38, 51 को हटा दें, जो किसी भी जैविक मार्कर के अनुरूप नहीं हैं)। नीचे दिए गए कार्य में कोफैक्टर = 5 चुनकर, साइटोप्लरके साथ पहले लागू किए गए 5 का एक कोफैक्टर लागू करें।

      fcs_raw और एलटी;- एफएसआवेदन (fcs_raw, फ़ंक्शन (एक्स, कोफैक्टर=5){
      कोलनेम (एक्स) और एलटी;-fcs_raw [1]] @parameters@data $desc
      expr <-exprs (x)
      एक्सपीआर & असिंह (expr[-c(1,2,4,5,6,17,21,24,25,34,35,35,37,38,51)/cofactor)
      एक्स.एक्स.
      रिटर्न (x)})
    5. फ्लोसोम फ़ंक्शन का उपयोग करके डेटा को क्लस्टर करें। फ्लोसोम और साइटोप्लरकी तुलना करने के लिए, डेटा को दस सबसेटों में क्लस्टर करना चुनें क्योंकि पहले साइटोप्लरद्वारा प्राप्त आउटपुट ।

      fsom <-FlowSOM (fcs_raw, बदलें फंक्शन = झूठा, पैमाने = झूठा,
      scaled.center = झूठी, scaled.scale = झूठी, चुप = झूठी, colsToUse = c (1:37),
      nClus = 10, maxMeta = 10, महत्व = नल, बीज = 123)

      नोट:इसे उपयोगकर्ता द्वारा मैन्युअल रूप से बदला जा सकता है।
    6. प्रत्येक सेल को उसके चिन्हित सबसेट और नमूना आईडी पर असाइन करें।

      subset_id और लेफ्टिनेंट;-as.factor (fsom $FlowSOM $map$मैपिंग [,1])
      स्तर (subset_id) और एलटी;- fsom $ मेटाक्लस्टरिंग
      सिर (subset_id)
    7. समूह असाइनमेंट युक्त आर (सप्लीमेंट्री फाइल 5में उपलब्ध) में मेटाडेटा फाइल लोड करें और इसे .fcs फ़ाइलों से लिंक करें।

      नमूना और एलटी;-read_excel ("सी:\\ उपयोगकर्ता \\\\username\\'\-डेस्कटॉप\\sample_id.xlsx")
      नमूना और एलटी;-na.omit (नमूना)

      नमूना $नमूनाआईडी और एलटी;- एएस फैक्टर (नमूना $ नमूनाआईडी)
      नमूना $समूह & -as.factor (नमूना$समूह)
      नमूना $CSPLR_ST और lt;- as.factor (नमूना $CSPLR_ST)

      नमूना और एलटी;- as.data.frame (नमूना)
      नाम (नमूना) [3] <- "नमूनाID"
      नमूना आईडी और एलटी;- lapply (fsom $FlowSOM $ मेटाडेटा, समारोह (x) {प्रतिनिधि (x [1], प्रत्येक = लंबाई (x [1]:x [2])))))})
      एटीआर (नमूना, 'नाम') और एलटी;- नल
      नमूना आईडी और एलटी;- एएस फैक्टर (अनलिस्ट (नमूना))
      नमूना और एलटी;- डेटा.फ्रेम (नमूना)
      स्तर (नमूना ID) और lt;-पेस्ट ("आईडी", 1:मंद (नमूना) [1], sep="_")

      df <- डेटा.फ्रेम (subset_id, नमूना आईडी, fsom $ FlowSOM $ डेटा [, c (1:37)])
      नाम और lt;- data.frame (colpar=fcs_raw [1]]] @parameters@data $desc)
      कोलनाम (df) <-c ("क्लस्टरआईडी", "नमूनाID", नाम बदलना $colpar [c (1:37)])
      डीएफ $ क्लस्टरआईडी और एलटी;- एएस फैक्टर (डीएफ $ क्लस्टरआईडी)
      डीएफ $ नमूनाआईडी और एलटी;- एएस फैक्टर (डीएफ $ नमूनाआईडी)
    8. निम्नलिखित स्क्रिप्ट चलाकर फ्लोसोम से प्राप्त डेटाफ्रेम के आधार पर एक सीएफलिस्ट बनाएं:

      सीएफडेटा & सीएफलिस्ट (नमूने = नमूना,
      expr = df)
    9. मार्कर को साइटोप्लर विश्लेषण से आउटपुट के समान प्रदर्शित होने के लिए फिर से ऑर्डर करें।

      cfData@expr और लेफ्टिनेंट;- cfData@expr[, सी (1,2,34,36,37,10,23,24,31,22,
      38,15,8,3,27,9,11,28,35,26,
      14,33,17,20,21,18,25,29,13,
      30,12,16,32,4,5,6,7,19,39)]

      नोट: FlowSOM द्वारा क्लस्टरिंग अब समाप्त हो गया है । इसके बाद, क्लस्टरिंग आउटपुट का दृश्य प्रदर्शन करें।

3. विज़ुअलाइज़ेशन: पोस्ट-प्रोसेसिंग क्लस्टरिंग विश्लेषण

नोट:यह कदम एक विधि है जो दोनों क्लस्टरिंग विधियों के लिए आम है। इसलिए, इसे फ्लोसोम या साइटोप्लरके साथ क्लस्टरिंग के बाद किया जा सकता है।

  1. हीटमैप बनाने से पहले, नीचे दिए गए कोड में दिखाए गए फ़ंक्शन सेलकाउंट ्स का उपयोग करके प्रति नमूना गणना तालिका उत्पन्न करें। चूंकि कुछ समूहों में दूसरों की तुलना में कम कोशिकाएं होती हैं, इसलिए फ़ंक्शन सेलकाउंट्स के अंदर "स्केल = ट्रू" निर्दिष्ट करके प्रति क्लस्टर डेटा को स्केल करें, ताकि नमूनों के बीच फैलाव को आसानी से देखा जा सके।

    cfData <- सेलकाउंट्स (cfData, आवृत्ति = सच, पैमाने = सच)

    नोट:डेटा अब कल्पना की जा सकती है।
  2. हीटमैप के साथ कल्पना करें।
    नोट:इस पैकेज के मुख्य कार्यों में से एक साइटोहीटमैप्स है, जिसका उपयोग नमूनों के संबंध में निर्मित समूहों के फेनोटाइप के साथ-साथ उनकी विषमता की कल्पना करने के लिए किया जाता है।

    साइटोहीटमैप्स (cfData, समूह ="group", legend=TRUE)
  3. बॉक्सप्लॉट के साथ दृश्य
    नोट:फ़ंक्शन साइटोबॉक्सप्लॉट्स को कॉल करके डेटा को मात्रात्मक तरीके से दर्शाया जा सकता है। इस फ़ंक्शन का आउटपुट हर क्लस्टर के लिए प्रत्येक नमूने के अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है।
    1. चरण 3.1 में किए गए सेल काउंट को उत्पन्न करें, लेकिन प्रत्येक क्लस्टर की आवृत्ति प्राप्त करने के लिए डेटा को स्केल न करें।

      cfData <- सेलकाउंट्स (cfData, आवृत्ति = सच है, पैमाने = झूठा)
      साइटोबॉक्सप्लॉट्स (cfData, समूह = "समूह")
  4. औसत तीव्रता संकेत हिस्टोग्राम के साथ दृश्य
    नोट:औसत तीव्रता संकेत हिस्टोग्राम का प्रतिनिधित्व करके भी डेटा की कल्पना की जा सकती है।
    1. सीडी45, सीडी11सी और सीडी54: तीन मार्कर की अभिव्यक्ति तीव्रता की कल्पना करें।
    2. निम्नलिखित लाइन पर कॉल करके वांछित मार्कर के नाम देखें। मार्कर के नाम नोट करें और इसे msiPlot समारोह में शामिल करें।

      नाम (cfData@expr)

      नोट:यहां, CD45, CD11c, और CD54 पर ध्यान केंद्रित करें। मार्कर की सटीक वर्तनी की जांच करें और यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें:

      msiPlot (cfData, मार्कर = c ("89Y_CD45", "167Er_CD11c", "164Dy_CD54"), byGroup ='group')

Representative Results

वर्कफ्लो साइटोफास्ट (चित्रा 1)मूल रूप से विश्लेषण सॉफ्टवेयर (यानी, फ्लोसोम या साइटोप्लर)द्वारा संकुल किए गए डेटा का मात्रात्मक और गुणात्मक अवलोकन प्रदान करने के लिए है। साइटोफास्ट विश्लेषण में पहचाने गए सभी समूहों के हीटमैप और मार्कर अभिव्यक्ति(चित्रा 2 और चित्रा 3)के आधार पर कई संभावित आउटपुट चलाता है। शीर्ष पर डेंड्रोग्राम पहचाने गए समूहों के बीच पदानुक्रमित समानता का प्रतिनिधित्व करता है। ऊपरी पैनल प्रत्येक नमूने में इसी सबसेट की सापेक्ष मात्रा दिखाएक और हीटमैप प्रदर्शित करता है। दाईं ओर dendrogram नमूनों के बीच समानता से पता चलता है और नमूनों के बीच यूक्लिडियन दूरी पर प्रदर्शन पदानुक्रमित क्लस्टरिंग पर आधारित है । फ्लोसोम के लिए संयुक्त हीटमैप दिखाए जाते हैं और इसके बाद साइटोफास्ट इन फिगर 2 और साइटोप्लर के लिए और इसके बाद साइटोफास्ट के लिए चित्र3में साइटोफास्ट किया जाता है । साइटोफास्ट का उपयोग डेटा को मात्रात्मक रूप से प्रस्तुत करने और बॉक्सप्लॉट (साइटोबॉक्सप्लॉट्स फ़ंक्शन का उपयोग करके) में परिणामप्रदर्शित करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसा कि चित्र4 और चित्रा 5में दिखाया गया है।

इसी तरह के समूह दो अलग-अलग तरीकों (उदाहरण के लिए, साइटोप्लर से क्लस्टर 8 फ्लोसोमसे क्लस्टर 10 से मेल खाती हैं), और पीडी-1 और लैग-3 जैसे कुछ निरोधात्मक मार्कर की सह-अभिव्यक्ति अभी भी दोनों तरीकों से दिखाई दे रही थीं)। दोनों क्लस्टरिंग तरीकों ने पीडी-एल1 बनाम के बीच भेदभाव कीअनुमति दी । पीबीएस ने चूहों का इलाज किया। इसके विपरीत, दोनों तरीकों के बीच कुछ मतभेदों को उजागर किया जा सकता है। फ्लोसोम 2 क्लस्टर (एमएचसी-II+)की पहचान करता है, जबकि साइटोप्लर केवल एक क्लस्टर (एमएचसी-II+ मंद)दिखाता है। यह प्रारंभिक गेटिंग रणनीति के कारण है जिसमें एनके कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से CD161+ कोशिकाओं पर गेट किया गया था, फिर फ्लोसोमद्वारा आगे संसाधित किया गया था। हालांकि, साइटोप्लर स्वचालित रूप से पहले एचएसएनई स्तर पर CD45+ आबादी से कोशिकाओं को गेट किया जाता था, जिसे तब उच्च पदानुक्रमित स्तर में संकुल किया गया था। इस प्रकार, साइटोप्लर ने एनके सेल को परिभाषित किया कि सीडी 161 पर केंद्रित मैनुअल गेटिंग कैसे है। फिर भी, नमूनों के पदानुक्रमित क्लस्टरिंग को संरक्षित किया गया था, जैसा कि दाईं ओर dendrogram में दिखाया गया है, यह दर्शाता है कि दो समूहों (पीडी-एल 1 और पीबीएस) के बीच अलगाव चुने हुए क्लस्टरिंग विधि पर निर्भर नहीं था।

दोनों तरीकों का उपयोग करके समूहों की संख्या को मैन्युअल रूप से परिभाषित किया जा सकता है। साइटोफास्ट उपयोगकर्ता को अपने डेटा की विषमता का आकलन करने में सक्षम बनाता है और यह अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है कि उन समूहों की संख्या का चयन कैसे किया जाए जिसमें डेटा को विभाजित किया जाना चाहिए। अन्य सुविधाओं को साइटोफास्ट पैकेज में शामिल किया गया है, जैसे कि एमएसआईप्लॉट फ़ंक्शन (चरण 3.4.2), प्रति समूह हर मार्कर(चित्रा 6 और चित्रा 7)के औसत सिग्नल तीव्रता (एमएसआई) भूखंड को दिखाता है। यह फ़ंक्शन वैश्विक परिवर्तनों का पता लगाने की अनुमति देता है, जैसे पीडी-एल1-उपचारित समूह के एनके कोशिकाओं में सीडी 54 या सीडी 11सी की अभिव्यक्ति में वृद्धि। वैकल्पिक सुविधाओं को साइटोफास्ट पैकेज में शामिल किया जा सकता है, जैसे बार ग्राफ में डेटा प्रदर्शित करना और डेटा प्रतिनिधित्व के अन्य तरीकों। उत्तरार्द्ध में जीजीप्लॉट टूल्स को जोडऩे की आवश्यकता होती है, जिसे आर द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: साइटोफास्ट पैकेज का वर्कफ्लो। डेटा इम्यूनोथेरेपी के साथ उपचार के 3 दिन बाद एक ट्यूमर से बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री द्वारा उत्पन्न किया गया था या अनुपचारित छोड़ दिया गया था। दो अलग-अलग क्लस्टरिंग तकनीकों की तुलना की गई: साइटोप्लर और फ्लोसोम। साइटोफास्ट का उपयोग दोनों तकनीकों के बीच मतभेदों की कल्पना करने के लिए किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: साइटोप्लरके बाद साइटोफास्ट द्वारा विश्लेषण के अनुसार क्लस्टर अवलोकन और क्लस्टर बाहुल्य प्रति समूह। सभी एनके सेल समूहों (CD161+ कोशिकाओं को साइटोप्लरद्वारा स्वचालित रूप से परिभाषित किया गया है), जिन्हें इम्यूनोथेरेपी (पीडी-एल1) के 3 दिन बाद पहचाना गया था। दिखाया गया डेटा साइटोप्लर क्लस्टरिंग पर आधारित है और अनुपचारित और पीडी-एल1 उपचारित समूहों से पूल किया जाता है। ArcSinh5-बदल अभिव्यक्ति मार्कर के स्तर इंद्रधनुष पैमाने पर प्रदर्शित कर रहे हैं । निचले पैनल पर, प्रत्येक नमूने की सापेक्ष बहुतायत हरे से बैंगनी पैमाने पर प्रतिनिधित्व करती है। दाईं ओर dendrogram सबसेट आवृत्तियों के आधार पर नमूनों के बीच समानता का प्रतिनिधित्व करता है । आवृत्ति पैमाना मतलब के फैलाव का प्रतिनिधित्व करता है। एक कम या उच्च आवृत्ति क्रमशः हरे या बैंगनी रंग द्वारा दर्शाई जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: फ्लोसोमके बाद साइटोफास्ट द्वारा विश्लेषण के अनुसार क्लस्टर अवलोकन और क्लस्टर आदिम प्रति समूह। सभी एनके सेल क्लस्टर (CD161+ घटनाओं पर प्री-गेटेड) का हीटमैप, जिसे इम्यूनोथेरेपी (पीडी-एल1) के 3 दिन बाद पहचाना गया था। दिखाया गया डेटा FlowSOM क्लस्टरिंग पर आधारित है और अनुपचारित और पीडी-एल1 उपचारित समूहों से पूल किया जाता है। ArcSinh5-बदल अभिव्यक्ति मार्कर के स्तर इंद्रधनुष पैमाने पर प्रदर्शित कर रहे हैं । निचले पैनल पर, प्रत्येक नमूने की सापेक्ष बहुतायत हरे से बैंगनी पैमाने पर प्रतिनिधित्व करती है। दाईं ओर dendrogram सबसेट आवृत्तियों के आधार पर नमूनों के बीच समानता का प्रतिनिधित्व करता है । आवृत्ति पैमाना मतलब के फैलाव का प्रतिनिधित्व करता है। एक कम या उच्च आवृत्ति क्रमशः हरे या बैंगनी रंग द्वारा दर्शाई जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: साइटोप्लरद्वारा परिभाषित समूहों के बॉक्सप्लॉट के साथ साइटोफास्ट प्रतिनिधित्व। प्रत्येक क्लस्टर की आवृत्ति को बॉक्सप्लॉट में दर्शाया जाता है, जो दो समूहों (पीबीएस और पीडी-एल 1) में अलग हो जाता है। एक व्यक्ति डॉट एक माउस से मेल खाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: फ्लोसोमद्वारा परिभाषित समूहों के बॉक्सप्लॉट के साथ साइटोफास्ट प्रतिनिधित्व। प्रत्येक क्लस्टर की आवृत्ति को बॉक्सप्लॉट में दर्शाया जाता है, जो दो समूहों (पीबीएस और पीडी-एल 1) में अलग हो जाता है। एक व्यक्ति डॉट एक माउस से मेल खाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: एनके कोशिकाओं से सिग्नल तीव्रता भूखंडों का वितरण स्वचालित रूप से साइटोप्लरद्वारा गेट किया जाता है। संकेत तीव्रता का वितरण तीन विशिष्ट मार्कर के लिए एक हिस्टोग्राम में दिखाया गया है: CD45, CD11c, और CD54। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: एनके कोशिकाओं से सिग्नल तीव्रता भूखंडों का वितरण स्वचालित रूप से फ्लोसोमद्वारा गेट किया जाता है। संकेत तीव्रता का वितरण तीन विशिष्ट मार्कर के लिए एक हिस्टोग्राम में दिखाया गया है: CD45, CD11c, और CD54, समूहों PBS और पीडी-L1 द्वारा अलग । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

साइटोफास्ट एक रैपिड कम्प्यूटेशनल टूल है जो उपचार-विशिष्ट सेलुलर सबसेट को हाइलाइट और मात्रा प्रदान करके साइटोमेट्रिक डेटा की त्वरित और वैश्विक खोज प्रदान करता है। वर्णित प्रोटोकॉल का उद्देश्य साइटोप्लर या फ्लोसोमके साथ विश्लेषण को आगे बढ़ाना है । अन्य क्लस्टरिंग विश्लेषण उपकरण साइटोफास्टके लिए उपयुक्त हैं, लेकिन इसके लिए प्रत्येक सेल को सबसेट में आवंटित करने के लिए साइटोफास्ट के उपयोग की आवश्यकता होती है। साइटोफास्ट,हालांकि, एक क्लस्टरिंग विधि नहीं है, और इसलिए उपयोग से पहले क्लस्टरिंग प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है।

यहां किए गए विश्लेषण से पता चला है कि ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट में कुछ सीडी 161+ एनके सेल सबसेट पीडी-एल1 नाकाबंदी के प्रति संवेदनशील थे। यह उनके फेनोटाइप और बहुतायत में परिवर्तन से प्रमाणित था, जो साइटोप्लर और फ्लोसोम दोनों को क्लस्टरिंग विधियों के रूप में उपयोग करके देखा गया था। दोनों तरीकों ने मुख्य एनके सेल क्लस्टर (CD11b+ NKG2A+ +)को थोड़ा अलग आवृत्तियों (साइटोप्लरके लिए 15%-20%, FlowSOMके लिए 30%-40%) के साथ प्रतिष्ठित किया। बहुतायत में अंतर और इस सन्निकटन वैश्विक पैटर्न को प्रभावित नहीं किया, क्योंकि दोनों Dendrograms चित्रा 2 और चित्रा 3 के सही पैनलों में प्रदर्शित इसी तरह के परिणाम दिखाया । साइटोफास्टका उपयोग करके, एनके सेल क्लस्टर फेनोटाइप और बहुतायत के विश्लेषण के आधार पर पीडी-एल1-इलाज और अनुपचारित चूहों को अलग करने के लिए इस प्रकार (चुना गया क्लस्टरिंग विधि से स्वतंत्र) संभव है।

दर्ज मापदंडों के आधार पर, प्रोटोकॉल में संशोधन ों की आवश्यकता है। विशेष रूप से, क्लस्टरिंग विश्लेषण करते समय समय और पृष्ठभूमि जैसे कुछ मापदंडों को हटा दिया जाना चाहिए। इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक कोशिका को एक सबसेट को सौंपा गया है। सीएफडेटा फ़ंक्शन बस प्रति क्लस्टर प्रति क्लस्टर कच्चे सेल को सीएफलिस्ट में जोड़ेगा। इस स्टेप से सेक्शन 3 में बताए गए अनुसार साइटोहीटिंगमैप बनाया जा सकता है।

साइटोफास्ट को विभिन्न क्लस्टरिंग विधियों की तुलना करने के लिए एक दृश्य और क्वांटिफिकेशन टूल के रूप में सफलतापूर्वक उपयोग किया गयाहै। यह आर पैकेज उन्नत सुविधाओं के साथ भी संगत है, जैसे ग्लोबलटेस्ट14,जो नैदानिक चर ों का उपयोग करके समूहों के समूहों के बीच संघों का परीक्षण कर सकता है। भविष्य में, ग्लोबलटेस्ट टूल और अन्य एल्गोरिदम को अधिक गहराई से दृश्य और मात्राकरण के लिए साइटोफास्ट के साथ एकीकृत किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम प्रस्ताव संख्या ६७५७४३ (ISPIC) के तहत एक H2020 MSCA पुरस्कार के यूरोपीय आयोग से धन स्वीकार करते हैं । हम प्रोटोकॉल का परीक्षण करने के लिए टेटे वैन डेर स्लुइस और आइरिस पैराडिक का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Computer Dell NA NA

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साइटोफास्ट और अपस्ट्रीम क्लस्टरिंग मेथड्स फ्लोसोम और साइटोप्लर का उपयोग करके उच्च-आयामी साइटोमेट्री डेटा का दृश्यीकरण और क्वांटिफिकेशन
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Beyrend, G., Stam, K., Ossendorp, F., Arens, R. Visualization and Quantification of High-Dimensional Cytometry Data using Cytofast and the Upstream Clustering Methods FlowSOM and Cytosplore. J. Vis. Exp. (154), e60525, doi:10.3791/60525 (2019).

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