Summary
Cytofast er et visualiseringsverktøy som brukes til å analysere utdata fra klynger. Cytofast kan brukes til å sammenligne to klynge metoder: FlowSOM og Cytosplore. Cytofast kan raskt generere en kvantitativ og kvalitativ oversikt over masse flowcytometri data og fremheve de viktigste forskjellene mellom ulike klynger algoritmer.
Abstract
Kompleksiteten av data generert av masse flowcytometri har nødvendig nye verktøy for å raskt visualisere analytiske utfall. Klynger metoder som Cytosplore eller FlowSOM brukes for visualisering og identifisering av celle klynger. For nedstrøms analyse, en nyutviklet R-pakke, Cytofast, kan generere en rask visualisering av resultater fra klynger metoder. Cytofast tar hensyn til fenotypiske karakterisering av celle klynger, beregner celle klyngen overflod, så kvantitativt sammenligner grupper. Denne protokollen forklarer anvendelser av Cytofast til bruk av masse flowcytometri data basert på modulering av immunsystemet i tumor mikromiljøet (dvs. den naturlige MORDEREN [NK] celle respons) på tumor utfordring etterfulgt av IMMUNTERAPI (PD-L1 blokade). Demonstrasjon av nytten av Cytofast med FlowSOM og Cytosplore vises. Cytofast genererer raskt visuelle representasjoner av gruppe-relaterte immun celle klynger og sammenhenger med immunsystem sammensetning. Forskjeller er observert i klynge analysen, men skille mellom grupper er synlige med både klynge metoder. Cytofast visuelt viser mønstrene indusert av PD-L1 behandling som inkluderer en høyere overflod av aktivert NK celle delsett, uttrykker en høyere intensitet av aktiverings markører (dvs. CD54 eller CD11c).
Introduction
Masse flowcytometri (flowcytometri av tid-av-flyreise, eller CyTOF) innrømmer oppdagelsen av en rikt utvalg av intracellulære eller ekstracellulære biomarkører inne millioner av enkeltceller. De tredimensjonale egenskapene til masse flowcytometri data nødvendiggjør visse analyseverktøy, for eksempel celle klynge teknikker som SPADE1, FlowMaps2, FlowSOM3, Phenograph4, VorteX5og stillas kart6. I tillegg har ulike dimensionality reduksjon-baserte teknikker er utviklet (dvs. rektor komponent analyse [PCA]7, t-distribuerte Stokastisk nabo embedding [t-sne]8, hierarkiske STOKASTISK nabo embedding [HSNE]9, UNIFORM manifold tilnærming og projeksjon [UMAP]10, og diffusjon kart11) for å forbedre hastigheten, tolkning og visualisering av høy-dimensjonale datasett.
Nedstrøms analyse av høy-dimensjonal flyt og masse analytiske data ofte mangler automatiske prosesser for å utføre statistiske tester på klynge frekvens og koblinger med kliniske utfall. Tidligere har vi utviklet en R-basert arbeidsflyt kjent som Cytofast12, som gir mulighet for visuell og kvantitativ nedstrøms analyser av klynger teknikker av Cytosplore eller FlowSOM.
Protokollen beskrevet her klargjør bruken av Cytofast i R og viser hvordan du kan generere kvantitative og kvalitative heatmaps og grafer. Videre forenkler det fastsettelse av forbindelser mellom observerte immun fenotyper og kliniske utfall. Denne rapporten beskriver også analysen av et bestemt masse flowcytometri datasett ved hjelp av to forskjellige klynge prosedyrer: FlowSOM og Cytosplore. Ved å bruke Cytofast med både Clustering metoder, er det tilsvarende vist at aktiveringen FENOTYPE av NK celler er påvirket av PD-L1 immune Checkpoint blokade.
Protocol
Alle dyr eksperimenter ble godkjent av Animal eksperimenter Committee of LUMC og ble henrettet i henhold til dyre eksperimentering retningslinjer for LUMC i samsvar med retningslinjene for nederlandske og europeiske komiteer.
Merk: for eksperimentelle oppsett var C57BL/6-mus subkutant inokulert på høyre flanke med murine kolon tumor MC38 ved en konsentrasjon på 0,3 x 106 celler/200 μL av fosfat-BUFRET saltvann (PBS). Etter 10 dager, da svulster var håndgripelig, ble musene behandlet med PD-L1 blokkering antistoffer (klone MIH-5, 200 μg/mus, intra-bukhulen injeksjon) eller var mock-behandlet. Den svulster ble resected 3 dager senere etter PD-L1 injeksjon, behandlet ex Vivo, og analysert av CyTOF masse flowcytometri bruker 38 markører13.
1. utstyr og programvare for data analyse
Merk: Bruk en datamaskin (Windows 7 eller nyere) og prosessor I5 på 2,4 GHz eller tilsvarende, installert minne RAM 6 GB, og 10 GB ledig plass på harddisken. R-pakken Cytofast bruker eksisterende funksjoner: hovedsakelig flowCore, pheatmapog ggplot. Kommandolinjene som skal utføres i R, er inkludert i protokollen. Ressurs for R-instruksjoner finner du på https://Education.rstudio.com/.
- For å installere Cytofast -pakken, start R (versjon "3,6") og Installer Bioconductor versjon 3,9 ved å skrive inn følgende kode:
if (! requireNamespace ("BiocManager", stille = TRUE))
Install. Packages ("BiocManager")
BiocManager:: install ("cytofast") - Kontroller at pakken er lastet inn i ønsket miljø ved å kjøre følgende:
bibliotek (cytofast)
2. opprette klynger
Merk: for å presentere de to Clustering metoder Cytosplore og FLOWSOM med Cytofast, det NK celler (CD161+) i tumor mikro-miljøet 3 dager etter PD-L1 behandling er analysert.
- Klynger utført avCytosplore
- Etter dataoverfører og installere Cytosplore, kroen for < www. Cytosplore. org >, laste opp. FCS filer (supplerende filer 1.1-1.8 [Cytosplore input filer]) ved å klikke fil | Åpne FCS fil (er) i Cytosplore. Legg til en unik eksempelkode som kanal ved å klikke Legg til unik eksempelkode som kanal når du blir bedt om det, og velg en kofaktor for den hyperbolske ARCSINH transformasjonen (standard er 5).
- Velg Kjør H-sne, Kjør et HSNE-nivå på 3, og vent til kartet genereres.
Merk: dette trinnet kan kreve litt tid, avhengig av antall celler analysert og NIVÅET av HSNE valgt. - På det første HSNE-nivået kontrollerer du cellene som er positive for CD161. Velg CD161+ celler og høyreklikk Zoom inn utvalg. På andre nivå, gjenta prosedyren for å nå det tredje nivået med bare CD161+ Events.
- Når den siste tSNE kartet er generert, lagre klynger definert av Cytosplore ved å høyreklikke på tSNE kartet og velg Lagre klynger. Velg katalogen av utdatafiler som bedt av Cytosplore og Merk denne plasseringen, fordi denne katalogen vil da bli brukt til å laste. FCS filer til R.
Merk: antall delsett kan endres manuelt ved å endre Sigma-verdien. Sigma-verdien er satt som standard på 30; det faktiske antallet delsett avhenger imidlertid av inn dataene. Her oppdaget Cytosplore 10 forskjellige delsett, der hver fil representerer ett delsett. - Bruk et enkelt navn (bare tegn) når du endrer navn på utdatafiler, som vil gjøre identifisering og videre håndtering enklere. Lagre utdatafiler ved å velge Lagre.
Merk: etter lagring, en mappe som blir opprettet av Cytosplore med. FCS filer, med hver fil som tilsvarer de identifiserte klynger i Cytosplore. Det neste trinnet vil være å laste filene inn i R ved hjelp av Cytofast. Her er de genererte utdatafiler leveres i utfyllende Files 2.1-2.10 (Cytosplore output filer). - Last output filer generert av Cytosplore til R med den utpekte funksjonen: readCytosploreFCS.
dirFCS <-"C:\\Users\\username\\Desktop\\tostudy"
cfData <-readCytosploreFCS (dir = dirFCS, colNames = "beskrivelse") - Rengjør data ved å fjerne noen parametre som "tid" og "bakgrunn". Sjekk plasseringen av kolonnen knyttet til dens unødvendige parametre og fjerne den fra matrisen.
colnames (cfData@expr)
cfData@expr <-cfData@expr [,-c (3, 4, 6, 8:10, 46:49, 51:54)]
Merk: de unødvendige kolonnene kan ses ved å lese kolonnenavnene til den genererte matrisen. Ved å kjøre colnames (cfData@expr) igjen, må du sørge for at bare de ønskede parametrene er innhentet. - Endre rekkefølgen på markørene slik at slekts markører vises først, etterfulgt av funksjons markører.
cfData@expr <-cfData@expr [, c (1, 2, 3, 35, 36, 31, 9, 10, 18, 8, 37, 20,
29, 40, 5, 30, 33, 11, 34, 14, 19,
32, 28, 6, 7, 4, 12, 13, 17, 16, 15,
21, 22, 24, 25, 26, 27, 38, 39)]
Merk: Step 2.1.8 er valgfritt. - Koble meta-datafile til de genererte dataene fra Cytosplore ved å laste opp regneark metafil som inneholder klinisk informasjon (tilleggsfil 3).
bibliotek (readxl)
meta <-read_excel ("C:\\Users\\username\\Desktop\\ sample_id. xlsx")
cfData@samples <-data. Frame (meta)
Merk: klynging som utføres av Cytosplore er nå ferdig. En alternativ klynge alternativ til Cytosplore er FlowSOM og er beskrevet i avsnitt 2,2. Når en av de to klynge trinnene utføres, fortsetter du med visualiserings trinnet (del 3).
- Klynger utført avFlowSOM
- Først installere FlowSOM i R ved å kjøre følgende kommando:
if (! requireNamespace ("BiocManager", stille = TRUE))
Install. Packages ("BiocManager")
BiocManager:: install ("FlowSOM")
bibliotek (FlowSOM) - Installer flowCore-pakken ved hjelp av en lignende metode, og Last den inn i miljøet ved å kjøre følgende:
if (! requireNamespace ("BiocManager", stille = TRUE))
Install. Packages ("BiocManager")
BiocManager:: install ("flowCore")
bibliotek (FlowSOM) - Last rådata gitt i supplerende filer 4.1-4.8 (FCS FlowSOM input), som tidligere var GATED på CD161 + hendelser, i R med Read. flowSet funksjon.
fcs_raw <-Read. flowSet (bane = "C:\\Users\\username\\Desktop\\tocluster", Pattern = ". FCS", transformasjon = FALSE, truncate_max_range = FALSE, Seed = 123) - Velg relevante biologiske markører (Fjern "bakgrunn" eller "tid") ved å velge de riktige kolonnene og transformere dataene på en arcsinh5 måte som vist i koden nedenfor (her fjerner du kolonnene 1, 2, 4, 5, 6, 17, 21, 24, 25, 34, 35, 37, 38, 51, som ikke samsvarer med noen biologiske markører). Påfør en kofaktor på 5 som tidligere brukt med Cytosplore, ved å velge kofaktor = 5 i funksjonen nedenfor.
fcs_raw <-fsApply (fcs_raw, funksjon (x, kofaktor = 5) {
colnames (x) <-fcs_raw [[1]] @parameters @data $ DESC
uttr <-exprs (x)
uttr <-ARCSINH (uttr [,-c (1, 2, 4, 5, 6, 17, 21, 24, 25, 34, 35, 37, 38, 51)]/kofaktor)
exprs (x) <-uttr
Return (x)}) - Klynge dataene ved hjelp av FlowSOM -funksjonen. Hvis du vil sammenligne FlowSOM og Cytosplore, velger du å klynge dataene i ti delsett som utdata som tidligere ble gitt av Cytosplore.
fsom <-FlowSOM (fcs_raw, transformFunction = USANN, skala = USANN,
skalert. Center = FALSE, skalert. Scale = USANN, lydløs = USANN, colsToUse = c (1:37),
nClus = 10, maxMeta = 10, viktighet = NULL, frø = 123)
Merk: Dette kan endres manuelt av brukeren. - Tildel hver celle til den identifiserte delsettet og eksempel-IDen.
subset_id <-AS. Factor (fsom $ FlowSOM $ kart $ kartlegging [, 1])
nivåer (subset_id) <-fsom $ metaclustering
hode (subset_id) - Last inn metadata-filen i R (tilgjengelig i supplerende fil 5) inneholder gruppeoppgaven og koble den til. FCS filer.
sampleid <-read_excel ("C:\\Users\\username\\Desktop\\ sample_id. xlsx")
sampleid <-na. Utelat (sampleid)
sampleid $ sampleID <-AS. Factor (sampleid $ sampleID)
sampleid $ Group <-AS. Factor (sampleid $ gruppe)
sampleid $ CSPLR_ST <-AS. Factor (sampleid $ CSPLR_ST)
sampleid <-AS. data. Frame (sampleid)
navn (sampleid) [3] <-"sampleID"
sampleID <-lapply (fsom $ FlowSOM $ metaData, funksjon (x) {rep (x [1], hver = lengde (x [1]: x [2]))})
attr (sampleID, ' navn ') <-NULL
sampleID <-AS. Factor (unlist (sampleID))
sampleid <-data. Frame (sampleid)
nivåer (sampleID) <-paste ("ID", 1: Dim (sampleID) [1], Sep = "_")
DF <-data. Frame (subset_id, sampleID, fsom $ FlowSOM $ data [, c (1:37)])
endre navn på <-data. Frame (colpar = fcs_raw [[1]] @parameters @data $ DESC)
colnames (DF) <-c ("clusterID", "sampleID", gi nytt navn $ colpar [c (1:37)])
DF $ clusterID <-AS. Factor (DF $ clusterID)
DF $ sampleID <-AS. Factor (DF $ sampleID) - Opprett en cfList basert på dataframe Hentet fra FlowSOM ved å kjøre følgende skript:
cfData <-cfList (samples = sampleid,
uttr = DF) - Endre rekkefølgen på markørene slik at de vises på samme måte som utdataene fra Cytosplore -analysen.
cfData@expr <-cfData@expr [, c (1, 2, 34, 36, 37, 10, 23, 24, 31, 22,
38, 15, 8, 3, 27, 9, 11, 28, 35, 26,
14, 33, 17, 20, 21, 18, 25, 29, 13,
30, 12, 16, 32, 4, 5, 6, 7, 19, 39)]
Merk: klynging av FlowSOM er nå ferdig. Deretter utfører du visualisering av klynge utdataene.
- Først installere FlowSOM i R ved å kjøre følgende kommando:
3. visualisering: post-prosessering Clustering analyse
Merk: dette trinnet er en metode som er felles for begge klynger metoder. Derfor kan det utføres etter klynging enten med FlowSOM eller Cytosplore.
- Før du oppretter heatmaps, genererer du telle tabellen per prøve ved å bruke funksjonen cellCounts som vist i koden nedenfor. Siden noen klynger inneholder færre celler enn andre, skalerer du dataene per klynge ved å angi "Scale = TRUE" i funksjonen cellCounts, slik at spredningen mellom prøvene lett kan ses.
cfData <-cellCounts (cfData, frekvens = sann, skala = sann)
Merk: dataene kan nå bli visualisere. - Visualiser med heatmap.
Merk: en av de viktigste funksjonene i denne pakken er cytoHeatmaps, som brukes til å visualisere fenotype av skapte klynger så vel som deres heterogenitet med hensyn til prøvene.
cytoHeatmaps (cfData, Group = "gruppe", Legend = sann) - Visualisering med Boxplots
Merk: data kan representeres på en kvantitativ måte ved å kalle funksjonen cytoBoxplots. Utdataene fra denne funksjonen representerer andelen av hvert utvalg for hver klynge.- Generer celle tellingen som fullført i trinn 3,1, men ikke Skaler dataene for å oppnå hyppigheten for hver klynge.
cfData <-cellCounts (cfData, frekvens = sann, skalering = USANN)
cytoBoxplots (cfData, gruppe = "gruppe")
- Generer celle tellingen som fullført i trinn 3,1, men ikke Skaler dataene for å oppnå hyppigheten for hver klynge.
- Visualisering med median intensitet signal histogram
Merk: dataene kan også bli visualisere ved å representere median intensitet signal histogram.- Visualiser uttrykket intensitet av tre markører: CD45, CD11c, og CD54.
- Kontroller navnene på de ønskede markørene ved å ringe følgende linje. Legg merke til markør navnene og ta den med i msiPlot-funksjonen.
navn (cfData@expr)
Merk: her, fokus på CD45, CD11c, og CD54. Kontroller nøyaktig stavemåte av markørene og Juster om nødvendig:
msiPlot (cfData, markører = c ("89Y_CD45", "167Er_CD11c", "164Dy_CD54"), byGroup = "gruppe")
Representative Results
Arbeidsflyten Cytofast (figur 1) er ment å gi en kvantitativ og kvalitativ oversikt over dataene som opprinnelig ble gruppert etter analyseprogramvare (dvs. FlowSOM eller Cytosplore). Cytofast kjører flere mulige utganger, inkludert heatmap av alle klynger identifisert i analysen og basert på markør uttrykk (figur 2 og Figur 3). Dendrogram på toppen representerer den hierarkiske likheten mellom de identifiserte sektorgruppene. Det øvre panelet viser en annen heatmap som viser det relative antallet tilsvarende delsett i hvert utvalg. Dendrogram til høyre viser likheten mellom prøver og er basert på hierarkisk klynging utført på euklidsk avstander mellom prøver. De kombinerte heatmaps er vist for FlowSOM etterfulgt av Cytofast i figur 2 og for Cytosplore etterfulgt av Cytofast i Figur 3. Cytofast kan også brukes til å presentere data kvantitativt og vise resultatene i Boxplots (ved hjelp av cytoBoxplots-funksjonen), som vist i Figur 4 og figur 5.
Lignende klynger ble funnet mellom de to ulike metoder (f. eks klynge 8 fra Cytosplore tilsvarer klynge 10 fra FlowSOM), og co-uttrykk for noen hemmende markører som PD-1 og lag-3 var fortsatt synlig i begge metoder). Begge Clustering metoder tillatt diskriminering mellom PD-L1 vs. PBS behandlet mus. I kontrast kan noen forskjeller mellom begge metodene utheves. FlowSOM identifiserer 2 KLYNGER (MHC-II+), mens Cytosplore viser bare én klynge (MHC-II+ Dim). Dette er på grunn av den første gating strategien der NK celler ble manuelt gated på CD161+ celler, deretter videre behandlet av FlowSOM. Men Cytosplore automatisk gated celler fra CD45+ BEFOLKNINGEN på det første HSNE nivå, som deretter ble gruppert i et høyere hierarkisk nivå. Dermed Cytosplore definert NK cellen delsett mer presist enn hvordan manuell gating fokusert på CD161. Likevel ble hierarkisk gruppering av prøvene bevart, som vist i dendrogram til høyre, som indikerer at segregering mellom de to gruppene (PD-L1 og PBS) ikke var avhengig av den valgte klynge metoden.
Antall klynger kan defineres manuelt ved hjelp av begge metodene. Cytofast gjør det mulig for brukeren å vurdere heterogenitet av sine data og kan gi innsikt i hvordan du velger antall klynger som dataene skal deles. Andre funksjoner er inkludert i Cytofast pakken, slik som msiPlot funksjon (trinn 3.4.2), viser median signal INTENSITET (MSI) tomten av hver markør per gruppe (figur 6 og figur 7). Denne funksjonen gjør det mulig å oppdage globale endringer, for eksempel økninger i uttrykket CD54 eller CD11c i NK-celler i PD-L1-behandlede gruppen. Valgfrie funksjoner kan innlemmes i Cytofast -pakken, som å vise data i stolpediagrammer og andre metoder for data representasjon. Sistnevnte krever tillegg av ggplot verktøy, som kan genereres av R.
Figur 1: arbeidsflyt for Cytofast -pakken. Dataene ble generert av masse flowcytometri fra en svulst 3 dager etter behandling med immunterapi eller venstre ubehandlet. To forskjellige klynger teknikker ble sammenlignet: Cytosplore og FlowSOM. Cytofast ble brukt til å visualisere forskjellene mellom de to teknikkene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Cluster oversikt og klynge overflod per gruppe som analyseres av Cytofast etter Cytosplore. Heatmap av alle NK celle klynger (CD161+ celler definert automatisk av Cytosplore), som ble identifisert 3 dager etter immunterapi (PD-L1). Data som vises er basert på Cytosplore Clustering og samles fra UBEHANDLET og PD-L1 behandlet grupper. Nivåer av ArcSinh5-transformert uttrykks markør vises på en regnbue skala. På det nederste panelet representeres den relative mengden av hvert utvalg av den grønne-til-lilla skalaen. Dendrogram til høyre representerer likheten mellom prøver basert på delsett frekvenser. Frekvens skalaen representerer spredningen av gjennomsnittet. En lav eller høy frekvens representeres av henholdsvis en grønn eller lilla farge. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Cluster oversikt og klynge overflod per gruppe som analyseres av Cytofast etter FlowSOM. Heatmap av alle NK celle klynger (pre-gated på CD161+ Events), som ble identifisert 3 dager etter IMMUNTERAPI (PD-L1). Data som vises er basert på FlowSOM Clustering og samles fra UBEHANDLET og PD-L1 behandlet grupper. Nivåer av ArcSinh5-transformert uttrykks markør vises på en regnbue skala. På det nederste panelet representeres den relative mengden av hvert utvalg av den grønne-til-lilla skalaen. Dendrogram til høyre representerer likheten mellom prøver basert på delsett frekvenser. Frekvens skalaen representerer spredningen av gjennomsnittet. En lav eller høy frekvens representeres av henholdsvis en grønn eller lilla farge. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Cytofast representasjon med Boxplots av klynger definert av Cytosplore. Hyppigheten av hver klynge er representert i en boxplot, delt inn i de to gruppene (PBS og PD-L1). En enkelt prikk tilsvarer en mus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Cytofast representasjon med Boxplots av klynger definert av FlowSOM. Hyppigheten av hver klynge er representert i en boxplot, delt inn i de to gruppene (PBS og PD-L1). En enkelt prikk tilsvarer en mus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: fordeling av signal intensitet tomter fra NK celler automatisk gated by Cytosplore. Fordelingen av signal intensitet vises i et histogram for tre spesifikke markører: CD45, CD11c og CD54. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: fordeling av signal intensitet tomter fra NK celler automatisk gated by FlowSOM. Fordeling av signal intensitet vises i et histogram for tre spesifikke markører: CD45, CD11c og CD54, adskilt av grupper PBS og PD-L1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggsfiler 1.1 – 1.8. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Utfyllende filer 2.1 – 2.10. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Tilleggsfil 3. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Supplerende filer 4.1 – 4.8. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Tilleggsfil 5. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Discussion
Cytofast er en rask beregningsorientert verktøy som gir en rask og global utforskning av analytiske data ved å markere og kvantifisere behandling-spesifikke cellulære delsett. Protokollen beskrevet tar sikte på å videre behandle Clustering analyser med Cytosplore eller FlowSOM. Andre klynge analyseverktøy er egnet for Cytofast, men dette krever bruk av Cytofast for å tilordne hver celle til et delsett. Cytofaster imidlertid ikke en klynge metode, og krever derfor klynge prosedyrer før bruk.
Analysen utført her viste at visse CD161+ NK celle delsett i tumor mikromiljøet var følsomme for en PD-L1 blokade. Dette var dokumentert av endringer i deres fenotype og overflod, som ble observert ved hjelp av både Cytosplore og FlowSOM som Clustering metoder. Begge metodene skilte de viktigste NK celle klyngen (CD11b+ NKG2A+) med litt forskjellige frekvenser (15%-20% for Cytosplore, 30%-40% for FlowSOM). Forskjellene i overflod og denne tilnærmingen ikke påvirke det globale mønsteret, fordi begge dendrograms vises i høyre paneler av figur 2 og Figur 3 viste lignende resultater. Ved å bruke Cytofast, er det dermed mulig (uavhengig av Clustering metoden valgt) til skille PD-L1-behandlet og ubehandlet mus basert på analyser av NK celle klynge fenotype og overflod.
Avhengig av de registrerte parametrene, er endringer i protokollen nødvendig. Nærmere bestemt må enkelte parametere, for eksempel tid og bakgrunn, fjernes når du utfører klynge analysen. I tillegg er det viktig at hver celle er tilordnet et delsett. CfData-funksjonen vil ganske enkelt legge til rå celle antall per klynge per prøve i cfList. Fra dette trinnet kan cytoheatmap bygges som forklart i avsnitt 3.
Cytofast har blitt brukt som en visualisering og kvantifisering verktøy for å sammenligne ulike Clustering metoder13. Denne R-pakken er også kompatibel med avanserte funksjoner, for eksempel globaltest14, som kan teste assosiasjoner mellom grupper av klynger ved hjelp av kliniske variabler. I fremtiden kan globaltest verktøyet og andre algoritmer integreres med Cytofast for mer dyptgående visualisering og kvantifisering.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi erkjenner finansiering fra Europakommisjonen av en H2020 MSCA-pris under forslagsnummer 675743 (ISPIC). Vi takker Tetje Van der Sluis og Iris Pardieck for å teste protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer | Dell | NA | NA |
References
- Anchang, B., et al. Visualization and cellular hierarchy inference of single-cell data using SPADE. Nature Protocols. 11 (7), 1264-1279 (2016).
- Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16 (3), 323-337 (2015).
- Van Gassen, S., et al. FlowSOM: Using self-organizing maps for visualization and interpretation of cytometry data. Cytometry A. 87 (7), 636-645 (2015).
- Levine, J. H., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13 (6), 493-496 (2016).
- Spitzer, M. H., et al. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
- Hotelling, H. Analysis of a complex of statistical variables into principal components. Journal of Educational Psychology. 24 (6), 417-441 (1933).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. , (2008).
- Pezzotti, N., Hollt, T., Lelieveldt, B., Eisemann, E., Vilanova, A. Hierarchical Stochastic Neighbor Embedding. Computer Graphics Forum. 35 (3), 21-30 (2016).
- Becht, E., et al. Dimensionality reduction for visualizing single-cell data using UMAP. Nature Biotechnology. 37, 38 (2018).
- Haghverdi, L., Buettner, F., Theis, F. J. Diffusion maps for high-dimensional single-cell analysis of differentiation data. Bioinformatics. 31 (18), 2989-2998 (2015).
- Beyrend, G., Stam, K., Höllt, T., Ossendorp, F., Arens, R. Cytofast: A workflow for visual and quantitative analysis of flow and mass cytometry data to discover immune signatures and correlations. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 435-442 (2018).
- Beyrend, G., et al. PD-L1 blockade engages tumor-infiltrating lymphocytes to co-express targetable activating and inhibitory receptors. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7 (1), 217 (2019).
- Goeman, J. J., van de Geer, S. A., de Kort, F., van Houwelingen, H. C. A global test for groups of genes: testing association with a clinical outcome. Bioinformatics. 20 (1), 93-99 (2004).
