Summary
Cytofast är ett visualiseringsverktyg som används för att analysera utdata från klustring. Cytofast kan användas för att jämföra två kluster metoder: Flowsom och cytosplore. Cytofast kan snabbt generera en kvantitativ och kvalitativ översikt av massan flödescytometrianalys data och belysa de viktigaste skillnaderna mellan olika klusteralgoritmer.
Abstract
Komplexiteten av data som genereras av masscytometry har krävt nya verktyg för att snabbt visualisera analytiska resultat. Kluster metoder som Cytosplore eller flowsom används för visualisering och identifiering av cell kluster. För nedströms analys, ett nyutvecklat R-paket, Cytofast, kan generera en snabb visualisering av resultat från kluster metoder. Cytofast tar hänsyn till fenotypisk karakterisering av cell kluster, beräknar cell klustret överflöd, sedan kvantitativt Jämför grupper. Detta protokoll förklarar tillämpningarna av Cytofast till användningen av massa flödescytometrianalys data baserat på modulering av immunförsvaret i tumören mikromiljö (dvs, den naturliga mördaren [NK] cell Response) på tumör Challenge följt av immunterapi (PD-L1 blockad). Demonstration av nyttan av Cytofast med Flowsom och cytosplore visas. Cytofast genererar snabbt visuella representationer av grupprelaterade immun cells kluster och korrelationer med immunsystemets sammansättning. Skillnader observeras i klusteranalys, men separation mellan grupper är synliga med båda kluster metoder. Cytofast visuellt visar de mönster som INDUCERAS av PD-L1 behandling som omfattar ett högre överflöd av aktiverade NK cell undergrupper, uttrycker en högre intensitet av aktiverings markörer (dvs, CD54 eller CD11c).
Introduction
Masscytometri (cytometri vid tiden för flygning, eller CyTOF) möjliggör detektion av ett brett spektrum av intracellulära eller extracellulära biomarkörer i miljontals enskilda celler. Den höga dimensionella karaktären hos masscytometry-data kräver vissa analysverktyg, till exempel cell klustertekniker som spade1, flowmaps2, flowsom3, fenograf4, VorteX5och byggnadsställning Maps6. Dessutom olika dimensionalitet reduktions tekniker har utvecklats (dvs., huvudsaklig komponent analys [PCA]7, t-distribuerad stokastisk granne inbäddning [t-sne]8, hierarkiska stokastiska granne inbäddning [hsne]9, enhetliga GRENRÖR tillnärmning och projektion [UMAP]10, och diffusion kartor11) för att förbättra hastighet, tolkning och visualisering av högdimensionella DataSet.
Nedströms analys av hög-dimensionell flöde och massa cytometriska data saknar ofta automatiska processer för att utföra statistiska tester på kluster frekvens och länkar med kliniska resultat. Tidigare utvecklade vi ett R-baserat arbetsflöde som kallas Cytofast12, vilket möjliggör visuella och kvantitativa nedströms analyser av klustertekniker av cytosplore eller flowsom.
Det protokoll som beskrivs här klargör användningen av Cytofast i R och visar hur man kan generera kvantitativa och kvalitativa heatmaps och grafer. Dessutom underlättar det bestämning av anslutningar mellan observerade immun fenotyper och kliniska utfall. Rapporten beskriver också analysen av en specifik masscytometry-datasetet med hjälp av två olika kluster procedurer: flowsom och cytosplore. Genom att använda Cytofast med båda kluster metoder, det är på motsvarande sätt visat att aktiveringen FENOTYP av NK-celler påverkas av PD-L1 immun kontrollpunkt blockad.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av djur experiment kommittén av LUMC och utfördes enligt riktlinjerna för djurens experiment i LUMC i enlighet med riktlinjerna från nederländska och Europeiska kommittéer.
Anmärkning: för experimentell uppsättning inokulerades C57BL/6-möss subkutant på den högra flanken med den murina kolon tumören MC38 vid en koncentration av 0,3 x 106 celler/200 μl fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Efter 10 dagar, när tumörer var palpable, möss behandlades med PD-L1 blockerande antikroppar (klon MIH-5, 200 μg/mus, intraperitoneal injektion) eller var mock-behandlade. Tumörerna resected 3 dagar senare efter PD-L1 injektion, bearbetas ex vivo, och analyseras med CyTOF masscytometry med 38 markörer13.
1. utrustning och programvara för data analys
Obs: Använd en dator (Windows 7 eller nyare) och processor I5 på 2,4 GHz eller motsvarande, installerat minne ram 6 GB, och 10 GB ledigt hårddiskutrymme. R-paketet Cytofast använder befintliga funktioner: främst flowcore, pheatmapoch ggplot. Kommandoraderna som ska utföras i R ingår i protokollet. Resursen för R-instruktioner finns på https://Education.RStudio.com/.
- För att installera paketet Cytofast , starta R (version "3,6") och installera bioconductor version 3,9 genom att ange följande kod:
om (! requireNamespace ("BiocManager", tyst = TRUE))
install. packages ("BiocManager")
BiocManager:: installera ("cytofast") - Kontrollera att paketet läses in i önskad miljö genom att köra följande:
bibliotek (cytofast)
2. skapa kluster
Obs: för att visa upp de två klustring metoder cytosplore och flowsom med CYTOFAST, NK-celler (CD161+) i tumören mikro-miljö 3 dagar efter PD-L1 behandling analyseras.
- Kluster som utförs avCytosplore
- Efter dataöverföring och installerande Cytosplore, hospits på < www. Cytosplore. org >, ladda upp. FCS filer (kompletterande filer 1,1-1.8 [cytosplore input Files]) genom att klicka fil | Öppna FCS-fil (er) i Cytosplore. Lägg till en unik exempeltagg som kanal genom att klicka på Lägg till unik exempeltagg som kanal när du ombeds göra det och välj en kofaktor för hyperbolisk ARCSINH-omvandling (Standardvärdet är 5).
- Välj Kör H-sne, kör en hsne-nivå på 3 och vänta på att kartan ska genereras.
Obs: detta steg kan kräva en viss tid, beroende på antalet analyserade celler och nivån på hsne valt. - På den första HSNE-nivån kontrollerar du de celler som är positiva för CD161. Markera CD161+ -cellerna och högerklicka på Zooma in markering. På den andra nivån upprepar du proceduren för att nå den tredje nivån med endast CD161+ händelser.
- När den sista tSNE-kartan har genererats, spara klustren som definieras av Cytosplore genom att högerklicka på tsne-kartan och välj Spara kluster. Välj katalogen för utdatafiler som föranletts av Cytosplore och notera denna plats, eftersom denna katalog kommer sedan att användas för att ladda. FCS filer till R.
Anmärkningar: antalet delmängder kan ändras manuellt genom att ändra Sigma-värdet. Sigma-värdet ställs in som standard vid 30; det faktiska antalet deluppsättningar beror dock på indata. Här upptäckte Cytosplore 10 olika undergrupper, med varje fil som representerar en delmängd. - Använd ett enkelt namn (endast tecken) när du byter namn på utdatafilerna, vilket gör det enklare att identifiera och hantera ytterligare. Spara utdatafilerna genom att välja Spara.
Obs: efter att spara, är en mapp som skapas av cytosplore med. FCS filer, med varje fil som motsvarar de identifierade kluster i cytosplore. Nästa steg kommer att laddas filerna till R med hjälp av Cytofast. Här finns de genererade utdatafilerna i kompletterande filer 2,1 – 2.10 (cytosplore output Files). - Ladda utdatafilerna som genererats av Cytosplore till R med den utsedda funktionen: readCytosploreFCS.
dirFCS <-"C:\users\username\\desktop\\tostudy"
cfData <-readCytosploreFCS (dir = dirFCS, colNames = "Beskrivning") - Rensa data genom att ta bort vissa parametrar som "tid" och "bakgrund". Kontrollera placeringen av kolumnen relaterade till dess onödiga parametrar och ta bort den från matrisen.
colnames (cfData@expr)
cfData@expr <-cfData@expr [,-c (3, 4, 6, 8:10, 46:49, 51:54)]
Anmärkningar: de onödiga kolumnerna kan ses genom att läsa kolumnnamnen för den genererade matrisen. Genom att köra colnames (cfData@expr) en gång till, se till att endast de önskade parametrarna erhålls. - Ombeställ markörerna så att linje markörer visas först, följt av funktionella markörer.
cfData@expr <-cfData@expr [, c (1, 2, 3, 35, 36, 31, 9, 10, 18, 8, 37, 20,
29, 40, 5, 30, 33, 11, 34, 14, 19,
32, 28, 6, 7, 4, 12, 13, 17, 16, 15,
21, 22, 24, 25, 26, 27, 38, 39)]
Anmärkning: steg 2.1.8 är valfritt. - Länka meta-datafilen till de genererade data från Cytosplore genom att ladda upp kalkylarksmetafilen som innehåller klinisk information (kompletterande fil 3).
bibliotek (readxl)
Meta <-read_excel ("C:\\Users\\username\\Desktop\\ sample_id. xlsx")
cfData@samples <-data. Frame (meta)
Obs: den klustring som utförs av cytosplore är nu klar. Ett alternativt kluster alternativ till Cytosplore är flowsom och beskrivs i avsnitt 2,2. När en av de två klustringsstegen utförs fortsätter du med visualiserings steget (avsnitt 3).
- Kluster som utförs avFlowSOM
- Först installera flowsom i R genom att köra följande kommando:
om (! requireNamespace ("BiocManager", tyst = TRUE))
install. packages ("BiocManager")
BiocManager:: installera ("FlowSOM")
bibliotek (FlowSOM) - Installera flowCore-paketet med en liknande metod och Läs in det i miljön genom att köra följande:
om (! requireNamespace ("BiocManager", tyst = TRUE))
install. packages ("BiocManager")
BiocManager:: installera ("flowCore")
bibliotek (FlowSOM) - Ladda rådata som tillhandahålls i kompletterande filer 4.1 – 4.8 (FCS flowsom input), som tidigare var gated på CD161 + händelser, i R med den Read. flowset funktion.
fcs_raw <-Read. flowSet (sökväg = "C:\\Users\\username\\Desktop\\tocluster", mönster = ". FCS", Transformation = FALSE, truncate_max_range = falskt, Seed = 123) - Välj relevanta biologiska markörer (ta bort "bakgrund" eller "tid") genom att välja rätt kolumner och omvandla data på ett arcsinh5 sätt som visas i koden nedan (här, ta bort kolumnerna 1, 2, 4, 5, 6, 17, 21, 24, 25, 34, 35, 37, 38, 51, som inte motsvarar någon biologisk markör). Tillämpa en kofaktor av 5 som tidigare tillämpats med cytosplore, genom att välja kofaktor = 5 i funktionen nedan.
fcs_raw <-fsApply (fcs_raw, funktion (x, cofactor = 5) {
colnames (x) <-fcs_raw [[1]] @parameters @data $ DESC
uttr <-exprs (x)
uttryck <-asinh (uttryck [,-c (1, 2, 4, 5, 6, 17, 21, 24, 25, 34, 35, 37, 38, 51)]/kofaktor)
exprs (x) <-uttryck
Return (x)}) - Kluster data med hjälp av funktionen flowsom . För att jämföra flowsom och cytosplore, Välj att klustra data i tio delmängder som utdata som tidigare gav cytosplore.
fsom <-FlowSOM (fcs_raw, transformFunction = FALSE, skala = FALSE,
skalas. Center = falskt, skalad. Scale = FALSE, Silent = FALSE, colsToUse = c (1:37),
nClus = 10, maxMeta = 10, betydelse = NULL, utsäde = 123)
Obs: Detta kan ändras manuellt av användaren. - Tilldela varje cell till dess identifierade delmängd och exempel-ID.
subset_id <-som. Factor (fsom $ FlowSOM $ karta $ Mapping [, 1])
nivåer (subset_id) <-fsom $ metaclustering
huvud (subset_id) - Läs in metadatafilen i R (finns i tilläggsfilen 5) som innehåller gruppuppgiften och länka den till. FCS-filerna.
i <-read_excel ("c:\\users\\username\\desktop\\ sample_id. xlsx")
i <-na. omit (i)
sampleid $ sampleID <-som. Factor (sampleid $ sampleID)
sampleid $ grupp <-as. Factor (sampleid $ grupp)
sampleid $ CSPLR_ST <-as. Factor (sampleid $ CSPLR_ST)
i <-as. data. Frame (i)
namn (sampleid) [3] <-"sampleID"
sampleID <-lapply (fsom $ FlowSOM $ metaData, funktion (x) {rep (x [1], varje = längd (x [1]: x [2]))})
attr (sampleID, ' namn ') <-NULL
sampleID <-som. Factor (unlist (sampleID))
i <-data. Frame (i)
nivåer (sampleID) <-Paste ("ID", 1: dim (sampleid) [1], sep = "_")
DF <-data. Frame (subset_id, sampleID, fsom $ FlowSOM $ data [, c (1:37)])
Byt namn på <-data. Frame (colpar = fcs_raw [[1]] @parameters @data $ DESC)
colnames (DF) <-c ("clusterID", "sampleID", Byt namn på $ colpar [c (1:37)])
DF $ clusterID <-as. Factor (DF $ clusterID)
DF $ sampleID <-as. Factor (DF $ sampleID) - Skapa en cfList baserat på dataramen som erhålls från flowsom genom att köra följande skript:
cfData <-cfList (exempel = sampleid,
uttryck = DF) - Re-order markörer för att visas på samma sätt som utdata från Cytosplore analys.
cfData@expr <-cfData@expr [, c (1, 2, 34, 36, 37, 10, 23, 24, 31, 22,
38, 15, 8, 3, 27, 9, 11, 28, 35, 26,
14, 33, 17, 20, 21, 18, 25, 29, 13,
30, 12, 16, 32, 4, 5, 6, 7, 19, 39)]
Obs: klustring av flowsom är nu klar. Utför sedan visualisering av klustring utdata.
- Först installera flowsom i R genom att köra följande kommando:
3. visualisering: klusteranalys efter bearbetning
Anmärkning: det här steget är en metod som är gemensam för båda kluster metoder. Därför kan det utföras efter klustring antingen med flowsom eller cytosplore.
- Innan du skapar heatmaps, generera den Count tabellen per prov med hjälp av funktionen cellCounts som visas i koden nedan. Eftersom vissa kluster innehåller färre celler än andra, skala data per kluster genom att ange "Scale = TRUE" inuti funktionen cellCounts, så att spridningen bland prover kan enkelt ses.
cfData <-cellCounts (cfData, frekvens = TRUE, skala = TRUE)
Obs: data kan nu visualiseras. - Visualisera med heatmap.
Anmärkning: en av de viktigaste funktionerna i detta paket är cytoHeatmaps, som används för att visualisera fenotyp av skapade kluster samt deras heterogenitet med avseende på proverna.
cytoHeatmaps (cfData, grupp = "grupp", Legend = TRUE) - Visualisering med Boxplots
Obs: data kan representeras på ett kvantitativt sätt genom att anropa funktionen cytoBoxplots. Utdata för den här funktionen representerar andelen av varje exempel för varje kluster.- Generera antal celler som gjort i steg 3,1, men skala inte data för att få frekvensen för varje kluster.
cfData <-cellCounts (cfData, frekvens = TRUE, skala = falskt)
cytoBoxplots (cfData, grupp = "grupp")
- Generera antal celler som gjort i steg 3,1, men skala inte data för att få frekvensen för varje kluster.
- Visualisering med median intensitet signal histogram
Obs: data kan också visualiseras genom att representera median intensitet signal histogram.- Visualisera uttrycksintensiteten för tre markörer: CD45, CD11c och CD54.
- Kontrollera namnen på de markörer du vill ha genom att ringa följande rad. Anteckna markör namnen och inkludera den i funktionen msiPlot.
namn (cfData@expr)
Obs: här, fokusera på CD45, CD11c, och CD54. Kontrollera den exakta stavningen av markörer och justera om det behövs:
msiPlot (cfData, markörer = c ("89Y_CD45", "167Er_CD11c", "164Dy_CD54"), byGroup = "grupp")
Representative Results
Arbetsflödet Cytofast (figur 1) är tänkt att ge en kvantitativ och kvalitativ översikt av de data som ursprungligen klustrade av analysprogram (dvs., Flowsom eller cytosplore). Cytofast driver flera möjliga utgångar, inklusive heatmap av alla kluster som identifierats i analysen och baserat på markör uttryck (figur 2 och figur 3). Dendrogrammet överst representerar den hierarkiska likheten mellan de identifierade klustren. Den övre panelen visar en annan heatmap som visar den relativa kvantiteten av motsvarande delmängder i varje prov. Den dendrogram till höger visar likheten mellan proverna och baseras på hierarkiska kluster utförs på Euclidean avstånd mellan prover. De kombinerade heatmaps visas för flowsom följt av cytofast i figur 2 och för cytosplore följt av cytofast i figur 3. Cytofast kan också användas för att presentera data kvantitativt och visa resultaten i Boxplots (med hjälp av cytoboxplots funktion), som visas i figur 4 och figur 5.
Liknande kluster hittades mellan de två olika metoderna (t. ex. kluster 8 från Cytosplore motsvarar Cluster 10 från flowsom), och co-uttryck för vissa hämmande markörer som PD-1 och lag-3 var fortfarande synlig i båda metoderna). Båda kluster metoderna tillät diskriminering mellan PD-L1 vs. PBS-behandlade möss. Däremot kan vissa skillnader mellan båda metoderna markeras. Flowsom identifierar 2 kluster (MHC-II+), medan cytosplore visar endast ett kluster (MHC-II+ dim). Detta beror på den initiala gating strategi där NK celler var manuellt gated på CD161+ celler, sedan vidare bearbetas av flowsom. Men Cytosplore automatiskt gated celler från CD45+ befolkningen på den första hsne nivå, som sedan klustrade i en högre hierarkisk nivå. Således definierade Cytosplore NK cell delmängder mer exakt än hur manuell gating FOKUSERAT på CD161. Hierarkisk klustring av proverna bevarades dock, vilket framgår av dendrogrammet till höger, vilket indikerar att segregering mellan de två grupperna (PD-L1 och PBS) inte var beroende av den valda kluster metoden.
Antalet kluster kan definieras manuellt med båda metoderna. Cytofast gör det möjligt för användaren att bedöma heterogenitet av sina data och kan ge insikt i hur man väljer antalet kluster som data ska delas. Andra funktioner ingår i Cytofast -paketet, till exempel funktionen msiplot (steg 3.4.2), som visar medianvärdet för SIGNALINTENSITET (MSI) för varje markör per grupp (figur 6 och figur 7). Denna funktion gör det möjligt att upptäcka globala förändringar, såsom ökningar i uttrycket av CD54 eller CD11c i NK-celler i den PD-L1-behandlade gruppen. Valfria funktioner kan införlivas i Cytofast -paketet, till exempel visa data i stapeldiagram och andra metoder för datarepresentation. Den senare kräver tillsats av ggplot verktyg, som kan genereras av R.
Figur 1: arbetsflöde för Cytofast Package. Data genererades av masscytometri från en tumör 3 dagar efter behandling med immunterapi eller lämnas obehandlad. Två olika klustertekniker jämfördes: Cytosplore och flowsom. Cytofast användes för att visualisera skillnader mellan de två teknikerna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: kluster översikt och kluster överflöd per grupp som analyseras av Cytofast efter cytosplore. Heatmap av alla NK cell kluster (CD161+ celler definieras automatiskt av cytosplore), som identifierades 3 dagar efter immunterapi (PD-L1). Data som visas baseras på Cytosplore -klustring och poolade från obehandlade och PD-L1-behandlade grupper. Nivåer av ArcSinh5-omvandlad uttrycks markör visas på en regnbågsskala. På den nedre panelen representeras det relativa överflödet av varje prov av den gröna till lila skalan. Den dendrogram till höger representerar likheten mellan proverna baserat på delmängd frekvenser. Frekvensskalan representerar spridningen av medelvärdet. En låg eller hög frekvens representeras av en grön eller lila färg, respektive. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: kluster översikt och kluster överflöd per grupp som analyseras av Cytofast efter flowsom. Heatmap av alla NK cell kluster (pre-gated på CD161+ händelser), som identifierades 3 dagar efter immunterapi (PD-L1). Data som visas baseras på flowsom -klustring och poolade från obehandlade och PD-L1-behandlade grupper. Nivåer av ArcSinh5-omvandlad uttrycks markör visas på en regnbågsskala. På den nedre panelen representeras det relativa överflödet av varje prov av den gröna till lila skalan. Den dendrogram till höger representerar likheten mellan proverna baserat på delmängd frekvenser. Frekvensskalan representerar spridningen av medelvärdet. En låg eller hög frekvens representeras av en grön eller lila färg, respektive. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: cytofast representation med Boxplots av de kluster som definieras av cytosplore. Frekvensen av varje kluster representeras i en boxplot, separeras i de två grupperna (PBS och PD-L1). En enskild prick motsvarar en mus. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: cytofast representation med Boxplots av de kluster som definieras av flowsom. Frekvensen av varje kluster representeras i en boxplot, separeras i de två grupperna (PBS och PD-L1). En enskild prick motsvarar en mus. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: fördelning av signalintensiteten från NK-celler automatiskt gated av Cytosplore. Fördelningen av signalintensiteter visas i ett histogram för tre specifika markörer: CD45, CD11c och CD54. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: fördelning av signalintensiteten från NK-celler automatiskt gated av flowsom. Fördelningen av signalintensiteten visas i ett histogram för tre specifika markörer: CD45, CD11c och CD54, åtskilda av grupperna PBS och PD-L1. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande filer 1,1 – 1,8. Vänligen klicka här för att se denna fil (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande filer 2,1 – 2.10. Vänligen klicka här för att se denna fil (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande fil 3. Vänligen klicka här för att se denna fil (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande filer 4.1 – 4.8. Vänligen klicka här för att se denna fil (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande fil 5. Vänligen klicka här för att se denna fil (Högerklicka för att ladda ner).
Discussion
Cytofast är ett snabbt beräkningsverktyg som ger en snabb och global utforskning av cytometriska data genom att belysa och kvantifiera behandlingsspecifika cellulära undergrupper. Syftet med protokollet är att ytterligare bearbeta kluster analyser med Cytosplore eller flowsom. Andra klusteranalys verktyg lämpar sig för cytofast, men detta kräver användning av cytofast att tilldela varje cell till en delmängd. Cytofastär dock inte en kluster metod, och kräver därför kluster procedurer före användning.
Analysen utförs här visade att vissa CD161+ NK cell undergrupper i tumören mikromiljö var känsliga för en PD-L1 blockad. Detta styrdes av förändringar i deras fenotyp och överflöd, som observerades med både Cytosplore och flowsom som kluster metoder. Båda metoderna utmärkte huvud NK-cellsklustret (CD11b+ NKG2A+) med något olika frekvenser (15% – 20% för cytosplore, 30% – 40% för flowsom). Skillnaderna i överflöd och denna tillnärmning påverkade inte det globala mönstret, eftersom båda dendrograms visas i de högra panelerna i figur 2 och figur 3 visade liknande resultat. Genom att använda Cytofastär det möjligt (oberoende av den valda klustring metoden) att SEGREGERA PD-L1-behandlade och obehandlade möss baserat på analyser av NK cells kluster fenotyp och överflöd.
Beroende på de inspelade parametrarna behövs ändringar av protokollet. Specifika parametrar som tid och bakgrund måste tas bort när kluster analysen utförs. Dessutom är det viktigt att varje cell tilldelas en delmängd. CfData-funktionen lägger helt enkelt till de råa cell inventeringar per kluster per prov i cfList. Från detta steg kan cytoheatmap byggas som förklaras i avsnitt 3.
Cytofast har framgångsrikt använts som ett visualiserings-och kvantifieringsverktyg för att jämföra olika kluster metoder13. Detta R-paket är också kompatibelt med avancerade funktioner, till exempel globaltest14, som kan testa associationer mellan grupper av kluster med hjälp av kliniska variabler. I framtiden, den globaltest verktyg och andra algoritmer kan integreras med cytofast för mer djupgående visualisering och kvantifiering.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi erkänner finansieringen från Europeiska kommissionen av en Horisont 2020 MSCA Award enligt förslag nummer 675743 (ISPIC). Vi tackar Tetje van der Sluis och Iris Pardieck för att testa protokollet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer | Dell | NA | NA |
References
- Anchang, B., et al. Visualization and cellular hierarchy inference of single-cell data using SPADE. Nature Protocols. 11 (7), 1264-1279 (2016).
- Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16 (3), 323-337 (2015).
- Van Gassen, S., et al. FlowSOM: Using self-organizing maps for visualization and interpretation of cytometry data. Cytometry A. 87 (7), 636-645 (2015).
- Levine, J. H., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13 (6), 493-496 (2016).
- Spitzer, M. H., et al. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
- Hotelling, H. Analysis of a complex of statistical variables into principal components. Journal of Educational Psychology. 24 (6), 417-441 (1933).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. , (2008).
- Pezzotti, N., Hollt, T., Lelieveldt, B., Eisemann, E., Vilanova, A. Hierarchical Stochastic Neighbor Embedding. Computer Graphics Forum. 35 (3), 21-30 (2016).
- Becht, E., et al. Dimensionality reduction for visualizing single-cell data using UMAP. Nature Biotechnology. 37, 38 (2018).
- Haghverdi, L., Buettner, F., Theis, F. J. Diffusion maps for high-dimensional single-cell analysis of differentiation data. Bioinformatics. 31 (18), 2989-2998 (2015).
- Beyrend, G., Stam, K., Höllt, T., Ossendorp, F., Arens, R. Cytofast: A workflow for visual and quantitative analysis of flow and mass cytometry data to discover immune signatures and correlations. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 435-442 (2018).
- Beyrend, G., et al. PD-L1 blockade engages tumor-infiltrating lymphocytes to co-express targetable activating and inhibitory receptors. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7 (1), 217 (2019).
- Goeman, J. J., van de Geer, S. A., de Kort, F., van Houwelingen, H. C. A global test for groups of genes: testing association with a clinical outcome. Bioinformatics. 20 (1), 93-99 (2004).
