Ziel dieses Manuskripts ist es, einen Überblick über die umfassenden biochemischen und funktionellen Studien der RING-Typ E3 Ubiquitin Ligasen zu präsentieren. Diese mehrstufige Pipeline mit detaillierten Protokollen validiert eine enzymatische Aktivität des getesteten Proteins und zeigt, wie die Aktivität mit der Funktion verknüpft werden kann.
Die Ubiquitination als posttranslationale Modifikation von Proteinen spielt eine wichtige regulatorische Rolle bei der Homöostase eukaryotischer Zellen. Die kovalente Anhaftung von 76 Aminosäure-Ubiquitin-Modifikatoren an ein Zielprotein, abhängig von der Länge und Topologie der Polyubiquitin-Kette, kann zu unterschiedlichen Ergebnissen führen, die von Proteinabbau bis hin zu Veränderungen in der Lokalisierung und/oder Aktivität modifizierter Proteine reichen. Drei Enzyme katalysieren den Ubiquitinationsprozess sequenziell: E1-Ubiquitin-aktivierendes Enzym, E2-Ubiquitin-konjuzierendes Enzym und E3-Ubiquitinligase. E3 Ubiquitin Ligase bestimmt die Substratspezifität und stellt daher ein sehr interessantes Studienfach dar. Hier stellen wir einen umfassenden Ansatz vor, um die Beziehung zwischen der enzymatischen Aktivität und Funktion des RING-Typs E3 ubiquitin ligase zu untersuchen. Dieses vierstufige Protokoll beschreibt 1) wie ein E3-Ligase-Mangel-Mutant durch standortgesteuerte Mutagenese erzeugt wird, die auf die konservierte RING-Domäne ausgerichtet ist; 2–3) wie die Ubiquitationsaktivität sowohl in vitro als auch in planta untersucht werden kann; 4) wie diese biochemischen Analysen mit der biologischen Signifikanz des getesteten Proteins verknüpft werden können. Die Erzeugung eines E3-Ligase-mangelhaften Mutanten, der immer noch mit seinem Substrat interagiert, es aber nicht mehr zum Abbau ubiquitiniert, erleichtert die Prüfung von Enzym-Substrat-Wechselwirkungen in vivo. Darüber hinaus verleiht die Mutation in der konservierten RING-Domäne oft einen dominanten negativen Phänotyp, der in funktionellen Knockout-Studien als alternativer Ansatz für einen RNA-Interferenzansatz genutzt werden kann. Unsere Methoden wurden optimiert, um die biologische Rolle des pflanzenparasiten Nematodeneffektors RHA1B zu untersuchen, der das Wirts-Ubiquitinationssystem in Pflanzenzellen entführt, um Denparasitismus zu fördern. Mit geringfügiger Modifikation des In-vivo-Expressionssystems kann dieses Protokoll unabhängig von seiner Herkunft auf die Analyse jeder RING-Typ E3-Ligase angewendet werden.
Die überwiegende Mehrheit der E3-Ubiquitinligasen gehört zu RING (Really Interesting New Gene)-Typ Proteine. Die RING-Finger-Domain wurde ursprünglich von Freemont et al.identifiziert. 1 und funktionell als Domäne beschrieben, die Protein-Protein-Interaktionvermittelt 2. Der kanonische RING-Finger ist eine spezielle Art von Zink-Koordinierungsdomäne, definiert als Konsenssequenz von acht konservierten Cys (C) und His (H), die speziell durch andere Aminosäurerückstände (X), C-X2-C-X9-39-C-X1–3-H-X2–3-C/H-X2-C-X4–48-C-X2-C- und -C- Zwei Zn2+-Ionen werden durch Kern-C- und H-Rückstände durch einzigartige “Cross-Brace”-Topologie mit C1/C2 und C/H5/C6 stabilisiert, die das erste Zn2+ Ionen koordinieren, während C3/H4 und C7/C8 die zweite binden (Abbildung 1A)3,4. Je nach Vorhandensein von C oder H in der fünften Zn2+-Koordinationsstelle wurden zwei kanonische Unterklassen von RING-Fingerproteinen definiert: C3HC4 und C3H2C3 (RING-HC bzw. RING-H2). Da die RING-Domäne von E3-Ubiquitinligase die Wechselwirkung zwischen E2-konjugierenden Enzymen und Substraten vermittelt, hat sich gezeigt, dass die Mutation dieser essentiellen C- und H-Rückstände die Ligaseaktivität stört5. Weitere fünf weniger häufige Unterklassen von RING E3-Ligasen wurden beschrieben (RING-v, RING-C2, RING-D, RING-S/T und RING-G)6. Die RING-Typ E3 Ubiquitin Ligasen können weiter in einfache und komplexe E3-Enzyme unterteilt werden. Die einfache Einzeleinheit RING E3 Ligases enthält sowohl die Substraterkennungsstelle als auch die E2-bindende RING-Domäne. Im Gegensatz dazu ist der Multisubunit RING-Typ E3-Komplex entweder das Substrat des Renousesubstrats oder vermittelt die Bindung des E2-Ubiquitin-Zwischenprodukts an den E3-Komplex. Die RING-Domäne Lys-Residuen, die als primäre Ubiquitin-Anhang-Site(n) zur Selbstallgegenwärtigkeit dienen, könnte auch für die E3-Ligase-Aktivität wichtig sein.
Nicht alle RING-haltigen Proteine funktionieren als E3-Ligasen. Daher müssen die bioinformatische Vorhersage der RING-Finger-Domäne und die Fähigkeit zur E2-abhängigen Protein-Ubiquitination biochemisch validiert und mit der biologischen Rolle des getesteten Proteins verknüpft werden. Hier beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, in dem beschrieben wird, wie die enzymatische Aktivität von RING-Typ E3-Ubiquitinligasen sowohl in vitro als auch in planta durch einen standortgesteuerten Mutagenese-Ansatz erkannt und funktional charakterisiert werden kann. Die repräsentativen Ergebnisse dieser Pipeline werden für den RING-Typ E3 ligase RHA1B angezeigt. RHA1B ist ein Effektorprotein, das von der pflanzlichen parasitären Zystennematode Globodera pallida produziert wird, um die Pflanzenimmunität zu unterdrücken und die Morphologie von Pflanzenwurzelzellen zu manipulieren. Um sich vor einer Invasion von Erregern/Parasiten zu schützen, haben Pflanzen Nukleotid-bindende Domäne und Leucin-reiche Wiederholung (NB-LRR) Typ Immunrezeptoren entwickelt, die das Vorhandensein eines Erregers oder Parasiten erkennen und als Folge die überempfindliche Reaktion (HR) entwickeln, die eine Form des schnellen und lokalisierten Zellsterbens ist, das an der Infektionsstelle auftritt, um die Besiedlung von Krankheitserregern zu stoppen. Ein solcher Immunrezeptor ist das Kartoffel-Gpa2-Protein, das resistenzen gegen einige Isolate von G. pallida (Feldpopulationen D383 und D372)7verleiht.
Mit den vorgestellten Protokollen, Es wurde vor kurzem festgestellt, dass RHA1B mit pflanzenimmunsignalisierung in einer E3-abhängigen Weise durch die Ausrichtung auf die Pflanze Gpa2 Immunrezeptor für Ubiquitination und Abbau8stört.
Die Erdeutlichung der biochemischen und mechanistischen Basis des RING Typs E3 Ubiquitin Ligasen kann wesentlich zu unserem Verständnis ihrer biologischen Bedeutung in der Entwicklung, Stresssignalisierung und Aufrechterhaltung der Homöostase beitragen. Das hier beschriebene Protokoll verbindet einen Mutageneseansatz mit in vitro und in planta-funktionellen Studien. Durch die Einführung einer einzigen Aminosäuresubstitution in die konservierten Rückstände der RING-Domäne durch standortdirekte Mutagenese kann der resultierende E3-mangelhafte Mutant parallel zu Wild-Protein getestet werden, um enzymatische Aktivität mit Funktionalität zu verknüpfen.
Es ist wichtig, die RING-Domäne richtig zu identifizieren, insbesondere ihre konservierten Cys und seine Rückstände. Online-Tools wie PROSITE können dazu10verwendet werden. Um die RING-Domäne zu destabilisieren, die für die Rekrutierung des E2-Enzyms verantwortlich ist, wird Cys normalerweise durch Ser ersetzt, was sein nächster struktureller Ersatz ist, der nicht in der Lage ist, eine Disulfidbindung zu erzeugen, die für die Zinkkoordination verwendet wird. Lorick et al. zeigten, dass die Mutation in einem dieser kritischen Cys-Rückstände die Ubiquitinationsaktivität der einzelnen Untereinheit RING-Typ E3 Ligases5abschaffen würde. Obwohl einige Cys-Rückstände auch für Mehrunit-E3-Ligasekomplexe wichtig sind, die RING-Proteine enthalten, ist es aufgrund der facettenreichen und dynamischen dreidimensionalen Struktur dieser Ubiquitinationskomplexe und der unterschiedlichen Rolle von RING-Proteinen nicht gelungen, einen Ligase-defiziden-Proteintyp11zu erzeugen.
Für die standortgesteuerte Mutagenese fanden wir heraus, dass die Verwendung kleinerer Plasmidvektoren und niedrigerer Amplifikationszyklen in der Regel zu einer höheren Effizienz bei der Mutagenese führte. Das Pfu-Enzym kann durch jede andere DNA-Polymerase mit hoher Genauigkeit und hoher Prozessivität ersetzt werden. Darüber hinaus kann, wenn das Gen von Interesse seltene Codons enthält, ein weiterer E. coli-Fleck, Rosetta, verwendet werden, um eine höhere Ausbeute des rekombinanten Proteins zu erzielen. Darüber hinaus können sowohl inkubationszeit als auch Temperatur für IPTG-Induktion weiter optimiert werden. Niedrigere Temperaturen verringern die E. coli-Teilungsrate, die für die Expression bestimmter Proteine günstig sein könnte. Obwohl eine höhere Konzentration von IPTG die Proteinexpression verbessern könnte, hemmt sie auch E. coli-Teilungsprozesse und wird nicht empfohlen.
Einzelne Untereinheit RING Typ E3 Ligases fungieren nicht nur als molekulares Gerüst, das das E2-Ub-Zwischenprodukt in unmittelbarer Nähe zum Substrat positioniert, sondern stimulieren auch die Ubiquitin-Transferaktivität ihrer Cognate E2s. Da eine E2/E3-Kombination für die Länge und die Verbindungen der Polyubiquitinkette, die das Schicksal eines modifizierten Substrats bestimmt, wichtig ist, muss jede Berücksichtigung von RING-Typ E3s ihre enzymatischen Partner E2s12umfassen. Wie in Abbildung 3Bdargestellt, sind nicht alle getesteten E2 mit der RHA1B-Ligase kompatibel. Daher sollten In-vitro-Ubiquitinationstests parallel zu mehreren E2-Enzymen durchgeführt werden, die verschiedene E2-Klassen darstellen, um falsche negative Ergebnisse zu vermeiden.
Hier wird der in vitro enzymatische Assay vorgestellt, der die Selbstallgegenwärtigisierungsfähigkeit von getesteten RING-Proteinen erkennt. Mit kleinen Modifikationen kann dieses Protokoll jedoch leicht angepasst werden, um die In-vitro-Ubiquitination von Substraten zu erkennen. Zu diesem Zweck sollte die In-vitro-Ubiquitinationsmischung aus Schritt 2.15 mit dem rekombinanten Protein des potentiellen E3-Ligasesubstrats (500 ng) ergänzt werden. Nach einer 2 h Inkubation bei 30 °C sollte ubiquitiniertes Protein mit 15 L Anti-HA-Affinitätsmatrix (wenn HA-Ub verwendet wird, oder Anti-FLAG-Affinitätsmatrix, wenn FLAG-Ub verwendet wird) durch Rühren für 2 h bei 4 °C eingefangen werden. Nach dem Waschen der Perlen 4x mal mit dem kalten Ub Waschpuffer (20 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, 1x PMSF), alle bis auf 40 l des Puffers entsorgen und auf Schritt 2,16 bewegen. Das Ubiquitinationssignal, das von Antikörpern nachgewiesen wird, die spezifisch für das epitopmarkierte Ub bzw. Substrat sind und aus dem Molekulargewicht des Substratproteins hervorgehen, bestätigt die Substrat-/Enzymspezifität.
Darüber hinaus ist die Identifizierung von E3-Ligase-Substraten in vivo in der Regel mit mehreren Herausforderungen aufgrund einer transienten Enzym-Substrat-Interaktion und einem schnellen Abbau des ubiquitinierten Zielproteins verbunden. Die Verwendung eines E3-Ligase-Mangelmutanten, der immer noch mit seinem Ziel interagiert, es aber nicht mehr ubiquitiniert13, ist eine sehr nützliche Alternative zur Zugabe von proteasomalem Inhibitor MG132, der die 26S-Proteasomfunktion nicht immer ausreichend beeinträchtigt.
Ein gemeinsames Merkmal von RING-Typ E3 Ligasen ist die Tendenz, sich als Homo- und/oder Heterodimere zu bilden und zu funktionieren. Interessanterweise ist die Substitution in den konservierten Rückständen der RING-Domäne in der Regel mit einem dominanten negativen Phänotyp verbunden, bei dem mutierte RING-Typ E3 Ligase enzymatische Aktivität eines nativen Wildtypproteins13blockiert. Daher kann die Überexpression von RING-Mutanten in Planta ein alternativer Ansatz sein, um das E3-Ligase-Gen auszuschalten.
The authors have nothing to disclose.
Unsere Arbeit wurde durch die finanzielle Unterstützung der Landwirtschafts- und Ernährungsforschungsinitiative (2017-67014-26197; 2017-67014-26591) des USDA National Institute of Food and Agriculture, USDA-NIFA Farm Bill, Northwest Potato ermöglicht. Konsortium und ISDA Specialty Crop.
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Amylose resin | NEB | E8021S | |
ATP | Sigma-Aldrich | A1852 | |
Bacterial protease inhibitor | Sigma-Aldrich | P8465 | |
Bromphenol Blue | VWR | 97061-690 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Centrifuge | Beckman Coulter | model: Avanti J-25 | |
Commassie Blue | VWR | 97061-738 | |
Creatine phosphate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
DNA clean & concentrator Kit | ZYMO RESEARCH | D4029 | |
DpnI | NEB | R0176S | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
E. coli BL21 | Thermo Fisher Scientific | C600003 | |
E. coli DH5α competent cells | Thermo Fisher Scientific | 18265017 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 324504 | |
FeSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | |
FLAG-Ub | BostonBiochem | U-120 | |
Glucose | VWR | 188 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
HA-Ub | BostonBiochem | U-110 | |
Heat block | VWR | model: 10153-318 | |
Incubator | VWR | model: 1525 Digital Incubator | |
Incubator shaker | Thermo Fisher Scientific | model: MaxQ 4000 | |
IPTG | Roche | 10724815001 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Liquide nitrogen | university chemistore | ||
Maltose | Sigma-Aldrich | 63418 | |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63138 | |
MgSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | model: 5424 | |
Miniprep plasmid purification kit | ZYMO RESEARCH | D4015 | |
monoclonal anti-FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | |
monoclonal anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H9658 | |
monoclonal anti-MYC antibody | Sigma-Aldrich | WH0004609M2 | |
Mortar | VWR | 89038-144 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | model: 2000 Spectrophotometer | |
Needle | Thermo Fisher Scientific | 14-826-5C | |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
PCR machine | Bio-Rad | model: C1000 | |
Pestle | VWR | 89038-160 | |
Pfu Ultra | Agilent Technologies | 600380 | |
Plant protease inhibitor coctail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
pMAL-c2 | NEB | N8076S | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Polyvinylpolypyrrolidone | Sigma-Aldrich | P6755 | |
SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
Sonicator | Qsonica Sonicators | model: Q125 | |
Syringe | Thermo Fisher Scientific | 22-253-260 | |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
T4 ligase | NEB | M0202S |