O objetivo deste manuscrito é apresentar um esboço para os estudos bioquímicos e funcionais abrangentes das ligaduras de ubiquitina ring-tipo E3. Este pipeline multipasso, com protocolos detalhados, valida uma atividade enzimática da proteína testada e demonstra como vincular a atividade à função.
A ubiquitinação, como uma modificação pós-translacional de proteínas, desempenha um papel regulatório importante na homeostase das células eucarióticas. O acessório covalente de 76 modificadores de ubiquitina de aminoácidos a uma proteína alvo, dependendo do comprimento e da topologia da cadeia de poliubiquitina, pode resultar em diferentes resultados que vão desde a degradação de proteínas até mudanças na localização e/ou atividade de proteína modificada. Três enzimas catalisam sequencialmente o processo de ubiquitinação: enzima ativadora de ubiquitina E1, enzima de conjugação de ubiquitina E2 e ligase de ubiquitina E3. A ligase de ubiquitina e3 determina a especificidade do substrato e, portanto, representa um assunto de estudo muito interessante. Aqui apresentamos uma abordagem abrangente para estudar a relação entre a atividade enzimática e a função da ligase ubiquitina ring-tipo E3. Este protocolo de quatro etapas descreve 1) como gerar um mutante deficiente da Ligase E3 através da mutagênese dirigida pelo local, direcionada ao domínio RING conservado; 2-3) como examinar a atividade de ubiquitinação tanto in vitro quanto na planta; 4) como ligar essas análises bioquímicas ao significado biológico da proteína testada. A geração de um mutante deficiente em ligase E3 que ainda interage com seu substrato, mas não o ubiquitina para degradação, facilita o teste de interações com substrato de enzimas in vivo. Além disso, a mutação no domínio ring conservado muitas vezes confere um fenótipo negativo dominante que pode ser utilizado em estudos de nocaute funcional como uma abordagem alternativa a uma abordagem de interferência de RNA. Nossos métodos foram otimizados para investigar o papel biológico do efetuor de nematóide parasitário da planta RHA1B, que sequestra o sistema de ubiquitinação hospedeiro nas células vegetais para promover o parasitismo. Com ligeira modificação do sistema de expressão in vivo, este protocolo pode ser aplicado à análise de qualquer ligase E3 do tipo RING, independentemente de suas origens.
A grande maioria das ligas de ubiquitina E3 pertence ao RING(Really interesting New Gene) proteínas do tipo. O domínio ring-finger foi originalmente identificado por Freemont et al. 1 e funcionalmente descrito como um domínio mediador interação proteína-proteína2. O dedo anelar canônico é um tipo especial de domínio coordenador de zinco definido como uma seqüência de consenso de oito Cs conservados (C) e Seu (H) espaçados especificamente por outros resíduos de aminoácidos (X), C-X2-C-X9-39-C-X1-3-H-X2-3-C/H-X2-C-X 48-C-X2-C. Dois íons Zn2+ são estabilizados pelos resíduos c e h do núcleo através da topologia única “cross-brace” com C1/C2 e C/H5/C6 coordenando o primeiro íon Zn2+, enquanto C3/H4 e C7/C8 ligam o segundo (Figura 1A)3,4. Dependendo da presença de C ou H no quinto zn2+-local de coordenação, duas subclasses canônicas de proteínas ring-finger foram definidas: C3HC4 e C3H2C3 (RING-HC e RING-H2, respectivamente). Como o domínio RING da ligase ubiquitina E3 media a interação entre enzimas conjugantes E2 e substratos, a mutação desses resíduos essenciais de C e H tem sido mostrada para interromper a atividade da ligase5. Foram descritas mais cinco subclasses menos comuns de ligases RING E3 (RING-v, RING-C2, RING-D, RING-S/T e RING-G)6. As ligases de ubiquitina ring-tipo E3 podem ser ainda mais subdivididas em enzimas E3 simples e complexas. As ligases RING E3 da subunidade simples contêm o site de reconhecimento de substratos e o domínio RING de ligação e2. Em contrapartida, o complexo multisubunidade RING-tipo E3 recruta o substrato ou media a ligação do intermediário E2-ubiquitin ao complexo E3. O domínio RING Lys resíduos (s) que serve como um site de fixação de ubiquitina primário (s) para a auto-ubiquitinação também pode ser importante para a atividade da ligase E3.
Nem todas as proteínas contendo ANEL funcionam como ligases E3. Assim, a previsão bioinformática do domínio do dedo ANEL e a capacidade de ubiquitinação proteica dependente de E2 devem ser bioquimicamente validadas e ligadas ao papel biológico da proteína testada. Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo descrevendo como detectar e caracterizar funcionalmente a atividade enzimática das ligases de ubiquitina ring-tipo E3, tanto in vitro quanto na planta, através de uma abordagem mutagênese dirigida pelo local. Os resultados representativos deste gasoduto são mostrados para o RING-tipo E3 ligase RHA1B. Rha1B é uma proteína efetora produzida pelo cisto parasita da planta nematode Globodera pallida para suprimir a imunidade vegetal e manipular a morfologia das células de raiz de plantas. Para se protegerem de patógenos/parasitárias, as plantas evoluíram receptores imunológicos do tipo de repetição de nucleotídeos e leucina (NB-LRR) que detectam a presença de um patógeno ou parasita e, como conseqüência, desenvolvem a resposta hipersensível (FC), que é uma forma de morte celular rápida e localizada ocorrendo no local da infecção para deter a colonização de patógenos. Um desses receptores imunológicos é a proteína Gpa2 de batata que confere resistência a alguns isolados de G. pallida (populações de campo D383 e D372)7.
Usando os protocolos apresentados, verificou-se recentemente que o RHA1B interfere com a sinalização imune às plantas de forma dependente da E3, visando o imunoreceptor gpa2 da planta para ubiquitinação e degradação8.
Elucidar a base bioquímica e mecanicista das ligases de ubiquitina do tipo RING E3 pode contribuir muito para a nossa compreensão de seu significado biológico no desenvolvimento, sinalização de estresse e manutenção da homeostase. O protocolo descreveu aqui pares uma aproximação do mutagenesis com in vitro e em estudos funcionais da planta. Ao introduzir uma única substituição de aminoácidos nos resíduos conservados do domínio RING através da mutagênese direta do local, o mutante deficiente em E3 resultante pode ser testado em paralelo com proteína selvagem do tipo para ligar a atividade enzimática com a funcionalidade.
É fundamental identificar adequadamente o domínio RING, particularmente seus cis conservados e seus resíduos. Ferramentas on-line como prosite pode ser usado para fazê-lo10. Para desestabilizar o domínio RING responsável pelo recrutamento da enzima E2, cys é normalmente substituído por Ser, que é a sua substituição estrutural mais próxima sem a capacidade de criar uma ligação de dissulfeto usado para a coordenação de zinco. Lorick et al. mostraram que a mutação em qualquer um desses resíduos críticos de Ciso aboliria a atividade de ubiquitinação das ligaduras E3 do tipo RING única subunidade5. Embora alguns resíduos de Cys também sejam importantes para complexos multiunidades de ligase E3 contendo proteínas do tipo RING, devido à estrutura tridimensional multifacetada e dinâmica desses complexos de ubiquitinação e ao papel diferente das proteínas do tipo RING, substituições únicas de resíduos conservados no domínio RING na ligase multiunitária e3 não foram bem-sucedidas na geração de um fenótipo dedeficiente ligase11.
Para a mutagênese dirigida pelo local, descobrimos que o uso de vetores plasmídeos menores e ciclos de amplificação mais baixos geralmente produzia maior eficiência para mutagênese. A enzima Pfu pode ser substituída por qualquer outra polimererase de DNA de alta fidelidade e alta processabilidade. Além disso, se o gene do interesse contem codons raros, uma outra mancha de E. coli, Rosetta, pode ser usada para conseguir um rendimento mais elevado da proteína recombinante. Além disso, tanto o tempo de incubação quanto a temperatura para a indução do IPTG podem ser otimizados. Temperaturas mais baixas reduzem a taxa de divisão de E. coli, o que pode ser favorável à expressão de certas proteínas. Embora uma concentração mais elevada de IPTG poderia melhorar a expressão da proteína, igualmente inibe processos da divisão de E. coli e não é recomendado.
Ligases de anel único subunidade E3 não só funcionam como um andaime molecular que posiciona o intermediário E2-Ub nas proximidades do substrato, mas também estimula a atividade de transferência de ubiquitina de seus E2s cognatos. Além disso, dado que uma combinação E2/E3 é importante para o comprimento e as ligações da cadeia de poliubiquitina que determina o destino de um substrato modificado, qualquer consideração de Ring-tipo E3s deve incluir seus parceiros enzimáticos, E2s12. Como mostrado na Figura 3B, nem todos os E2s testados são compatíveis com a ligase RHA1B. Portanto, ensaios de ubiquitinação in vitro devem ser realizados em paralelo com várias enzimas E2 representando diferentes classes E2 para evitar resultados falsos negativos.
Apresentado aqui é o ensaio enzimático in vitro que detecta a capacidade de auto-ubiquitinação de proteínas testadas do tipo RING. No entanto, com pequenas modificações, este protocolo pode ser facilmente adaptado para detectar onipresença in vitro de substratos. Para este fim, a mistura de ubiquitinação in vitro do passo 2.15 deve ser complementada com a proteína recombinante do potencial substrato de ligase E3 (500 ng). Após uma incubação de 2 h a 30 °C, a proteína ubiquitinada deve ser capturada usando 15 μL de matriz de afinidade anti-HA (se ha-ub for usado, ou matriz de afinidade anti-FLAG se flag-ub é usado) por agitação por 2 h em 4 °C. Depois de lavar as contas 4x vezes com o tampão de lavagem Ub frio (20 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 0.05% Tween 20, 1x PMSF), descartar todos, mas 40 μL do buffer e passar para o passo 2,16. O sinal de onipresença, detectado por anticorpos específicos do Ub e substrato marcados por epítopos, respectivamente, emergindo do peso molecular da proteína do substrato, confirma a especificidade do substrato/enzima.
Além disso, a identificação de substratos de ligase E3 in vivo é geralmente associada a múltiplos desafios devido à interação transitória de substrato de enzimas e à rápida degradação da proteína alvo ubiquitinada. Usar um mutante deficiente em ligase E3, que ainda interage com seu alvo, mas não mais o ubiquitina13,é uma alternativa muito útil para a adição do inibidor proteassômico MG132, que nem sempre interfere suficientemente com a função proteasome 26S.
Uma característica comum das ligaduras E3 do tipo RING é uma tendência a formar e funcionar como homo e/ou heterodimers. Curiosamente, a substituição nos resíduos conservados do domínio RING é geralmente associada a um fenótipo negativo dominante, onde mutado RING-tipo E3 ligase bloqueia a atividade enzimática de uma proteína do tipo selvagem nativo13. Assim, a superexpressão de mutantes RING na planta pode ser uma abordagem alternativa para derrubar o gene da ligase E3.
The authors have nothing to disclose.
Nosso trabalho foi possível graças ao apoio financeiro da Bolsa Competitiva da Iniciativa de Agricultura e Pesquisa Alimentar (2017-67014-26197; 2017-67014-26591) do Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura do USDA, USDA-NIFA Farm Bill, Northwest Potato Consórcio e Cultura Especializada da ISDA.
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Amylose resin | NEB | E8021S | |
ATP | Sigma-Aldrich | A1852 | |
Bacterial protease inhibitor | Sigma-Aldrich | P8465 | |
Bromphenol Blue | VWR | 97061-690 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Centrifuge | Beckman Coulter | model: Avanti J-25 | |
Commassie Blue | VWR | 97061-738 | |
Creatine phosphate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
DNA clean & concentrator Kit | ZYMO RESEARCH | D4029 | |
DpnI | NEB | R0176S | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
E. coli BL21 | Thermo Fisher Scientific | C600003 | |
E. coli DH5α competent cells | Thermo Fisher Scientific | 18265017 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 324504 | |
FeSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | |
FLAG-Ub | BostonBiochem | U-120 | |
Glucose | VWR | 188 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
HA-Ub | BostonBiochem | U-110 | |
Heat block | VWR | model: 10153-318 | |
Incubator | VWR | model: 1525 Digital Incubator | |
Incubator shaker | Thermo Fisher Scientific | model: MaxQ 4000 | |
IPTG | Roche | 10724815001 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Liquide nitrogen | university chemistore | ||
Maltose | Sigma-Aldrich | 63418 | |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63138 | |
MgSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | model: 5424 | |
Miniprep plasmid purification kit | ZYMO RESEARCH | D4015 | |
monoclonal anti-FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | |
monoclonal anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H9658 | |
monoclonal anti-MYC antibody | Sigma-Aldrich | WH0004609M2 | |
Mortar | VWR | 89038-144 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | model: 2000 Spectrophotometer | |
Needle | Thermo Fisher Scientific | 14-826-5C | |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
PCR machine | Bio-Rad | model: C1000 | |
Pestle | VWR | 89038-160 | |
Pfu Ultra | Agilent Technologies | 600380 | |
Plant protease inhibitor coctail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
pMAL-c2 | NEB | N8076S | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Polyvinylpolypyrrolidone | Sigma-Aldrich | P6755 | |
SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
Sonicator | Qsonica Sonicators | model: Q125 | |
Syringe | Thermo Fisher Scientific | 22-253-260 | |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
T4 ligase | NEB | M0202S |