Bu makalenin amacı, RING tipi E3 ubikitin ligaseskapsamlı biyokimyasal ve fonksiyonel çalışmalar için bir anahat sunmaktır. Ayrıntılı protokollere sahip bu çok aşamalı boru hattı, test edilen proteinin enzimatik aktivitesini doğrular ve aktivitenin işlevine nasıl bağdaştırılabildiğini gösterir.
Proteinlerin çeviri sonrası modifikasyonu olarak ubikitinasyon ökaryotik hücrelerin homeostazisinde önemli bir düzenleyici rol oynar. Poliubiquitin zincirinin uzunluğu na ve topolojisine bağlı olarak, 76 amino asit ubiquitin değiştiricinin hedef proteine kovalent bağlanması, protein yıkımından modifiye proteinin lokalizasyonundaki değişikliklere ve/veya aktivitesine kadar farklı sonuçlara yol açabilir. Üç enzim sırayla her yerde alevlenme sürecini katalizler: E1 ubikitin aktive edici enzim, E2 ubikitin konjuge enzim, ve E3 ubikitin ligaz. E3 ubiquitin ligaz substrat özgüllüğünü belirler ve bu nedenle çok ilginç bir çalışma konusunu temsil eder. Burada RING tipi E3 ubiquitin ligazEnzimatik aktivitesi ve fonksiyonu arasındaki ilişkiyi incelemek için kapsamlı bir yaklaşım salıyoruz. Bu dört adımlı protokol 1) korunan RING etki alanını hedefleyen site yönelimli mutagenez aracılığıyla bir E3 ligase eksik mutant oluşturmak için nasıl açıklar; 2-3) hem in vitro hem de planta’da ubikitinasyon aktivitesinin nasıl incelenir; 4) nasıl test edilen proteinin biyolojik önemi için bu biyokimyasal analiz bağlamak için. Hala substrat ı ile etkileşime girebilen ama bozulma için artık her yerde bulunan bir E3 ligaz-eksik mutantın üretimi, in vivo enzim-substrat etkileşimlerinin testini kolaylaştırır. Ayrıca, korunmuş RING etki alanında mutasyon genellikle bir RNA-girişim yaklaşımına alternatif bir yaklaşım olarak fonksiyonel nakavt çalışmalarda kullanılabilir baskın bir negatif fenotip confers. Yöntemlerimiz parazitizmi teşvik etmek için bitki hücrelerinde konak her yerde bulunan sistemi kaçıran bitki parazitik nematod efektörü RHA1B’nin biyolojik rolünü araştırmak için optimize edilmiştir. In vivo ekspresyon sisteminin hafif modifikasyonu ile bu protokol, kökenine bakılmaksızın herhangi bir HALKA tipi E3 ligase analizine uygulanabilir.
E3 ubiquitin ligaseslerinin büyük çoğunluğu RING ‘e aittir (Really Interesting New Gene)tipi proteinler. RING-finger etki alanı başlangıçta Freemont ve arktarafından tanımlanmıştır. 1 ve fonksiyonel protein-protein etkileşimi aracılık bir etki alanı olarak tanımlanan2. Kanonik HALKA parmağı, özellikle diğer amino asit kalıntıları (X), C-X2-C-X9–39 -C-X1-3-H-X2-3-C-H-X2-C-X4–48-C-X2-C -C -C-C ile özel olarak tanımlanan çinko koordinasyon alanının özel bir türüdür. İki Zn2+ iyonları c1/C2 ve C/H5/C6 ile benzersiz “çapraz ayraç” topolojisi ile çekirdek C ve H artıkları ile stabilize edilirken, C3/H4 ve C7/C8 ikinciyi bağlarken(Şekil 1A)3,4. Beşinci Zn2+-koordinasyon bölgesinde C veya H varlığına bağlı olarak, RING-parmak proteinlerinin iki kanonik alt sınıfı tanımlanmıştır: C3HC4 ve C3H2C3 (sırasıyla RING-HC ve RING-H2). E3 ubiquitin ligazın RING etki alanı E2 konjuge enzimler ve substratlar arasındaki etkileşime aracılık ettiği için, bu temel C ve H kalıntılarının mutasyonunun ligaz aktivitesini bozduğu gösterilmiştir5. RING E3 ligazlarının daha az beş daha az yaygın alt sınıfı tanımlanmıştır (RING-v, RING-C2, RING-D, RING-S/T ve RING-G)6. RING tipi E3 ubikitin ligases daha basit ve karmaşık E3 enzimleri ayrılabilir. Basit tek alt birim RING E3 ligases hem substrat tanıma sitesi ve E2 bağlayıcı RING etki alanı içerir. Buna karşılık, multisubunit RING tipi E3 kompleksi ya acemi substrat veya E2-ubikitin orta E3 kompleksine bağlama aracılık. Kendi kendine ubikitinasyon için birincil ubiquitin eki site (ler) olarak hizmet veren RING etki Alanı Lys kalıntı(lar) da E3 ligaz aktivitesi için önemli olabilir.
Tüm HALKA içeren proteinler E3 ligaz olarak işlev almaz. Bu nedenle, RING-parmak etki alanının biyoinformatik tahmini ve E2’ye bağımlı protein ubiquitination kapasitesi biyokimyasal olarak doğrulanmalı ve test edilen proteinin biyolojik rolüne bağlanmalıdır. Burada, ring tipi E3 ubiquitin ligaseslerinin enzimatik aktivitesinin hem in vitro hem de planta olarak, site yönelimli mutagenez yaklaşımı yla nasıl saptanacağını ve işlevsel olarak karakterize edeceğini zindan eden bir adım adım protokolü açıklıyoruz. Bu boru hattının temsilsonuçları RING tipi E3 ligase RHA1B için gösterilmiştir. RHA1B bitki bağışıklığını bastırmak ve bitki kök hücrelerinin morfolojisini manipüle etmek için parazitik kist nematod Globodera pallida tarafından üretilen bir efektör proteindir. Patojen/parazit istilasından korunmak için bitkiler, bir patojen veya parazitin varlığını tespit eden nükleotid bağlayıcı etki alanı ve lösin bakımından zengin tekrar (NB-LRR) tipi bağışıklık reseptörleri geliştirmiş ve bunun sonucu olarak, patojenlerin kolonizasyonunu tutuklamak için enfeksiyon bölgesinde meydana gelen hızlı ve lokalize hücre ölümünün bir formu olan aşırı duyarlı yanıtı (HR) geliştirmektedirler. Böyle bir bağışıklık reseptörü G. pallida bazı izole direnç confers patates Gpa2 proteinidir (alan popülasyonları D383 ve D372)7.
Sunulan protokolleri kullanarak, son zamanlarda RHA1B her yerde ve bozulma için bitki Gpa2 immünreseptör hedefleyerek bir E3 bağımlı bir şekilde bitki bağışıklık sinyali müdahale bulunmuştur8.
RING tipi E3 ubikitin ligasesbiyokimyasal ve mekanistik temeli açıklığa kavuşturulması, gelişim, stres sinyalizasyonu ve homeostazın bakımındaki biyolojik önemini anlamamıza büyük katkıda bulunabilir. Protokol burada çiftlerin in vitro ve planta fonksiyonel çalışmalarda mutagenez yaklaşımını tanımlamıştır. Site-doğrudan mutagenez yoluyla RING etki alanının korunmuş artıkları tek bir amino asit ikamesi tanıtarak, ortaya çıkan E3-eksik mutant işlevsellik ile enzimatik aktivite bağlamak için yabani tip protein ile paralel olarak test edilebilir.
Ring etki alanını, özellikle de korunmuş Cys ve His artıklarını düzgün bir şekilde tanımlamak çok önemlidir. PROSITE gibi çevrimiçi araçlar bunu yapmak için kullanılabilir10. E2 enziminin işe alınmasından sorumlu RING etki alanını istikrarsızlaştırmak için, Cys normalde çinko koordinasyonu için kullanılan bir disülfür bağı oluşturma yeteneğinden yoksun en yakın yapısal replasmanı olan Ser ile değiştirilir. Lorick ve ark. bu kritik Cys kalıntılarının herhangi birinde mutasyonun tek alt birim RING tipi E3 ligases5’inher yerde ki reisinasyon aktivitesini ortadan kaldıracağını gösterdi. Bazı Kis kalıntıları ring tipi proteinler içeren çok üniteli E3 ligaz kompleksleri için de önemli olsa da, bu ubiquitination komplekslerinin çok yönlü ve dinamik üç boyutlu yapısı ve RING tipi proteinlerin farklı rolü nedeniyle, çok birimli E3 ligase’de RING etki alanında korunmuş kalıntıların tek ikameleri bir ligaz eksikliği fenotip11’iüretmede başarılı olmamıştır.
Site yönelimli mutagenez için, biz daha küçük plazmid vektörler ve daha düşük amplifikasyon döngüleri kullanarak genellikle mutagenez için daha yüksek verimlilik verdi bulundu. Pfu enzimi diğer yüksek sadakat ve yüksek prosesIVite DNA polimeraz ile değiştirilebilir. Ayrıca, ilgi geni nadir kodon içeriyorsa, başka bir E. coli leke, Rosetta, rekombinant protein in daha yüksek verim elde etmek için kullanılabilir. Ayrıca, IPTG indüksiyonu için hem kuluçka süresi hem de sıcaklık daha da optimize edilebilir. Daha düşük sıcaklıklar Bazı proteinlerin ekspresyonu için uygun olabilir E. coli bölünme oranını azaltmak. IPTG yüksek konsantrasyonprotein ekspresyonu artırabilir rağmen, aynı zamanda E. coli bölünme süreçleri inhibe ve tavsiye edilmez.
Tek alt birim RING tip E3 ligases sadece substrat yakın E2-Ub orta pozisyonları moleküler bir iskele olarak işlev değil, aynı zamanda onların cognate E2s ubiquitin transfer aktivitesini uyarır. Ayrıca, bir E2/E3 kombinasyonu nun modifiye edilmiş bir substrat ın kaderini belirleyen poliubiquitin zincirinin uzunluğu ve bağlantıları için önemli olduğu göz önüne alındığında, RING tipi E3’lerin herhangi bir dikkate enzimatik ortakları, E2s12içermelidir. Şekil 3B’degösterildiği gibi, test edilen Tüm E2’ler RHA1B ligaz ile uyumlu değildir. Bu nedenle, in vitro ubiquitination tahlilleri yanlış negatif sonuçları önlemek için farklı E2 sınıflarını temsil eden birden fazla E2 enzimleri ile paralel olarak yapılmalıdır.
Burada sunulan test RING-tipi proteinlerin kendi kendine her yerde yeteneğini algılar in vitro enzimatik testtir. Ancak, küçük değişiklikler ile, bu protokol kolayca substratların in vitro ubiquitination tespit etmek için uyarlanabilir. Bu amaçla, adım 2.15 gelen in vitro ubiquitination karışımı potansiyel E3 ligase substrat rekombinant protein ile takviye edilmelidir (500 ng). 30 °C’de 2 saatlik bir kuluçkadan sonra, her yerde bulunan protein 15 μL anti-HA afiity matris (HA-Ub kullanılıyorsa veya FLAG-Ub kullanılıyorsa ANTI-FLAG afiity matrisi) kullanılarak 4 °C’de 2 saat ajitasyon ile ele geçirilmelidir. Soğuk Ub yıkama tamponu (20 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 0.05% Tween 20, 1x PMSF) ile boncukları 4x kez yıkadıktan sonra, tamponun 40 μL’si hariç tümünü atın ve adım 2.16’ya geçin. Epitop etiketli Ub ve substrata özgü antikorlar tarafından saptanan ubikitinasyon sinyali, sırasıyla, substrat proteininin moleküler ağırlığından ortaya çıkan, substrat/enzim özgüllüğünü doğrular.
Ayrıca, in vivo’da E3 ligase substratlarının tanımlanması genellikle geçici enzim-substrat etkileşimi ve her yerde bulunan hedef proteinin hızlı bozulması nedeniyle birden fazla zorlukla ilişkilidir. Bir E3 ligase eksik mutant kullanarak, hala hedefi ile etkileşime ama artık13ubiquitinates , proteasomal inhibitörü MG132 eklenmesi için çok yararlı bir alternatiftir, hangi her zaman yeterince 26S proteozom fonksiyonu ile müdahale etmez.
RING tipi E3 ligaseslerinin ortak bir özelliği homo- ve/veya heterodimer olarak biçim ve işlev verme eğilimidir. İlginçtir, RING etki alanının korunmuş kalıntılar ikame genellikle bir yerli yabani tip protein enzimatik aktivite mutasyona uğramış HALKA tipi E3 ligaz blokları bir baskın negatif fenotip ile ilişkilidir13. Bu nedenle, planta RING mutantların aşırı ekspresyonu E3 ligaz geni nakavt için alternatif bir yaklaşım olabilir.
The authors have nothing to disclose.
Çalışmalarımız, USDA Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü, USDA-NIFA Farm Bill, Northwest Potato’ın Tarım ve Gıda Araştırma Girişimi’nin (2017-67014-26197; 2017-67014-26591) finansal desteği ile mümkün oldu. Konsorsiyum ve ISDA Özel Ürün.
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Amylose resin | NEB | E8021S | |
ATP | Sigma-Aldrich | A1852 | |
Bacterial protease inhibitor | Sigma-Aldrich | P8465 | |
Bromphenol Blue | VWR | 97061-690 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Centrifuge | Beckman Coulter | model: Avanti J-25 | |
Commassie Blue | VWR | 97061-738 | |
Creatine phosphate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
DNA clean & concentrator Kit | ZYMO RESEARCH | D4029 | |
DpnI | NEB | R0176S | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
E. coli BL21 | Thermo Fisher Scientific | C600003 | |
E. coli DH5α competent cells | Thermo Fisher Scientific | 18265017 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 324504 | |
FeSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | |
FLAG-Ub | BostonBiochem | U-120 | |
Glucose | VWR | 188 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
HA-Ub | BostonBiochem | U-110 | |
Heat block | VWR | model: 10153-318 | |
Incubator | VWR | model: 1525 Digital Incubator | |
Incubator shaker | Thermo Fisher Scientific | model: MaxQ 4000 | |
IPTG | Roche | 10724815001 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Liquide nitrogen | university chemistore | ||
Maltose | Sigma-Aldrich | 63418 | |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63138 | |
MgSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | model: 5424 | |
Miniprep plasmid purification kit | ZYMO RESEARCH | D4015 | |
monoclonal anti-FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | |
monoclonal anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H9658 | |
monoclonal anti-MYC antibody | Sigma-Aldrich | WH0004609M2 | |
Mortar | VWR | 89038-144 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | model: 2000 Spectrophotometer | |
Needle | Thermo Fisher Scientific | 14-826-5C | |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
PCR machine | Bio-Rad | model: C1000 | |
Pestle | VWR | 89038-160 | |
Pfu Ultra | Agilent Technologies | 600380 | |
Plant protease inhibitor coctail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
pMAL-c2 | NEB | N8076S | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Polyvinylpolypyrrolidone | Sigma-Aldrich | P6755 | |
SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
Sonicator | Qsonica Sonicators | model: Q125 | |
Syringe | Thermo Fisher Scientific | 22-253-260 | |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
T4 ligase | NEB | M0202S |