इस पांडुलिपि का लक्ष्य रिंग-प्रकार ई 3 सर्वव्यापक लिगैसों के व्यापक जैव रासायनिक और कार्यात्मक अध्ययनों के लिए एक रूपरेखा पेश करना है। विस्तृत प्रोटोकॉल के साथ यह मल्टीस्टेप पाइपलाइन, परीक्षण किए गए प्रोटीन की एक एंजाइमैटिक गतिविधि को मान्य करती है और यह दर्शाती है कि गतिविधि को कार्य करने के लिए कैसे लिंक किया जाए।
सर्वव्यापकता, प्रोटीन के एक पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन के रूप में, यूकेरियोटिक कोशिकाओं के होमोस्टिसिस में एक महत्वपूर्ण नियामक भूमिका निभाती है। पॉलीयूबिक्विटिन श्रृंखला की लंबाई और टोपोलॉजी के आधार पर 76 अमीनो एसिड सर्वव्यापकता के सहसंयोजक लगाव के परिणामस्वरूप प्रोटीन क्षरण से लेकर स्थानीयकरण में परिवर्तन और/या संशोधित प्रोटीन की गतिविधि तक विभिन्न परिणाम हो सकते हैं। तीन एंजाइम क्रमिक रूप से सर्वव्यापी प्रक्रिया को उत्प्रेरक करते हैं: E1 सर्वव्यापी-सक्रिय एंजाइम, E2 सर्वव्यापी-conjugating एंजाइम, और E3 सर्वव्यापक लिगासे। E3 सर्वव्यापी लिगासे सब्सट्रेट विशिष्टता निर्धारित करता है और इसलिए, एक बहुत ही दिलचस्प अध्ययन विषय का प्रतिनिधित्व करता है। यहां हम रिंग-टाइप ई3 सर्वव्यापक लिगास के एंजाइमैटिक गतिविधि और कार्य के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं। यह चार चरण प्रोटोकॉल 1 का वर्णन करता है) संरक्षित रिंग डोमेन पर लक्षित साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस के माध्यम से ई 3 लिगास की कमी उत्परिवर्ती कैसे उत्पन्न करें; 2-3) विट्रो और प्लांटा दोनों में सर्वव्यापी गतिविधि की जांच कैसे करें; 4) उन जैव रासायनिक विश्लेषण को परीक्षण प्रोटीन के जैविक महत्व से कैसे जोड़ें। एक E3 लिगाज-कमी उत्परिवर्ती की पीढ़ी जो अभी भी अपने सब्सट्रेट के साथ बातचीत करती है लेकिन अब इसे गिरावट के लिए सर्वव्यापी नहीं करती है, वीवो में एंजाइम-सब्सट्रेट इंटरैक्शन के परीक्षण की सुविधा प्रदान करती है। इसके अलावा, संरक्षित रिंग डोमेन में उत्परिवर्तन अक्सर एक प्रमुख नकारात्मक फेनोटाइप प्रदान करता है जिसका उपयोग आरएनए-हस्तक्षेप दृष्टिकोण के वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में कार्यात्मक नॉकआउट अध्ययनमें किया जा सकता है। हमारे तरीकों को पौधे परजीवी सूत्रकृमि प्रभावक RHA1B की जैविक भूमिका की जांच करने के लिए अनुकूलित किया गया था, जो परजीवीवाद को बढ़ावा देने के लिए पौधे की कोशिकाओं में मेजबान सर्वव्यापकता प्रणाली का अपहरण करता है। वीवो अभिव्यक्ति प्रणाली में मामूली संशोधन के साथ, इस प्रोटोकॉल को इसके मूल की परवाह किए बिना किसी भी रिंग-प्रकार E3 लिगाज़ के विश्लेषण पर लागू किया जा सकता है।
E3 सर्वव्यापी liगैसों के विशाल बहुमत अंगूठी के हैं(आरeally मैंnteresting New Gene)- प्रकार प्रोटीन । रिंग-फिंगर डोमेन को मूल रूप से फ्रीमोंट एट अलद्वारा पहचाना गया था। 1 और कार्यात्मक प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन2मध्यस्थता के रूप में वर्णित है । विहित रिंग फिंगर एक विशेष प्रकार का जिंक समन्वय डोमेन है जिसे आठ संरक्षित सीवाईएस (सी) और उनके (एच) के सर्वसम्मति अनुक्रमके रूप में परिभाषित किया गया है, जो विशेष रूप से अन्य अमीनो एसिड अवशेषों (एक्स), सी-एक्स 2-सी-एक्स9-39-सी-एक्स1-3-एच-एक्स2-सी-एच-एक्स2-सी-एक्स 2-सी-एक्स4-सी-एक्स-सी-सी-सीद्वारा स्थान पर है । दो Zn2 + आयनों सी1/सी2 और सी/एच5/सी6 के साथ अद्वितीय “क्रॉस-ब्रेस” टोपोलॉजी के माध्यम से कोर सी और एच अवशेषों द्वारा स्थिर कर रहे है पहले Zn2 + आयन जबकि सी3/एच4 और सी7/सी8 दूसरे बांध(चित्रा 1ए)3,4। पांचवें Zn2 +-समंवय साइट में सी या एच की उपस्थिति के आधार पर, रिंग-फिंगर प्रोटीन के दो विहित उपवर्गों को परिभाषित किया गया था: C3HC4 और C3H2C3 (रिंग-एचसी और रिंग-एच 2, क्रमशः)। क्योंकि E3 सर्वव्यापी लिगास का रिंग डोमेन E2 conjugating एंजाइमों और सब्सट्रेट्स के बीच बातचीत में मध्यस्थता करता है, इन आवश्यक सी और एच अवशेषों के उत्परिवर्तन को लिगास गतिविधि5को बाधित करने के लिए दिखाया गया है। रिंग E3 लिगैसों के एक अतिरिक्त पांच कम आम उपवर्गों का वर्णन किया गया है (रिंग-वी, रिंग-सी 2, रिंग-डी, रिंग-एस/टी, और रिंग-जी)6। रिंग-टाइप E3 सर्वव्यापी लिगैसों को सरल और जटिल E3 एंजाइमों में और अधिक विभाजित किया जा सकता है। सरल एकल उपइकाई रिंग E3 लिगैसों में सब्सट्रेट मान्यता साइट और ई 2-बाध्यकारी रिंग डोमेन दोनों होते हैं। इसके विपरीत, मल्टीसबयूनिट रिंग-टाइप ई 3 कॉम्प्लेक्स या तो ई 2-सर्वव्यापक मध्यवर्ती के बाध्यकारी के सब्सट्रेट की भर्ती करता है। रिंग डोमेन लायस अवशेष (एस) जो स्वयं-सर्वव्यापकता के लिए प्राथमिक सर्वव्यापी लगाव साइट (एस) के रूप में कार्य करता है, E3 लिगाज़ गतिविधि के लिए भी महत्वपूर्ण हो सकता है।
सभी रिंग युक्त प्रोटीन E3 लिगैसके रूप में कार्य नहीं करते हैं। इस प्रकार, रिंग-फिंगर डोमेन की बायोइन्फॉर्मेटिक भविष्यवाणी और ई 2-निर्भर प्रोटीन सर्वव्यापकता के लिए क्षमता को जैव रासायनिक रूप से मान्य किया जाना चाहिए और परीक्षण किए गए प्रोटीन की जैविक भूमिका से जोड़ा जाना चाहिए। यहां, हम एक चरण-दर-कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसमें साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस दृष्टिकोण के माध्यम से रिंग-प्रकार ई 3 सर्वव्यापी लिगैसों की एंजाइमैटिक गतिविधि का पता लगाने और कार्यात्मक रूप से विशेषता है। इस पाइपलाइन से प्रतिनिधि परिणाम रिंग-प्रकार E3 लिगाज़ RHA1B के लिए दिखाए जाते हैं। RHA1B पौधे की प्रतिरक्षा को दबाने और पौधे की जड़ कोशिकाओं की आकृति विज्ञान में हेरफेर करने के लिए पौधे परजीवी पुटी नेमाटोड ग्लोबोडेरा पैलिडा द्वारा उत्पादित एक प्रभावक प्रोटीन है। रोगजनक/परजीवी आक्रमण से खुद को बचाने के लिए, पौधों ने न्यूक्लियोटाइड-बाध्यकारी डोमेन और ल्यूसिन-रिच रिपीट (एनबी-एलआरआर) प्रकार के प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स विकसित किए हैं जो रोगजनक या परजीवी की उपस्थिति का पता लगाते हैं और परिणामस्वरूप, अतिसंवेदनशील प्रतिक्रिया (एचआर) विकसित करते हैं, जो रोगजनकों के उपनिवेशको रोकने के लिए संक्रमण स्थल पर होने वाली तीव्र और स्थानीयकृत कोशिका मृत्यु का एक रूप है। ऐसा ही एक प्रतिरक्षा रिसेप्टर आलू Gpa2 प्रोटीन है जो जी पैलिडा (क्षेत्र की आबादी D383 और D372)7के कुछ अलग-अलग लोगों के प्रतिरोध प्रदान करता है।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हाल ही में पाया गया है कि RHA1B सर्वव्यापकता और क्षरण8के लिए संयंत्र Gpa2 इम्यूनोरिसेप्टर को लक्षित करके ई 3-निर्भर तरीके से पौधे प्रतिरक्षा संकेत के साथ हस्तक्षेप करता है।
रिंग प्रकार E3 सर्वव्यापी लिगैसों के जैव रासायनिक और मशीनी आधार को स्पष्ट करना विकास, तनाव संकेत, और होमोस्टोसिस के रखरखाव में उनके जैविक महत्व के बारे में हमारी समझ में बहुत योगदान दे सकता है। प्रोटोकॉल यहां वर्णित जोड़ों में विट्रो के साथ और planta कार्यात्मक अध्ययन में एक उत्पत्ति दृष्टिकोण । साइट-प्रत्यक्ष म्यूटाजेनेसिस के माध्यम से रिंग डोमेन के संरक्षित अवशेषों में एक अमीनो एसिड प्रतिस्थापन शुरू करके, जिसके परिणामस्वरूप E3-कमी उत्परिवर्ती का परीक्षण कार्यक्षमता के साथ एंजाइमैटिक गतिविधि को जोड़ने के लिए जंगली प्रकार प्रोटीन के समानांतर किया जा सकता है।
रिंग डोमेन, विशेष रूप से इसके संरक्षित Cys और उसके अवशेषों की ठीक से पहचान करना महत्वपूर्ण है। प्रोसाइट जैसे ऑनलाइन टूल का उपयोग10ऐसा करने के लिए किया जा सकता है। E2 एंजाइम की भर्ती के लिए जिम्मेदार रिंग डोमेन को अस्थिर करने के लिए, Cys आम तौर पर सेर के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है, जो इसके निकटतम संरचनात्मक प्रतिस्थापन में जिंक समन्वय के लिए उपयोग किए जाने वाले डिसुल्फिड बांड बनाने की क्षमता की कमी है। लॉरिक एट अल से पता चला है कि उन महत्वपूर्ण Cys अवशेषों में से किसी में उत्परिवर्तन एकल उपइकाई अंगूठी प्रकार E3liगैसों 5की सर्वव्यापकता गतिविधि को समाप्त करेगा । हालांकि कुछ Cys अवशेष ों को रिंग-प्रकार प्रोटीन युक्त बहुइकाई E3 लिगास परिसरों के लिए भी महत्वपूर्ण है, उन सर्वव्यापकता परिसरों की बहुआयामी और गतिशील त्रि-आयामी संरचना और रिंग-प्रकार प्रोटीन की विभिन्न भूमिका के कारण, बहुइकाई E3 लिगास में रिंग डोमेन में संरक्षित अवशेषों के एकल प्रतिस्थापन11
साइट निर्देशित म्यूटाजेनेसिस के लिए, हमने पाया कि छोटे प्लाज्मिड वेक्टर और कम प्रवर्धन चक्रों का उपयोग करने से आमतौर पर म्यूटाजेनेसिस के लिए उच्च दक्षता प्राप्त होती है। Pfu एंजाइम किसी भी अन्य उच्च निष्ठा और उच्च प्रक्रिया डीएनए बहुलक के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। इसके अलावा, यदि ब्याज के जीन दुर्लभ कोडन शामिल हैं, एक और ई. कोलाई दाग, रोसेटा, recombinant प्रोटीन की उच्च उपज प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, आईपीटीजी इंडक्शन के लिए ऊष्मायन समय और तापमान दोनों को और अनुकूलित किया जा सकता है। कम तापमान ई. कोलाई डिवीजन दर को कम करते हैं, जो कुछ प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए अनुकूल हो सकता है । हालांकि आईपीटीजी की उच्च एकाग्रता प्रोटीन अभिव्यक्ति में सुधार कर सकती है, यह ई कोलाई डिवीजन प्रक्रियाओं को भी रोकती है और इसकी सिफारिश नहीं की जाती है।
एकल उपइकाई रिंग प्रकार E3 लिगैसन न केवल एक आणविक पाड़ के रूप में कार्य करती है जो सब्सट्रेट के करीब निकटता में ई 2-यूबी मध्यवर्ती की स्थिति है बल्कि उनके कॉग्नेट E2s की सर्वव्यापी हस्तांतरण गतिविधि को भी प्रोत्साहित करती है। इसके अलावा, यह देखते हुए कि एक E2/E3 संयोजन पॉलीयूबिक्विटिन श्रृंखला की लंबाई और संबंधों के लिए महत्वपूर्ण है जो एक संशोधित सब्सट्रेट के भाग्य को निर्धारित करता है, रिंग-प्रकार ई3एस के किसी भी विचार में उनके एंजाइमैटिक पार्टनर, E2s12शामिल होने चाहिए । जैसा कि चित्रा 3बीमें दिखाया गया है, सभी परीक्षण किए गए ई2एस RHA1B लिगाज़ के साथ संगत नहीं हैं। इसलिए, झूठे नकारात्मक परिणामों से बचने के लिए विभिन्न E2 वर्गों का प्रतिनिधित्व करने वाले कई E2 एंजाइमों के साथ समानांतर में इन विट्रो सर्वव्यापी परख किया जाना चाहिए।
यहां प्रस्तुत इन विट्रो एंजाइमैटिक परख है जो परीक्षण किए गए रिंग-प्रकार प्रोटीन की आत्म-सर्वव्यापीता क्षमता का पता लगाता है। हालांकि, छोटे संशोधनों के साथ, इस प्रोटोकॉल को आसानी से सब्सट्रेट्स के इन विट्रो सर्वव्यापकता का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस उद्देश्य के लिए, चरण 2.15 से इन विट्रो सर्वव्यापकता मिश्रण को संभावित E3 लिगाज़ सब्सट्रेट (500 एनजी) के पुनर्संयोजन प्रोटीन के साथ पूरक किया जाना चाहिए। 30 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे ऊष्मायन के बाद, सर्वव्यापी प्रोटीन विरोधी हा आत्मीयता मैट्रिक्स के 15 μL का उपयोग कर पर कब्जा कर लिया जाना चाहिए (यदि एचए-यूबी का उपयोग किया जाता है, या विरोधी झंडा आत्मीयता मैट्रिक्स अगर ध्वज-Ub प्रयोग किया जाता है) 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए आंदोलन द्वारा । ठंडयू वॉश बफर (20 एमएम ट्रिस पीएच 7.5, 100 एमएम एनएसीएल, 0.1 एम एम ईटीए, 0.05% ट्वीन 20, 1x PMSF) के साथ मोती 4x बार धोने के बाद, बफर के सभी लेकिन 40 माइक्रोन को त्यागें और 2.16 कदम पर जाएं। सर्वव्यापकता संकेत, जो क्रमशः एपिटोप-टैग यूबी और सब्सट्रेट के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा पाया गया, सब्सट्रेट प्रोटीन के आणविक वजन से उभर रहा है, सब्सट्रेट/एंजाइम विशिष्टता की पुष्टि करता है ।
इसके अलावा, वीवो में E3 लिगाज सब्सट्रेट्स की पहचान आमतौर पर क्षणिक एंजाइम-सब्सट्रेट इंटरैक्शन और सर्वव्यापी लक्ष्य प्रोटीन के तेजी से क्षरण के कारण कई चुनौतियों से जुड़ी होती है। एक E3 ligase कमी उत्परिवर्ती का उपयोग करना, जो अभी भी अपने लक्ष्य के साथ बातचीत लेकिन अब यह13सर्वव्यापी, प्रोटेसोमल अवरोधक MG132 के अलावा एक बहुत ही उपयोगी विकल्प है, जो हमेशा पर्याप्त रूप से 26S प्रोटेसोम समारोह के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है ।
रिंग-टाइप E3 लिगैसों की एक आम विशेषता होमो-और/या विषमता के रूप में बनाने और कार्य करने की प्रवृत्ति है। दिलचस्प बात यह है कि रिंग डोमेन के संरक्षित अवशेषों में प्रतिस्थापन आमतौर पर एक प्रमुख नकारात्मक फेनोटाइप से जुड़ा होता है जहां उत्परिवर्तित रिंग-प्रकार ई3 लिगास देशी जंगली प्रकार प्रोटीन13की एंजाइमैटिक गतिविधि को अवरुद्ध करता है। इस प्रकार, प्लांटा में रिंग म्यूटेंट की अतिअभिव्यक्ति E3 लिगाज जीन को खटखटाने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण हो सकता है।
The authors have nothing to disclose.
हमारा काम कृषि और खाद्य अनुसंधान पहल प्रतिस्पर्धी अनुदान (2017-67014-26197; 2017-67014-26591) यूएसडीए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ फूड एंड एग्रीकल्चर, यूएसडीए-एनआईएफए फार्म बिल, नॉर्थवेस्ट आलू से वित्तीय सहायता से संभव बनाया गया था । कंसोर्टियम, और आईएसडीए विशेषता फसल ।
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Amylose resin | NEB | E8021S | |
ATP | Sigma-Aldrich | A1852 | |
Bacterial protease inhibitor | Sigma-Aldrich | P8465 | |
Bromphenol Blue | VWR | 97061-690 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Centrifuge | Beckman Coulter | model: Avanti J-25 | |
Commassie Blue | VWR | 97061-738 | |
Creatine phosphate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
DNA clean & concentrator Kit | ZYMO RESEARCH | D4029 | |
DpnI | NEB | R0176S | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
E. coli BL21 | Thermo Fisher Scientific | C600003 | |
E. coli DH5α competent cells | Thermo Fisher Scientific | 18265017 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 324504 | |
FeSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | |
FLAG-Ub | BostonBiochem | U-120 | |
Glucose | VWR | 188 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
HA-Ub | BostonBiochem | U-110 | |
Heat block | VWR | model: 10153-318 | |
Incubator | VWR | model: 1525 Digital Incubator | |
Incubator shaker | Thermo Fisher Scientific | model: MaxQ 4000 | |
IPTG | Roche | 10724815001 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Liquide nitrogen | university chemistore | ||
Maltose | Sigma-Aldrich | 63418 | |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63138 | |
MgSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | model: 5424 | |
Miniprep plasmid purification kit | ZYMO RESEARCH | D4015 | |
monoclonal anti-FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | |
monoclonal anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H9658 | |
monoclonal anti-MYC antibody | Sigma-Aldrich | WH0004609M2 | |
Mortar | VWR | 89038-144 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | model: 2000 Spectrophotometer | |
Needle | Thermo Fisher Scientific | 14-826-5C | |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
PCR machine | Bio-Rad | model: C1000 | |
Pestle | VWR | 89038-160 | |
Pfu Ultra | Agilent Technologies | 600380 | |
Plant protease inhibitor coctail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
pMAL-c2 | NEB | N8076S | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Polyvinylpolypyrrolidone | Sigma-Aldrich | P6755 | |
SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
Sonicator | Qsonica Sonicators | model: Q125 | |
Syringe | Thermo Fisher Scientific | 22-253-260 | |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
T4 ligase | NEB | M0202S |