Målet med detta manuskript är att presentera en skiss för de omfattande biokemiska och funktionella studierna av RINGTYP E3 ubiquitin Ligaser. Denna i flera steg pipeline, med detaljerade protokoll, validerar en enzymatisk aktivitet av det testade proteinet och visar hur man kopplar aktiviteten till funktion.
Ubiquitination, som en posttranslationell modifiering av proteiner, spelar en viktig reglerande roll i homeostas av eukaryotiska celler. Den kovalent fastsättning av 76 aminosyran ubiquitin modifierare till ett målprotein, beroende på längden och topologin av polyubiquitin kedjan, kan resultera i olika resultat från proteinnedbrytning till förändringar i lokalisering och/eller aktivitet av modifierat protein. Tre enzymer katalyserar sekventiellt den ubiquitination processen: E1 ubiquitin-aktiverande enzym, E2 ubiquitin-konjugating enzym, och E3 ubiquitin Ligase. E3 ubiquitin Ligase bestämmer substrat specificitet och, därför, representerar en mycket intressant studieämne. Här presenterar vi en övergripande strategi för att studera sambandet mellan den enzymatiska aktiviteten och funktionen av RINGTYP E3 ubiquitin Ligase. Detta protokoll i fyra steg beskriver 1) hur man genererar en E3 Ligase bristfällig Mutant genom platsriktade mutagenes riktade mot den bevarade RING domänen; 2 – 3) hur man undersöker ubiquitination aktivitet både in vitro-och i planta; 4) hur man kopplar dessa biokemiska analyser till den biologiska betydelsen av det testade proteinet. Generering av en E3 Ligase-brist Mutant som fortfarande interagerar med dess substrat men inte längre ubiquitinates det för nedbrytning underlättar testning av enzym-substrat interaktioner in vivo. Dessutom ger mutationen i den bevarade RING domänen ofta en dominerande negativ fenotyp som kan utnyttjas i funktionella knockout-studier som en alternativ metod för en RNA-interferensmetod. Våra metoder var optimerade för att undersöka den biologiska rollen av växten parasitiska Nematoden effektor RHA1B, som kapar värd ubiquitination systemet i växtceller för att främja parasitism. Med smärre ändringar av in vivo-uttryckssystemet kan detta protokoll tillämpas på analysen av alla RINGTYP E3 Ligase oavsett dess ursprung.
De allra flesta av E3 ubiquitin Ligaser tillhör RING (Really jagnteresting NEW Gene)-typ proteiner. RING fingret domänen identifierades ursprungligen av Freemont et al. 1 och funktionellt beskrivas som en domän medla protein-protein interaktion2. Den kanoniska RING fingret är en speciell typ av zink samordnande domän definieras som en konsensus sekvens av åtta bevarade CYS (C) och hans (H) särskilt fördelade på andra aminosyra rester (X), C-X2-c-x9 – 39-c-x1 – 3-H-x2 – 3-c/H-x2-c-x4 – 48-c-x2-c. Två Zn2 + -joner stabiliseras med Core c och H-rester genom unik “Cross-Brace”-topologi med c1/c2 och c/H5/c6 som samordnar den första Zn2 + -Jon medan c3/h4 och c7/c8 binder den andra (figur 1A)3,4. Beroende på närvaron av antingen C eller H i femte Zn2 +-koordinations platsen, definierades två kanoniska subklasser av ringfinger proteiner: C3HC4 och C3H2C3 (Ring-HC respektive ring-H2). Eftersom RING domänen E3 ubiquitin Ligase förmedlar samspelet mellan E2 konjugerande enzymer och substrat, har mutation av dessa essentiella C-och H-rester visat sig störa ligasaktiviteten5. Ytterligare fem mindre vanliga subklasser av RING E3 Ligaser har beskrivits (RING-v, RING-C2, RING-D, RING-S/T, och RING-G)6. RINGTYPEN E3 ubiquitin Ligaser kan delas upp i enkla och komplexa E3-enzymer. Den enkla enskilda del enhets ringen E3-Ligaser innehåller både substrat igenkännings platsen och den E2-bindande RING domänen. Däremot multisubunit RING-typ E3 komplex antingen rekrytera substrat eller förmedlar bindning av E2-ubiquitin intermediären till E3-komplexet. RING domänen Lys rester (s) som fungerar som en primär ubiquitin bifogad plats (er) för själv-ubiquitination kan också vara viktigt för E3 Ligase aktivitet.
Inte alla RINGHALTIGA proteiner fungerar som E3-Ligaser. Sålunda, den bioinformatiska förutsägelse av RING fingret domän och kapaciteten för E2-beroende protein ubiquitination måste vara biokemiskt validerade och kopplade till den biologiska rollen av det testade proteinet. Här beskriver vi ett steg-för-steg-protokoll som beskriver hur man upptäcker och funktionellt karakteriserar den enzymatiska aktiviteten hos RINGTYP E3 ubiquitin-Ligaser, både in vitro och i planta, genom en platsstyrd mutagenes-metod. Representativa resultat från denna pipeline visas för RING-Type E3 Ligase RHA1B. RHA1B är ett effektorprotein som produceras av växten parasitisk cysta Nematoden Globodera pallida att undertrycka växt immunitet och manipulera morfologin av växt rot celler. För att skydda sig mot patogen/parasit invasion, växter har utvecklats nukleotid-bindande domän och leucin-Rich REPEAT (NB-LRR) typ immun receptorer som upptäcker närvaron av en patogen eller parasit och, som en följd, utveckla den överkänsliga svar (HR), som är en form av snabb och lokaliserad celldöd inträffar vid infektionsstället att gripa koloniseringen av patogener. En sådan immun receptor är Potato Gpa2 protein som ger resistens mot vissa isolat av G. pallida (fält populationer D383 och D372)7.
Med hjälp av de presenterade protokollen, har det nyligen visat sig att RHA1B interfererar med växt immun signalering på ett E3-beroende sätt genom att rikta anläggningen Gpa2 immunoreceptor för ubiquitination och nedbrytning8.
Belysa den biokemiska och mekanistiska grunden för RING typ E3 ubiquitin Ligaser kan bidra i hög grad till vår förståelse av deras biologiska betydelse i utvecklingen, stress signalering, och underhåll av homeostas. Det protokoll som beskrivs här par en mutagenes metod med in vitro-och i planta funktionella studier. Genom att införa en enda aminosyrasubstitution i de bevarade resterna av ringen domänen genom plats-direkt mutagenes, den resulterande E3-brist Mutant kan testas parallellt med Wild typ protein för att länka enzymatisk aktivitet med funktionalitet.
Det är viktigt att korrekt identifiera ringen domänen, särskilt dess bevarade Cys och hans rester. Online-verktyg som PROSITE kan användas för att göra det10. För att destabilisera ringen domän ansvarig för rekrytering av E2 enzymet, CYS ersätts normalt med ser, som är dess närmaste strukturella ersättare saknar förmåga att skapa en disulfid obligation som används för zink samordning. Lorick et al. visade att mutationen i någon av dessa kritiska CYS rester skulle avskaffa ubiquitination aktiviteten av enstaka subenhet ring-typ E3 Ligaser5. Även om vissa CYS rester är också viktiga för bokades E3 Ligase komplex som innehåller ring-typ proteiner, på grund av den mångfacetterade och dynamiska tredimensionell struktur av dessa ubiquitination komplex och olika roll ring-typ proteiner, enstaka substitutioner av bevarade rester i ringen domän i bokades E3 Ligase har inte lyckats generera en Ligase bristfällig fenotyp11.
För den platsriktade mutagenes, fann vi att använda mindre plasmid vektorer och lägre amplifiering cykler vanligtvis gav högre effektivitet för mutagenes. Den PFU enzym kan ersättas med någon annan High-Fidelity och hög processivitet DNA-polymeras. Dessutom, om genen av intresse innehåller sällsynta kodons, en annan E. coli fläck, Rosetta, kan användas för att uppnå högre avkastning av rekombinant protein. Dessutom kan både inkuberingstid och temperatur för IPTG-induktion optimeras ytterligare. Lägre temperaturer minska E. coli Division Rate, som kan vara gynnsam för uttryck av vissa proteiner. Även om högre koncentration av IPTG kan förbättra protein uttrycket, det hämmar också E. coli Division processer och rekommenderas inte.
Enstaka subenhet ring typ E3 Ligaser fungerar inte bara som en molekylär byggnadsställning som placerar E2-UB intermediären i närheten av underlaget, men också stimulera ubiquitin överföring aktivitet av deras besläktat E2s. Med tanke på att en E2/E3-kombination är viktig för längden och kopplingarna i kedjan polyubiquitin som bestämmer ödet för ett modifierat substrat, måste varje övervägande av RINGTYP E3s innefatta deras enzymatiska partner E2s12. Som visas i figur 3Bär inte alla testade E2s kompatibla med RHA1B Ligase. Därför bör ubiquitination in vitro-analyser utföras parallellt med flera E2-enzymer som representerar olika E2-klasser för att undvika falskt negativa resultat.
Presenteras här är den in vitro enzymatisk analys som detekterar själv ubiquitination förmåga testade RING-typ proteiner. Men med små ändringar, detta protokoll kan lätt anpassas för att upptäcka in vitro ubiquitination av substrat. För detta ändamål bör den ubiquitination in vitro-blandningen från steg 2,15 kompletteras med det rekombinanta proteinet av det potentiella E3-ligassubstrat (500 ng). Efter en 2 h inkubation vid 30 ° c ska och protein fångas upp med 15 μl av anti-ha-affinitetsmatrisen (om ha-UB används, eller om flagg-UB används vid användning av flagga) genom agitation under 2 timmar vid 4 ° c. Efter tvättning av pärlorna 4x gånger med den kalla UB tvättbuffert (20 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, 1x PMSF), kassera alla utom 40 μL av bufferten och flytta till steg 2,16. Den ubiquitination signalen, detekteras av antikroppar som är specifika för Epitope-märkta UB och substrat, respektive, som växer fram från molekylvikt av substrat proteinet, bekräftar substratet/enzym specificitet.
Dessutom är identifiering av E3 ligassubstrat in vivo vanligtvis förknippat med flera utmaningar på grund av övergående enzym-substrat interaktion och snabb nedbrytning av och målprotein. Med hjälp av en E3 Ligase bristfällig Mutant, som fortfarande interagerar med sitt mål men inte längre ubiquitinates det13, är ett mycket användbart alternativ till tillsats av proteasomen inhibitor MG132, som inte alltid tillräckligt störa 26S proteasom funktion.
En vanlig egenskap hos RINGTYP E3-Ligaser är en tendens att bilda och fungera som homo-och/eller heterodimers. Intressant, substitution i bevarade rester av ringen domänen är vanligtvis förknippas med en dominerande negativ fenotyp där muterade RING-typ E3 Ligase blockerar enzymatisk aktivitet av en infödd vild typ protein13. Således kan överuttryck av RING mutanter i planta vara ett alternativt sätt att knacka ut E3 Ligase genen.
The authors have nothing to disclose.
Vårt arbete möjliggjordes av det ekonomiska stödet från jordbruks-och livsmedels forskningsinitiativet Competitive Grant (2017-67014-26197; 2017-67014-26591) från USDA National Institute of Food and Agriculture, USDA-NIFA Farm Bill, Northwest potato Konsortiet och ISDA Specialty Crop.
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Amylose resin | NEB | E8021S | |
ATP | Sigma-Aldrich | A1852 | |
Bacterial protease inhibitor | Sigma-Aldrich | P8465 | |
Bromphenol Blue | VWR | 97061-690 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Centrifuge | Beckman Coulter | model: Avanti J-25 | |
Commassie Blue | VWR | 97061-738 | |
Creatine phosphate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
DNA clean & concentrator Kit | ZYMO RESEARCH | D4029 | |
DpnI | NEB | R0176S | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
E. coli BL21 | Thermo Fisher Scientific | C600003 | |
E. coli DH5α competent cells | Thermo Fisher Scientific | 18265017 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 324504 | |
FeSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | |
FLAG-Ub | BostonBiochem | U-120 | |
Glucose | VWR | 188 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
HA-Ub | BostonBiochem | U-110 | |
Heat block | VWR | model: 10153-318 | |
Incubator | VWR | model: 1525 Digital Incubator | |
Incubator shaker | Thermo Fisher Scientific | model: MaxQ 4000 | |
IPTG | Roche | 10724815001 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Liquide nitrogen | university chemistore | ||
Maltose | Sigma-Aldrich | 63418 | |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63138 | |
MgSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | model: 5424 | |
Miniprep plasmid purification kit | ZYMO RESEARCH | D4015 | |
monoclonal anti-FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | |
monoclonal anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H9658 | |
monoclonal anti-MYC antibody | Sigma-Aldrich | WH0004609M2 | |
Mortar | VWR | 89038-144 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | model: 2000 Spectrophotometer | |
Needle | Thermo Fisher Scientific | 14-826-5C | |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
PCR machine | Bio-Rad | model: C1000 | |
Pestle | VWR | 89038-160 | |
Pfu Ultra | Agilent Technologies | 600380 | |
Plant protease inhibitor coctail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
pMAL-c2 | NEB | N8076S | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Polyvinylpolypyrrolidone | Sigma-Aldrich | P6755 | |
SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
Sonicator | Qsonica Sonicators | model: Q125 | |
Syringe | Thermo Fisher Scientific | 22-253-260 | |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
T4 ligase | NEB | M0202S |