Summary
Vi tilbyder en metode til at identificere modulatorer af bladtranspiration ved storstilet screening af et sammensat bibliotek.
Abstract
Plantetilpasning til biotiske og abiotiske belastninger styres af en række faktorer, blandt hvilke reguleringen af stomatal blænde som reaktion på vandunderskud eller patogener spiller en afgørende rolle. Identifikation af små molekyler, der regulerer stomatal bevægelse kan derfor bidrage til at forstå det fysiologiske grundlag, som planter tilpasse sig deres miljø. Storstilede screeningsmetoder, der er blevet anvendt til at identificere regulatorer af stomatal bevægelse har potentielle begrænsninger: nogle er stærkt afhængige af abscisic syre (ABA) hormon signalering vej, derfor udelukkeABA-uafhængige mekanismer, mens andre er afhængige af observation af indirekte, langsigtede fysiologiske virkninger såsom plantevækst og udvikling. Den screeningmetode, der præsenteres her, gør det muligt at behandle anlæg i stor skala med et bibliotek af kemikalier kombineret med en direkte kvantificering af deres transpiration ved termisk billeddannelse. Da fordampning af vand gennem transpiration resulterer i bladoverfladekøling, giver termisk billeddannelse en ikke-invasiv tilgang til at undersøge ændringer i stomatal ledningsevne over tid. I denne protokol dyrkes Helianthus annuus-planter hydroponically og behandles derefter ved rodfodring, hvor den primære rod skæres og dyppes i det kemikalie, der testes. Termisk billeddannelse efterfulgt af statistisk analyse af kotyledonære temperaturændringer over tid giver mulighed for identifikation af bioaktive molekyler modulerende stomatal blænde. Vores proof-of-concept eksperimenter viser, at et kemikalie kan transporteres fra skæret rod til cotyledon af solsikke kimplante inden for 10 minutter. Når planter behandles med ABA som en positiv kontrol, kan der desuden påvises en stigning i bladoverfladetemperaturen inden for få minutter. Vores metode giver således mulighed for effektiv og hurtig identifikation af nye molekyler, der regulerer stomatal blænde.
Introduction
Stresstolerance i planter er et polygent træk påvirket af en række molekylære, cellulære, udviklingsmæssige og fysiologiske egenskaber og mekanismer1. Planter i et svingende miljø skal løbende modulere deres stomatale bevægelser for at afbalancere den fotosyntetiske efterspørgsel efter kulstof og samtidig opretholde tilstrækkeligt vand og forhindre patoogen invasion2; De mekanismer, hvorved disse "afgørelser" træffes, forstås imidlertid dårligt3. Indførelse af bioaktive molekyler i planter kan modulere deres fysiologi og hjælpe med at sondere nye reguleringsmekanismer.
Den omfattende screening af små molekyler er en effektiv strategi, der anvendes i anti-cancer lægemiddel opdagelse og farmakologiske analyser til at teste de fysiologiske virkninger af hundreder til tusinder af molekyler i en kort periode4,5. I plantebiologi har høj gennemløbsscreening vist sin effektivitet,f.eks. Siden da, agonister og antagonister af ABA receptorer, og små molekyler i stand til at modulere udtrykket af ABA-inducible reporter gener er blevet identificeret9,10,11,12,13,14,15. High-throughput screening tilgange i øjeblikket til rådighed til at identificere små forbindelser, der kan modulere stomatal blænde har nogle ulemper: i) protokoller kredser omkring ABA signalering vej kan forhindre identifikation af nye ABA-uafhængige mekanismer, og (ii) in vivo strategier, der anvendes til identifikation af bioaktive små molekyler er primært afhængige af deres fysiologiske virkninger på frøspiring eller kimdannelse vækst, og ikke på regulering af plante transpiration i sig selv.
Derudover, mens der er mange måder at behandle planter med bioaktive molekyler, de fleste af dem er ikke velegnet til en storstilet undersøgelse af stomatal bevægelse. Kort, de tre mest almindelige teknikker er bladanvendelse ved sprøjtning eller dypning, behandling af rodsystemet, og rodkunstvanding. Bladapplikation er ikke kompatibel med de mest almindelige og hurtige metoder til måling af stomatblænde, da tilstedeværelsen af dråber på bladoverfladen forstyrrer storstilet dataindsamling. De vigtigste begrænsninger af rodvanding er de store prøve volumen krav, den potentielle fastholdelse af forbindelser af elementer i rhizosfæren, og afhængigheden af aktiv rodoptagelse.
Her præsenterer vi en storstilet metode til at identificere nye forbindelser, der regulerer plantetranspiration, og som ikke nødvendigvis involverer ABA- eller kendte tørkereaktionsmekanismer og giver mulighed for effektiv og pålidelig behandling af planter. I dette system behandles Helianthus annuusplanter ved hjælp af en rodfodringsmetode, der består i at skære den primære rod af planter dyrket hydroponically og dyppe afskæringsstedet i prøveopløsningen. Når de er behandlet, måles effekten af hvert stof på planternes transpiration ved hjælp af et infrarødt termisk billedkamera. Da en vigtig faktor for bladoverfladetemperatur er fordampningshastigheden fra bladet, kan termiske billeddata være direkte korreleret med stomatal ledningsevne. Den relative ændring i bladtemperaturen efter kemisk behandling giver således direkte mulighed for at kvantificere plantens transpiration.
H. annuus er en af de fem største oliefrø afgrøder i verden16 og opdagelser foretaget direkte på denne plante kan lette fremtidige overførsler af teknologi. Desuden har H. annuus planter store og flade cotyledons, samt en tyk primær rod, som var ideel til udviklingen af denne protokol. Men, denne metode kan let tilpasses til andre planter og en række forbindelser.
Denne protokol kan bruges til effektivt at identificere molekyler, der kan udløse stomatal lukning eller fremme stomatal åbning, hvilket har store konsekvenser for forståelsen af de signaler, der regulerer stomatal ledningsevne og plantetilpasning til miljømæssige Understreger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dyrkning af planter
- Tilføj et 4 cm tykt lag fin vermiculit til standard 10 tommer x 20 tommer (254 mm x 501 mm) plantebakker uden huller.
- Sæt frøholdere (se Tabel over materialer)2 cm fra hinanden i plantebakkerne.
- Fyld frøholdere med vermiculit.
- Placer en solsikkefrø med sin spidse ende ned i hver frø holder, skubbe ned, så halvdelen af frøet forbliver udsat.
BEMÆRK: Et solsikkefrø er asymmetrisk, og den spidse ende, hvorfra radiklen vil opstå, bør pege nedad. Korrekt frø placering er vigtig, da omlægning af rod og stilk ikke er muligt i frø indehavere. Den afrundede ende af frøet skal strække sig forbi toppen af frøholderen. - Når frøene er på plads, dække dem med en ekstra 2 cm tykt lag af fine vermiculit. Vand ved dug ovenfra. Overfladen skal forblive våd efter en time. Hvis det er tilfældet, skal bakkerne dækkes med låg.
- Dyrk planter i et vækstkammer eller et drivhus. Anbefalede forhold er en lysintensitet på 140 μmol fotoner·m-2·s-1 og en fotoperiode på 16 h lys ved 22 °C og 9 h mørk ved 20 °C i 5 dage.
BEMÆRK: Vanding bør ikke være nødvendig, medmindre overfladen bliver synligt tør.
2. Opsætning af det hydroponiske system
- Find en passende størrelse beholder egnet til dyrkning af planter hydroponically. Beholderens størrelse skal tilpasses den plads, der er til rådighed i vækstkammeret eller drivhuset. En minimal dybde på 15 cm anbefales.
- Fyld beholderen med destilleret vand og tilsæt generel hydroponics gødning som angivet af producenten. Den resulterende hydroponiske opløsning skal luftes og i konstant bevægelse, hvilket kan opnås ved hjælp af luft- og vandpumper.
- Forbered hydroponics flydere.
- Skær et ark med 2 cm tykt ekspanderet polystyrenskum (se Materialetabel)til beholderens dimensioner. Arket skal dække det meste af beholderens overflade for at begrænse væksten af alger. Et træbrændende værktøj er effektivt til at skære polystyrenskum og er alsidigt nok til denne protokol.
FORSIGTIG: Dampe eller dampe, der frigives under varm skæring af polystyrenskum, er alvorlige sundhedsfarer. Brug korrekt åndedrætsværn. Brugerne kan også opfylde ventilationskravene ved at skære skummet under en røghætte. - Lav huller (1-2 cm i diameter) i polystyrenskumarket ved hjælp af et brændeværktøj. Afstanden mellem centrene af to huller kan tilpasses eksperimentets behov. Det anbefales dog at have en minimal afstand på 2,5 cm.
- Skær et ark med 2 cm tykt ekspanderet polystyrenskum (se Materialetabel)til beholderens dimensioner. Arket skal dække det meste af beholderens overflade for at begrænse væksten af alger. Et træbrændende værktøj er effektivt til at skære polystyrenskum og er alsidigt nok til denne protokol.
3. Overførsel af planter til hydroponics og plantevækst
- Træk forsigtigt 5-dages gamle planter ud af vermiculitten, og overfør straks til en beholder fyldt med vand i 30 minutter. Dette trin vil fjerne overskydende vermiculit og blødgøre de resterende pericarps. Den nye primære rod skal være synlig.
- Fjern pericarp vægge i hånden, hvis det er nødvendigt for at optimere den fremtidige udvidelse af cotyledons.
- Overfør kimplanter i frøholdere til polystyrenskumflyderen. Planterne dyrkes med en lysintensitet på 140 μmolfotoner·m-2·s-1, en relativ luftfugtighed på 65 % og en fotoperiode på 16 timer lys ved 22 °C og 9 h mørk ved 20 °C i 2 dage.
4. Præparat før behandling
BEMÆRK: Denne procedure er til test af 20 kemikalier fra et lille sammensat bibliotek i treeksemplarer, med 100 μM ABA i 10 mM MES-KOH (pH = 6,2) og 10 mM MES-KOH (pH = 6,2), der indeholder henholdsvis 1% (v/v) dimethylsulfoxid (DMSO) som positive og negative kontroller.
- Sørg for, at der er nok planter klar til behandling. Planter klar til behandling bør være modne nok til at have fuldt udfoldet cotyledons, men unge nok, at lateral rod spredning er minimal. For at gøre en standard screening, 69 sådanne planter er nødvendige.
- 96-brøndspladen, der indeholder de små forbindelser, fjernes fra fryseren -80 °C. Tø ved stuetemperatur.
- Forbered 80 ml 10 mM MES-KOH buffer justeret til en pH-pc på 6,2 med 1 M KOH.
- Label cap-mindre 2 ml mikrorør. Der fremstilles mindst seks rør til den negative kontrolbehandling (10 mM MES-KOH (pH = 6,2), der indeholder 1 % (v/v) DMSO). Brug tre rør til ABA-behandling (100 μM ABA i 10 mM MES-KOH pH = 6.2), positiv kontrol). Brug de resterende 60 rør til at analysere effekten af de 20 kemikalier i treeksemplarer.
- 10 μL af hvert kemikalie (10 mM i DMSO) overføres til hvert af de tre korrekt mærkede rør. Pipet 10 μL 10 mM ABA opløst i DMSO i tre rør og 10 μL DMSO i de seks kontrolrør.
FORSIGTIG: Af natur kan nogle forbindelser forårsage alvorlige sundhedsmæssige virkninger, og brugerne skal træffe passende beskyttelsesforanstaltninger. - Der tilsættes 990 μL 10 mM MES-KOH (pH = 6.2) til hvert af de 69 rør. Dispenser MES-bufferen med tilstrækkelig kraft til at blande kemikaliet med MES-bufferen, men pas meget på ikke at bruge så meget kraft, at kemikalierne og MES-bufferen sprøjter ud af røret. Alternativt vortex ved lav hastighed.
5. Konfigurer det termiske billedkamera
- Monter det termiske billedkamera på en kopiholder. Tilslut alle kabler til en bærbar computer.
BEMÆRK: Optagelsen sker under temperaturforhold (20 °C til 25 °C), fugtighed (50% til 70%) og lyskvalitet (110 til 140 μmol fotoner·m-2·s-1)svarende til dem, der anvendes til at dyrke planterne. - Tænd kameraet derefter den bærbare computer og åbne den termiske billeddannelse analyse software.
BEMÆRK: De efterfølgende instruktioner til optagelse gælder for en bestemt software, der anvendes (se Tabel over materialer). - Juster optagelsesindstillingerne.
- Musen over den røde knap på posten øverst i det centrale vindue. Der vises en rullemenu. Klik på skruenøgleikonet Optagindstillinger.
- Vælg den relevante posttilstand og de relevante indstillinger. Posten med jævne mellemrum, med en ramme hentet i minuttet og et manuelt stop kunne bruges. Bemærk den fildestination, hvor softwaren gemmer videoen. Luk vinduet Postindstillinger.
6. Planteforberedelse og -behandling
- Placer de cap-less rør, der indeholder kemikalierne i rørrister. Alternativt kan en polystyren skum ark skæres og stak med en brændeværktøj som beskrevet i trin 2,3 for at gøre en brugerdefineret rør rack. Diameteren af hvert hul skal være meget tæt på den udvendige diameter af de capless rør for at holde dem fast.
BEMÆRK: Kameraets synsfelt er en begrænsende faktor, der bør tages i betragtning, når der træffes beslutning om, hvordan de cap-less rør vil blive holdt på plads. - Fordel jævnt de positive og negative kontrolrør samt de eksperimentelle rør i stativerne for at tage højde for positionsrelateret bias17.
- Forbered følgende materialer ved siden af de planter, der dyrkes hydroponically: mikrodædisaks, en lavvandet skål med vand, sarte opgavekluder, de 69 cap-less rør, der indeholder de forskellige kemikalier.
- Gentag følgende trin for hver plante, der skal behandles. Solsikkespiren forbliver altid i frøholderen.
- Løft forsigtigt frøholderen og dypper hurtigt roden i den lavvandede skål, der indeholder vand.
- Skær den primære rod under vandet for at forhindre kavitation. Snittet skal forekomme 0,8-1 cm under frøholderens mest basale ende.
- Indstil den nyskårne plante i et af rørene, der indeholder kemikalierne.
- Hvis der er nogen dråber vand på cotyledons, forsigtigt duppe dem tørre med en delikat opgave tørre.
BEMÆRK: Disse fire trin skal udføres så hurtigt som muligt (10 min eller mindre) for at forhindre uoverensstemmelser i kinetik undersøgelsen.
- Flyt planterne under det termiske billedkamera, og sørg for, at alle planter er inden for kameraets synsfelt. Juster kamerahøjde og stativerposition efter behov.
7. Optagelse
- Fokuser kameraet på overfladen af cotyledons ved at trykke på Ctrl + Alt + A.
- Musen over den røde knap og klik på indstillingen Optag en film. Et nyt vindue, der bekræfter optagelsen, skal åbnes.
- Stop optagelsen 1-2 timer senere.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
8. Dataindsamling
- Gå til Fil | Åben | Søg efter den korrekte . SEQ-fil og åbne den.
- Hold op med at spille filmen.
- Klik på tilføj et ikon for investeringsafkastet af målemarkøren (3x3 pixel) i venstre side af hovedvinduet. ROI står for Interesseregion.
- Musen over midten af en cotyledon af den første plante og venstre-klik én gang. Markøren 1 er nu på plads. Mærk den anden cotyledon af det første anlæg ved at gentage proceduren. Rækkefølgen af etiketterne skal bemærkes.
- Gentag proceduren. Alle planter skal mærkes med to markører.
- Klik på ikonet Rediger roi'er. I hovedvinduet skal du venstre klikke og holde på øverste venstre hjørne og rulle til nederste højre hjørne for at vælge alle roi'er.
- Hold musen over ikonet Statistikfremviser, og vælg Tidsmæssigt plot. Et nyt vindue åbnes.
- Kør filmen. En graf udfyldes med dataene.
- I dette vindue skal du klikke på dobbeltpilen i øverste højre hjørne for at åbne en ny menu.
- Klik på ikonet Gem. Gem som X- og Y-værdier i plottet (.csv). Luk softwaren, når data er blevet eksporteret.
9. Dataanalyse
- Åbn .csv-filen ved hjælp af en dataanalysesoftware (f.eks. Bemærk, at de tre første kolonner (A til C) indeholder oplysninger om rammenummeret, det absolutte tidspunkt og det relative klokkeslæt. De resterende kolonner giver temperaturen på hvert investeringsafkast over tid.
- Træffe beslutning om arten af det statistiske værktøj, der skal anvendes denne beslutning afhænger af forskellige faktorer, herunder forsøgsudformningen.
BEMÆRK: I vores eksempel beregnes en standardscore eller z-score for hver prøve baseret på populationsgennemsnit og populationsstandardafvigelse. For hver prøve beregnes en p-værdi derefter ud fra z-scoren. Denne metode gør det muligt at bekræfte de positive og negative kontroller samt identifikation af nye forbindelser, der skal testes yderligere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et forsøg med det røde farvestof Erythrosine B (0,8 kDa) viser kemikaliernes evne til synligt at blive absorberet gennem en skærerod i cotyledons af en solsikkekimplante inden for 10 minutter (figur 1).
Når planter behandles med ABA, påvises en stigning i bladtemperaturen i solsikkekotyledoner inden for få minutter. Denne stigning i bladtemperaturen er forbundet med et fald i stomatal blænde og stomatal ledningsevne. Forhøjet bladtemperatur observeres 15 min efter behandling med 10 μM ABA (p-værdi = 0,02) og 20 min med 5 μM ABA (p-værdi = 0,003) (figur 2). Samlet set viser disse resultater, at målinger af bladtemperatur ved termisk billeddannelse er en god proxy til måling af stomatal blænde og ledningsevne.
Figur 3 viser et proof of concept-forsøg med en delmængde på 20 kemikalier fra NatProd Collection med positiv (100 μM ABA) og negative kontroller. I dette repræsentative eksperiment muliggør en standardscorebaseret statistisk behandling identifikation af kemikalier, der fremmer stomatlukning, eller, mens analysen bør optimeres til dette specifikke formål, kemikalier, der fremmer stomatal åbning. I det givne eksempel giver en varmekortvisualisering af standardscorerne mulighed for hurtig identifikation af kemikalier #02 og #16 som potentielle kandidater.
Figur 4 opsummerer arbejdsgangens vigtige trin.
Figur 1: Effektiviteten af den afskårne rodfodringsmetode. (A) En sætteplante, der tilføres 1 time med Erythrosine B i 10 mM MES-KOH (pH = 6.2), er synligt rød (højre billede) sammenlignet med kontrolelementet (venstre billede). Billederne blev taget efter snittet rod fodring efterfulgt af en overnatning inkubation i absolut ethanol for at fjerne de naturlige plante pigmenter. Bar = 10 mm. (B) Ophobning af Erythrosine B i kotyledoner over tid. Erythrosine B kan påvises ved spektrofotometri i planteekstrakter fra cotyledons 8 min (p-værdi = 0,032) efter overførsel af skære-root solsikke planter til farvestoffet. Fejllinjer angiver SEM. * angiver p-værdi < 0,05 (n = 3). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Relationer mellem bladtemperatur, stomatblænde og ledningsevne for at vise følsomheden af det eksperimentelle design. A) Repræsentativt billede, der viser forskelle i bladtemperatur mellem 100 μM ABA-behandlet (+ABA) og ikke-behandlede (kontrol) solsikkeplanter efter 30 min visualiseret ved termisk billeddannelse. (B) Venstre: Planter behandlet med 100 μM ABA i 30 min viser en forhøjet temperatur i forhold til kontrolanlæg (* angiver p-værdi < 0,01), n = 3). Højre: målinger af stomatal blænde på epidermal skræl fra de samme planter viser et fald i stomatal blænde (bredde / længde) (* angiver p-værdi < 0,01, n = 3, antallet af stomata per plante ≈ 162). (C) Bladledningmålt med et bladporometer og kombineret med bladtemperaturmålinger viser, at der er en stærk korrelation (Pearsons koefficient = -0,89, n = 6) mellem bladoverfladetemperatur og stomatadfærd. Planter behandlet med 100 μM ABA i 30 min. viser en øget temperatur og nedsat ledningsevne sammenlignet med kontrolanlæg (n = 6). (D) Dosisresponsundersøgelse viser nedsat bladtemperatur i planter, der er behandlet med ABA-koncentrationer, helt ned til 5 μM efter 20 min behandling (p-værdi = 0,0037, n = 3). Fejllinjer angiver SEM. Klik her for at få vist en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative resultater fra screening af 20 kemiske forbindelser. (A) Heatmap af Z-scores afspejler plante responser på 20 forbindelser testet i treeksemplarer. Mørkerød og mørkeblå angiver konfidensniveau på >99% for stomatal lukning og åbning. Seks anlæg blev behandlet med DMSO (kontrol), tre blev behandlet med 100 μM ABA, og andre anlæg blev behandlet med 100 μM kemisk e.M. i treeksemplarer. Planter, der reagerer på sammensatte 16 (C#16), viser en stomatlukning svarende til den, der er observeret i ABA-behandlede planter. To planter ud af tre behandlet med sammensatte 02 (C # 02) viser en betydelig stigning i stomatal åbning. B) Kinetik af planternes reaktion på forbindelser 02 og 16. Gennemsnitlige temperaturændringer over tid vises for planter, der reagerer på kontrolbehandling (n = 6), 100 μM ABA (n = 3) eller 100 μM for hver forbindelse (n = 3). Fejllinjer indikerer SEM. Temperaturændringer er konsekvent statistisk signifikante efter 10 min ABA-behandling (p-værdi = 0,026, n = 3), 15 min behandling med C#16 (p-værdi = 0,030, n = 3) og 71 min C#02 (p-værdi = 0,044, n = 3) sammenlignet med kontrol. Udsving deles af alle prøverne er baggrundsstøj på grund af den dynamiske kontrol af omgivelsestemperaturen i vækstkammeret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Oversigt over screeningsarbejdsgangen. Bemærk, at billederne repræsenterer vigtige trin og er uafhængige af hinanden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Antallet af forbindelser, der kan testes på en given dag, afhænger for det meste af (i) den miljøkontrollerede plads, der er til rådighed til at dyrke planterne og udføre skærmen, samt (ii) antallet af personer, der kan være involveret i trin 6 i protokollen. Vi anbefaler brug af tre eksperimentelle replikater til at konsolidere fortolkningen af resultaterne efter statistisk behandling. I en typisk dag, en til to personer kan screene 60 forbindelser i treeksemplarer uden problemer ved at teste for eksempel [60 kemikalier + 6 negative (DMSO) kontrol + 3 positive (ABA) kontrol] om morgenen, middag og eftermiddag.
Denne metode er afhængig af sunde planter med fuldt udviklede cotyledons. Da billedbilledet sker ovenfra, bør en ideel sætteplante vise en vinkel på 90° mellem hypokotylen og den cotyledonære klinge for at indsamle så mange oplysninger som muligt. Denne vinkel er hovedsageligt reguleret af lys og bør derfor optimeres ved at justere vækstbetingelserne. Vores resultater viser, at det tager omkring 10 minutter for et kemikalie at nå cotyledons og et par minutter mere til at reagere på et kemikalie som ABA. Denne observation gør trin 6.4 til det mest tidsfølsomme trin i protokollen. Det er derfor afgørende at behandle alle planterne i en given analyse på mindre end 15 minutter for at undgå uoverensstemmelser mellem plantesvarene. Blandt de eksterne faktorer, der passivt påvirker bladtemperaturmålinger, vil ventilation sandsynligvis indføre positionsrelaterede skævheder eller signifikant variation blandt replikater. Brugerne bør udvise forsigtighed ved at kontrollere ventilationsstrømme og begrænse positionsrelaterede skævheder ved tilfældigt at distribuere prøverne, før de optages. For at tage højde for andre potentielle faktorer bør registreringen foretages under samme temperatur, fugtighed og lysforhold som dem, der anvendes til at dyrke planterne, da eventuelle ændringer i disse forhold kan påvirke stomatalukning og/eller bladtemperatur. Endelig bør en forbindelse, der er i stand til at modulere stomatal lukning, vurderes for dens toksicitet. Dette gælder især, hvis forbindelsen udløser stomatal lukning, da det er kendt for at være en indirekte konsekvens af intens stress opleves af anlægget.
Ved at tilvejebringe en effektiv leveringsmetode for bioaktive molekyler og en metode til direkte at måle plantetranspiration, behandler denne protokol nogle af de ulemper, der er forbundet med de nuværende screeningsmetoder, som nævnt i indledningen. Vores protokol er ikke eksklusiv til solsikkeplanter og kan anvendes på de fleste diktoter med en hypocotyl til cotyledon vinkel på 90 °. Termisk billeddannelse af Arabidopsis cotyledons er effektiv18,19 og vores protokol kunne derfor tilpasses til planter med tilsvarende små cotyledons. Desuden kan klorofylfluorescensbilleddannelse anvendes til at måle fotosyntetisk ydeevne i kombination. Mens mindre tidseffektive, målinger af transpirationsdrevet ophobning i cotyledons af Erythrosine B tilsættes til hvert kemikalie potentielt kunne anvendes til at vurdere transpiration satser, hvis en termisk billeddannelse kamera ikke er tilgængelig. I alt evaluerer denne storstilede screeningsmetode effektivt plantebladrespons på bioaktive molekyler og kan let tilpasses en række forskellige anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Arbejdet blev støttet af Pomona College Start-up fonde og Hirsch Research Indledning Grants Fund (til FJ) samt Pomona College Molekylær Biology Program gennem Stellar Summer Research Assistant Program (til KG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
References
- Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. Plant adaptation to drought stress. F1000Research. 5, (2016).
- McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).
- Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. Revisiting the Plant's Dilemma. Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries. Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).
- Park, S. Y., et al. Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
- Ma, Y., et al. Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).
- Cao, M., et al. An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants. Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).
- Okamoto, M., et al. Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).
- Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors. Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).
- Kim, T. H., et al. Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway. Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).
- Ito, T., et al. Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening. ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).
- Ye, Y., et al. A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors. Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).
- Takeuchi, J., et al. Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions. Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).
- Rauf, S., et al. Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value. Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).
- Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).
- Merlot, S., et al. Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).
