Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Evaluatie van cerebrale bloedstroom autoregulatie in de rat met behulp van laser doppler flowmetrie

Published: January 19, 2020 doi: 10.3791/60540
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin
* These authors contributed equally

Summary

Dit artikel demonstreert het gebruik van laser doppler flowmetrie om te evalueren van het vermogen van de cerebrale circulatie te autoreguleren de bloedtoevoer tijdens verlagingen van de arteriële bloeddruk.

Abstract

Bij het onderzoeken van de mechanismen van het lichaam voor het reguleren van cerebrale doorbloeding, een relatieve meting van de micro circulatoire bloedstroom kan worden verkregen met behulp van laser doppler flowmetrie (LDF). Deze paper toont een gesloten schedel preparaat dat het mogelijk maakt cerebrale bloedtoevoer te beoordelen zonder de schedel door te dringen of een kamer of cerebrale venster te installeren. Om autoregulatory mechanismen te evalueren, kan een model van gecontroleerde bloeddruk reductie via gegradeerde bloeding worden gebruikt, terwijl tegelijkertijd gebruik wordt maken van LDF. Dit maakt de real time tracking van de relatieve veranderingen in de bloedstroom in reactie op verlagingen van de arteriële bloeddruk geproduceerd door de terugtrekking van Circulerend bloed volume. Dit paradigma is een waardevolle benadering voor het bestuderen van cerebrale bloedstroom autoregulatie tijdens verlagingen van de arteriële bloeddruk en, met kleine wijzigingen in het Protocol, is ook waardevol als een experimenteel model van hemorragische shock. Naast het evalueren van autoregulatoire responsen, kan LDF worden gebruikt om de corticale bloedstroom te monitoren bij het onderzoeken van metabole, myogene, endotheel-, humorele of neurale mechanismen die de cerebrale doorbloeding reguleren en de impact van verschillende experimentele interventies en pathologische condities op cerebrale doorbloeding.

Introduction

Autoregulatory mechanismen in de cerebrale circulatie spelen een cruciale rol bij het handhaven van de homeostase en de normale functie in de hersenen. Autoregulatie van de cerebrale doorbloeding wordt beïnvloed door meerdere factoren, waaronder hartslag, bloed snelheid, perfusiedruk, de diameter van de cerebrale resistentie slagaders en de microcirculatoire weerstand, die allemaal een rol spelen bij het handhaven van de totale cerebrale bloedstroom constante in de hersenen over het fysiologische bereik van systemische bloeddruk. Wanneer de arteriële druk toeneemt, deze mechanismen constrikte arteriolen en weerstand aders om te voorkomen dat gevaarlijke stijgingen van de intracraniële druk. Wanneer arteriële bloeddruk afneemt, lokale controlemechanismen verwijden de arteriolen te handhaven weefsel perfusie en O2 levering. Verschillende pathologische aandoeningen zoals hypercapnia, traumatisch of globaal hypoxisch hersenletsel, en diabetische microangiopathie1,2,3,4,5,6 kunnen het vermogen van de hersenen om de bloedstroom te autoregeren verstoren. Chronische hypertensie verschuift bijvoorbeeld het effectieve autoregulatoire bereik naar hogere druk7,8,9, en een hoog zout (HS) dieet interfereert niet alleen met normale endotheel-afhankelijke verwijding in de cerebrale microcirculatie10, maar ook het vermogen van autoregulatory mechanismen in de cerebrale circulatie te verwijden en handhaven weefsel perfusie wanneer de arteriële druk wordt verlaagd11. Cerebrale autoregulatie is ook aangetast bij Dahl-zoutgevoelige ratten wanneer ze een HS-dieet12hebben gevoed.

Tijdens verlagingen van de arteriële druk, verwijding van de cerebrale resistentie slagaders en arteriolen in eerste instantie retourneert cerebrale doorbloeding om waarden te beheersen ondanks de verminderde perfusiedruk. Naarmate de arteriële druk verder wordt verlaagd, blijft de cerebrale bloedstroom constant bij de lagere druk (plateaufase van de autoregulatoire respons) totdat de vasculatuur niet langer kan verwijden om de bloedstroom bij de lagere druk te handhaven. De laagste druk waarbij een orgaan de normale bloedtoevoer kan aanhouden, wordt de ondergrens van de autoregulatie (LLA) genoemd. Bij druk onder de LLA daalt de cerebrale bloedstroom aanzienlijk van de rust waarden en neemt deze af op een lineaire manier met elke reductie in arteriële perfusiedruk13,14. Een opwaartse verschuiving in de LLA, zoals waargenomen in hypertensie7,8,9, kan het risico en de ernst van ischemische letsel verhogen tijdens omstandigheden waar de arteriële perfusiedruk wordt verminderd (bijv. myocardinfarct, ischemische beroerte, of bloedsomloop shock).

Ldf heeft bewezen een uiterst waardevolle benadering te zijn om de bloedtoevoer in de microcirculatie onder verschillende omstandigheden te evalueren, waaronder autoregulatie van de bloedstroom in de cerebrale circulatie11,14,15. Naast het evalueren van autoregulatoire reacties, kan ldf worden gebruikt om de corticale bloedstroom te bewaken bij het onderzoeken van metabole, myogene, endotheel-, humorele of neurale mechanismen die de cerebrale doorbloeding reguleren en de impact van verschillende experimentele interventies en pathologische aandoeningen op de cerebrale bloedstroom10,16,17,18,19,20,21

LDF meet de verschuiving in gereflecteerde laserlicht in reactie op het aantal en de snelheid van bewegende deeltjes--in dit geval, rode bloedcellen (RBC). Voor studies van cerebrale vasculaire autoregulatie, arteriële bloeddruk wordt veranderd hetzij door de infusie van een alpha-adrenergic agonist te verhogen arteriële druk (omdat de cerebrale circulatie zelf is ongevoelig voor alpha-adrenergic vasoconstrictor agonisten)12,15 of via gecontroleerde bloed volume terugtrekking te verminderen van arteriële druk11,14. In de huidige studie wordt LDF gebruikt om de effecten van beoordeelde verlagingen van de bloeddruk op cerebrale autoregulatie in een gezonde rat aan te tonen. Hoewel open en gesloten schedel methoden zijn beschreven in de literatuur22,23,24,25, het huidige papier toont een gesloten schedel voorbereiding, waardoor cerebrale bloedtoevoer kan worden beoordeeld zonder het binnendringen van de schedel of het installeren van een kamer of cerebrale venster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het medisch college van Wisconsin institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) keurde alle in dit document beschreven protocollen goed en alle procedures zijn in overeenstemming met de National Institutes of Health (NIH) Bureau voor laboratoriumdieren welzijn (OLAW) Regelgeving.

1. proefdieren en voorbereiding op de opname

  1. Gebruik 8 – 12 weken oude mannelijke Sprague-Dawley ratten met een gewicht van 250 – 300 g. Voor deze experimenten, voeden ratten een standaard dieet bestaande uit 0,4% NaCl, 200 g/kg caseïne, 3 g/kg DL-methionine, 497,77 g/kg sucrose, 150 g/kg maïzena, 50 g/kg maïsolie, 50 g/kg cellulose, 2 g/kg choline Bitartrat, 35 g/kg minerale mix, en 10 g/kg vitamine mengsel.
  2. Record arteriële bloeddruk en LDF lezingen met behulp van Data Acquisition software of een vergelijkbare opnamemethode.
  3. Bevestig de arteriële druk transducer aan één kanaal van het opnamesysteem en de LDF-sonde aan het andere kanaal op het opnamesysteem.
  4. Kalibreer vóór de meting de laser Doppler-sonde om een motiliteits standaard in te stellen en zorg ervoor dat de laser Doppler-flowmeter een stabiele uitgang levert.
  5. Bereid extra apparatuur voor de voorbereidende operatie en voor het experiment: een ontleed Microscoop, een knaagdier ventilator, een einde Tidal CO2 monitor, een stereotaxic instrument om het hoofd van de rat in positie vast te stellen, en een micro manipulator om de ldf sonde over de Piale microcirculatie te lokaliseren en te onderhouden in een stabiele positie.

2. chirurgische voorbereiding

  1. Weeg de rat en anesthetiseer het dier in een inductie kamer met 3,5% Isofluraan en 30% O2 supplement.
  2. Verwijder het dier uit de inductie kamer en vervang een verdovings masker door 1,5 – 3% Isofluraan te leveren met een supplement van 30% O2 .
  3. Plaats de rat op een circulerende water deken die op 37 °C wordt gehouden en controleer de reflexen met een teen pinch om ervoor te zorgen dat er een opname reflex is. Breng steriele oogzalf aan op beide ogen ter voorkoming van corneale uitdroging.
  4. Scheer de bovenkant van de cranium, het ventrale nekgedeelte en de femorale driehoeken. Verwijder los haar uit die gebieden en reinig met alcohol.
  5. Plaats de rat in een liggende positie op een verwarmingskussen met een circulerende warm waterpomp om de lichaamstemperatuur van het dier bij 37 °C te behouden en het tijdelijk aan de pad te beveiligen met behulp van medische tape.
  6. Installeer een tracheale canule (PE240 polyethyleen slang) door middel van een ventrale incisie in de nek zoals elders beschreven26.
  7. Bevestig de tracheale canule aan een end Tidal co2 -monitor en de ventilator levert 2,5 – 3,0% Isofluraan (afhankelijk van de grootte van het dier) en een inhalatie supplement van 30% O2 . Zorg ervoor dat de ademhalingsfrequentie, de Inspiratoire tijd en het minuten ventilatorvolume worden ingesteld en bewaakt om een vervallen einde Tidal CO2 van ongeveer 35 mmHg gedurende het experiment te garanderen.
    Opmerking: dit wordt meestal bereikt met een ademhalingsfrequentie van ongeveer 48 – 60 ademhalingen/min, een getijden volume van 1.70 – 2,30 mL, en een inspiratie tijd van 0,50 – 0.60 s voor een 250 – 300 g rat.
  8. Vul twee PE50 polyethyleen canules met 1 U/mL heparine in isotone NaCl-oplossing om stolling te voorkomen en de doorgankelijkheid van de katheters te behouden. Na het vullen, schuine kant het open uiteinde van elke canule met chirurgische schaar om te vergemakkelijken inbrengen in de slagader.
  9. Cannulaat de rechter en linker femorale slagaders zoals elders beschreven27 om continue controle van arteriële druk in een katheter en bloed terugtrekking uit de andere katheter.
    1. Na zorgvuldige scheiding van de slagaders van het omringende weefsel onder een ontleed Microscoop, ligate het distale uiteinde van de slagader en plaats twee extra hechtingen rond het midden en proximale uiteinden van de slagader zonder aanscherping van de knopen.
    2. Gebruik de proximale hechtdraad als een hijs ligatuur ter voorkoming van bloeden uit de slagader na de incisie voor canule inbrengen (stap 2,11).
  10. Plaats een V-vormige draad van een paperclip onder de slagader om het vat te occluelen totdat de canule is vastgezet.
  11. Onder een ontleed Microscoop maken een kleine incisie in de dijader in de buurt van de distale ligatie met Vannas schaar. Steek het schuine uiteinde van de canule in de incisie en breng het in de femorale slagader. Draai de knoop op de middelste ligatuur vast om de canule op zijn plaats te zetten, zodat deze niet wordt losgedaan door arteriële druk wanneer de hijs ligatuur of paperclip wordt verwijderd.
  12. Nadat de middelste ligatuur is vastgezet, laat u de spanning op de hijs ligatuur los en/of verwijdert u de paperclip en maakt u de proximale ligatuur vast.
  13. Sluit de incisie met fijne hechtingen (3 – 0 zijde) of een chirurgische nietje. U ook een vochtig gaas over de incisieplaats, afhankelijk van de grootte van de incisie.

3. schedel verdunnen voor LDF metingen

  1. Onmiddellijk na de canules zijn op zijn plaats, plaats het dier in een borstbeen positie en bevestig het hoofd in een stereotaxic apparaat, oppassen niet te Verdoe-de katheters of tracheale buis.
  2. Gebruik een chirurgische schaar om een elliptische incisie in de huid te maken die het cranium bedekt. Gebruik een wattenstaafje om bindweefsel te verwijderen, zodat de cranium schoon en droog is. Plaats een klein langwerpig en gerold stukje weefsel papier rond de incisie op de hoofdhuid om eventuele bloedingen te stoppen.
  3. Onder de ontleed Microscoop, gebruik een Dremel gereedschap of een tandheelkundige boor met een 2,15 mm boor te dun een klein gebied van bot (ongeveer 0,5 – 1 cm afhankelijk van de grootte van de rat) in het pariëtale gebied over de linker of rechter Somatosensorische cortex.
    VOORZICHTIG: dun het bot langzaam en zorgvuldig om te voorkomen dat de schedel binnendringen. Tijdens het uitvoeren van deze stap moet zoutoplossing royaal worden toegepast om te voorkomen dat het gebied oververhit raakt.
  4. Zodra de schedel is verdund en het gebied heeft een roze verschijning en/of bloedvaten worden gevisualiseerd, bedek het gebied met minerale olie en gebruik een micro manipulator om de laser Doppler-sonde over de blootgestelde cerebrale microcirculatie te positioneren, zodat de punt van de sonde gewoon de bovenkant van de pool van minerale olie raakt (Figuur 1).
    Opmerking: het is essentieel om LDF-metingen te nemen in een gebied waar geen externe trillingen zijn die de laser Doppler-metingen verstoren en dat de sonde gedurende het experiment veilig over hetzelfde doelgebied wordt bevestigd.

4. beoordeling cerebrale vasculaire autoregulatie

  1. Zodra de LDF-sonde in positie is bevestigd, u een equilibratie periode van 30 – 45 minuten voor aanvang van het experiment toestaan. Na de evenwichts periode, meet de gemiddelde arteriële druk (kaart) en laser cerebrale bloedstroom (LCBF) elke 30 s gedurende 2 minuten en gemiddelde de waarden voor het verkrijgen van de baselinewaarden voor de bloeddruk van de prehemorrhage en LCBF.
  2. Om de cerebrale vasculaire autoregulatie te evalueren als reactie op de vermindering van de arteriële druk, meet u de LCBF en de kaart na opeenvolgende opnames van 1,5 mL bloed uit de femorale slagader11. Om de katheter octrooi te houden, ervoor te zorgen dat een volume van heparine oplossing (100 U/mL in isotone Saline) ongeveer gelijk aan het volume van de katheter wordt toegediend na elk bloed gelijkspel.
    Opmerking: wanneer de heparine-oplossing wordt gebruikt om de katheter te handhaven, is het belangrijk om het volume van de heparine-oplossing zo dicht mogelijk bij het volume van de katheter aan te passen om te voorkomen dat het dier te veel heparine ontvangt, wat kan leiden tot ongewenste Bloeden.
  3. Na elk bloed volume terugtrekking, laat de rat te equilibraten 2 min, waarna de kaart en LCBF worden geregistreerd elke 30 s voor 2 min. Herhaal het bloed volume opnames totdat het dier een kaart van ongeveer 20 mmHg bereikt.
  4. Bepaal het effectieve autoregulatoire bereik door het bereik van de bloeddruk te identificeren van de kaart van de prehemorragie naar de LLA (stappen 4,5 en 5,3 hieronder).
  5. Bepaal de LLA door de laagste druk te identificeren waarbij lcbf nog steeds terugkeert naar binnen 20% van de waarde van de prehemorragie controle na bloed volume terugtrekking, zoals eerder beschreven11,28 of door het identificeren van het snijpunt van de regressie lijnen bepaald tijdens de plateaufase van autoregulatie en onder de LLA, waarbij lcbf afneemt bij elke opeenvolgende bloed terugtrekking (stap 5,3, hieronder).
    Opmerking: de criteria voor het definiëren van de LLA en autoregulatory plateau kunnen verschillen tussen laboratoria (bijvoorbeeld Takada et al.28 vs. Jones et al.29) evenals procedures voor het verminderen van arteriële bloeddruk (bv. intrekking van een specifiek volume bloed versus gecontroleerde bloeding om specifieke arteriële drukniveaus te bereiken)11.
  6. Aan het einde van het experiment, euthaniteren het dier door het creëren van een bilaterale pneumothorax terwijl onder een chirurgische vlak van anesthesie, zoals goedgekeurd door de IACUC.
  7. LDF-waarden die in het weefsel zijn verkregen nadat het dier is geëealiseerd, bieden de nulwaarde voor de uitgangsstroom voor de experimentele opstelling.

5. statistische analyse

  1. Voer een lineaire regressieanalyse uit om de correlatie tussen de LDF-waarden en de bijbehorende arteriële druk te evalueren. Gebruik de LDF-meetwaarden die zijn verkregen nadat het dier is geëerd om ervoor te zorgen dat er geen niet-specifiek LDF-signaal is dat de gemeten stroomsnelheden beïnvloedt.
  2. Bereken de LLA met behulp van de kruising tussen de regressie lijnen boven en onder het autoregulatory plateau. Om de LLA met deze methode te berekenen, combineert u de twee regressie vergelijkingen en lost u de resulterende vergelijking op voor arteriële druk.
  3. Bij het vergelijken van verschillende experimentele groepen, gebruik lineaire regressieanalyse om de hellingen van de LDF vs. arteriële druk relatie boven en onder de LLA voor elk dier te berekenen en vat ze samen als gemiddelde ± SEM voor de dieren in die experimentele groep.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 2 geeft een overzicht van de resultaten van experimenten uitgevoerd in 10 mannelijke Sprague-Dawley ratten gevoed standaard laboratorium Chow. In die experimenten werd het gemiddelde LCBF gehandhaafd binnen 20% van de waarde van de prehemorragie na de eerste drie bloed volume-opnames, totdat de gemiddelde arteriële druk de LLA bereikte. Daaropvolgende bloed volume opnames onder druk onder de LLA veroorzaakte een progressieve reductie van LCBF, waaruit bleek dat de cerebrale circulatie niet meer in staat was om een voldoende vasodilatatie te produceren om de cerebrale bloedstroom constante bij de lagere perfusiedruk te handhaven.

Figuur 3 geeft een overzicht van de relatie tussen de gemiddelde arteriële druk en lcbf in de plateaufase (kaart ≫ 65 mmHg) en de decompenserende fase (kaart ≪ 65 mmHg) van de CBF-autoregulatie. Bij een druk op of boven de LLA was er geen significante correlatie tussen LCBF en arteriële druk (r2 = 0,0246; p = 0,3534), waaruit blijkt dat de lcbf onafhankelijk was van de arteriële druk in het plateau bereik van de autoregulatory curve. Onder de LLA, de LCBF/arteriële druk relatie had een negatieve helling en LCBF was significant gecorreleerd met arteriële druk (r2 = 0,7907; p = 8,7 x 10– 25).

Figure 1
Figuur 1: plaatsing van de laser Doppler-sonde over de verdunde schedel van een verdoofd rat. Rat in stereotaxus apparaat met een LDF sonde gepositioneerd over een dunner gebied van de schedel en op zijn plaats gehouden met een micro manipulator. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: autoregulatie van de cerebrale doorbloeding in reactie op hemorragie-geïnduceerde reducties in arteriële bloeddruk. Samengevatte relatie tussen bloed volume terugtrekking en (a) gemiddelde arteriële druk (kaart) en (B) laser cerebrale doorbloeding (lcbf) bij ratten gevoed met een standaard dieet en onderworpen aan sequentiële bloed volume opnames. Gegevens weergegeven als gemiddelde ± SEM voor n = 6 – 10 na elk bloed volume terugtrekking. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: relatie tussen de gemiddelde arteriële druk en laser cerebrale doorbloeding. Relatie tijdens de plateaufase van de autoregulatoire respons (n = 37 observaties) en in de decompenserende fase van de respons (n = 70 observaties) worden getoond, waar de arteriële druk onder de LLA daalde (~ 65 mmHg). LCBF was sterk gecorreleerd met de kaart in de decompenserende fase van autoregulatie (r2 = 0,7907; p = 8,7 x 10– 25) maar niet tijdens de plateaufase van autoregulatie (r2 = 0,0246; p = 0,3534). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Evaluatie van weefsel bloedstroom reacties met laser doppler flowmetrie (LDF). Zoals hierboven vermeld, is het LDF-signaal evenredig aan het aantal en de snelheid van bewegende deeltjes, in dit geval RBC, in de microcirculatie. Ldf-metingen in verschillende organen zijn goed gecorreleerd met een hele orgaan bloedstroom die wordt beoordeeld door gevestigde methoden zoals elektromagnetische stromingsmeters en radioactieve microsferen30 en zijn over het algemeen consistent met studies die de regulering van de actieve Toon in gecanuleerde slagader preparaten evalueren10,31,32,33,34 en in-situ microcirculatoire preparaten35,36.

Een overweging bij het uitvoeren van studies van cerebrale autoregulatie, en eventueel autoregulatie in andere vasculaire bedden, is het potentiële effect van anesthesie op autoregulatory reacties. Hoewel cerebrale autoregulatie aanwezig was in de huidige studie en in een eerdere studie door onze groep11 en consistent met de bekende effecten van een HS-dieet op de vaatverwijdende reacties van de cerebrale resistentie arteriën31,32,37, de rat pial arteriolen35 en de in situ arteriolen van de hamster Wang Pouch36, Isofluraan anesthesie is gemeld dat een sterk vaatverwijdende effect38 en cardiovasculaire onderdrukking veroorzaken 39. Isofluraan is ook gemeld dat het een verlies van cerebrale vasculaire autoregulatie veroorzaakt bij muizen40,41, dus sommige onderzoekers hebben alpha-chloralose anesthesie gebruikt, alleen41 of in combinatie met urethaan42 om in plaats daarvan cerebrale autoregulatie te bestuderen.

De aantallen en snelheden van RBC variëren binnen een microcirculatoire bed, tussen individuen, en binnen een individueel onderwerp na verloop van tijd. Zo biedt LDF geen absolute waarde van de bloedstroom binnen een orgaan of de microcirculatie, tussen verschillende organen of in verschillende gebieden van de microcirculatie. Daarom is het essentieel om de LDF-sonde stevig te beveiligen, zodat deze in dezelfde positie blijft en tijdens het experiment niet wordt blootgesteld aan trillingen. Om de veranderingen in de cerebrale bloedstroom nauwkeurig te beoordelen, wordt het hoofd van de rat in een stereotaxsch instrument geplaatst en wordt de LDF-sonde in een micro manipulator gehouden over een dunner gebied van de schedel om bewegings artefacten te voorkomen en om de positie van de sonde ten opzichte van de onderzochte regio te behouden (Figuur 1). Elke beweging van de sonde weg van de oorspronkelijke plaats zal een signaal produceren dat wordt bepaald door de doorbloeding in een ander gebied van het weefsel, waardoor vergelijkingen worden belemmerd. Hoewel LDF geen meting van de absolute bloedtoevoer biedt, is het, wanneer het goed wordt uitgevoerd, nog steeds een handige en waardevolle benadering om de regulering van de bloedstroom op het niveau van het hele vasculaire bed30te evalueren, en de grootte van de relatieve stijgingen of dalingen in de ldf-stroom ten opzichte van een controlewaarde kan statistisch worden vergeleken.

Autoregulatie van cerebrale doorbloeding. De cerebrale circulatie kan normaalgesproken grote veranderingen in de arteriële bloeddruk die vasoconstrictie veroorzaken wanneer de arteriële druk is verheven en vasodilatatie wanneer de arteriële druk wordt verminderd via autoregulatory mechanismen tolereren. Deze mechanismen zijn van cruciaal belang om gevaarlijke stijgingen van de intracraniële druk te voorkomen wanneer systemische bloeddruk toeneemt en om adequate weefsel perfusie en zuurstoftoevoer te handhaven wanneer de arteriële druk afneemt. De huidige experimenten gericht op het vermogen van autoregulatory mechanismen te handhaven cerebrale bloedstroom constante als arteriële druk wordt verminderd (in plaats van het vermogen van de cerebrale circulatie te handhaven constante doorbloeding als kaart wordt verhoogd), hoewel LDF zeer waardevol is en uitgebreid gebruikt voor de laatste studies ook. Een andere waardevolle toepassing van dit experimentele ontwerp is het bestuderen van microvasculaire bloedstroom tijdens de bloeding en in verschillende vormen van bloedsomloop shock43,44,45,46.

Autoregulatie van LCBF tijdens hemorragie-geïnduceerde verlagingen van de arteriële druk wordt beoordeeld door het vergelijken van de LDF-stroom en de kaart gemeten 2 min na elk bloed terugtrekking met de prehemorragie controlekaart en LCBF gemeten onmiddellijk voorafgaand aan het bloed volume terugtrekking. Op dit punt zullen de autoregulatory mechanismen hebben gehandeld om de Microvasculatuur te verwijden om de bloedtoevoer bij de lagere perfusiedruk te handhaven. De LLA wordt geïdentificeerd als de laagste kaart waar autoregulatory mechanismen de bloedstroom nog kunnen herstellen ondanks de vermindering van de perfusiedruk. Bij arteriële druk onder de LLA, autoregulatory mechanismen hebben hun limiet bereikt en kan niet langer verwijden de cerebrale vasculatuur genoeg om verdere verlagingen van de cerebrale doorbloeding te voorkomen. Nadat de LLA is gepasseerd, is er een significante en progressieve reductie in LCBF van de prehemorragie waarde na elke intrekking van bloed om de nieuwe druk11te bereiken. De effectiviteit van cerebrale vasculaire autoregulatie in reactie op verlagingen van de arteriële bloeddruk wordt geëvalueerd door het vergelijken van de helling van de LCBF vs. de arteriële druk relatie voor en na de LLA en de breedte van de plateaufase van autoregulatie, gedefinieerd als het arteriële drukbereik tussen de kaart van de prehemorragie en de LLA. Bijvoorbeeld, een recente studie evalueren van het effect van een HS dieet op cerebrale autoregulatie11 gevonden dat cerebrale doorbloeding werd gehandhaafd op een constant niveau bij ratten gevoed met een laag zout (LS; 0,4% NaCl) dieet tijdens aanhoudende verlagingen van de arteriële druk tot waarden zo laag als 40 – 50 mmHg. Deze bevinding komt overeen met eerdere schattingen van de LLA bij gezonde ratten16,47. Echter, het plateaufase van cerebrale bloedstroom autoregulatie in normotensief Sprague-Dawley ratten gevoed korte termijn (3 dagen) en chronische (4 weken) hoog zout (HS; 4% NaCl) dieet daalde progressief met opeenvolgende verlagingen van de arteriële druk, waaruit blijkt dat HS dieet elimineert de plateaufase van de bloedstroom regulatie die normaal in gezonde normotensief ratten aanwezig is en nadelige invloed op het vermogen van de cerebrale circulatie te handhaven weefsel perfusie in het gezicht van verlagingen van de bloeddruk11. De bevinding dat autoregulatie van cerebrale bloedstroom in reactie op een verlaagde bloeddruk is aangetast bij ratten gevoed een HS-dieet is consistent met de resultaten van studies waaruit blijkt dat verhogingen van het dieet zout de versoepeling van de weerstand aders31,32,33,34,37 en arteriolen35,36 van normotensieve ratten en hamsters aantasten.

Naast het verstrekken van waardevolle inzichten met betrekking tot het vermogen van de microcirculatie om de bloedstroom automatisch uit te voeren, kunnen LDF-metingen worden gebruikt in een breed scala aan toepassingen die een dynamische schatting van de controle van de bloedstroom bieden die niet beschikbaar is met conventionele methoden, zoals microsferen en elektromagnetische stromings voelers. Ldf-metingen zijn bijvoorbeeld uiterst waardevol bij het evalueren van de respons van de microcirculatie op vasoactieve stimuli zoals ACh-infusie en toediening van andere vasoactieve agentia31,32,33,34,37, verhoogde arteriële PCO210, hypoxie17,48, neurovasculaire koppeling in reactie op sensorische stimuli21,49, functioneel hyperemie in de hersenen20, en evalueren weefselreacties op hemorragische hypotensieve stress en verschillende soorten bloedsomloop shock43,44,45,46.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs uiten hun oprechte dank aan Kaleigh Kozak, Megan Stumpf, en Jack Bullis voor hun uitstekende hulp bij het afronden van deze studie en het opstellen van het manuscript. Subsidie ondersteuning: NIH #R01-HL128242, #R21-OD018309 en #R21-OD024781.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-0 braided black silk suture Midwest Vet 193.73000.2
Arterial Pressure Transducer Merit Medical 041516504A
Automated Data Acquisition Systems (WINDAQ & BIOPAC system) DATAQ Instruments
Blood Pressure Display Unit Stoelting 50115
Circulating warm water pump Gaymar Industries T-pump
End-tidal CO2 monitor Stoelting Capstar-100
Heparin Sodium Midwest Vet 191.46720.3
Kimwipe Fisher Scientific 06-666A
Laser Doppler Flow Meter Perimed PeriFlux 5000 LDPM
Laser Doppler Refill Motility Standard Perimed PF1001
Polyethylene Tubing (PE240) (for trachea cannula) VWR 63018-828
Polyethylene Tubing (PE50) (for femoral catheters) VWR 63019-048
Rodent Ventilator Cwe/Stoelting SAR-830/P
Saline Midwest Vet 193.74504.3
Sprague-Dawley Outbred Rats Variable N/A Rats were ordered from various companies
Standard Rat Chow Dyets, Inc. 113755
Stereotaxic Instrument Cwe/Stoelting Clasic Lab Standard

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aso, Y., Inukai, T., Takemura, Y. Evaluation of microangiopathy of the skin in patients with non-insulin-dependent diabetes mellitus by laser Doppler flowmetry; microvasodilatory responses to beraprost sodium. Diabetes Research and Clinical Practice. 36, 19-26 (1997).
  2. Golding, E. M., Robertson, C. S., Bryan, R. M. Jr The consequences of traumatic brain injury on cerebral blood flow and autoregulation: a review. Clinical and Experimental Hypertension. 21, 299-332 (1999).
  3. Grunwald, J. E., DuPont, J., Riva, C. E. Retinal haemodynamics in patients with early diabetes mellitus. British Journal of Ophthalmology. 80, 327-331 (1996).
  4. Mankovsky, B. N., Piolot, R., Mankovsky, O. L., Ziegler, D. Impairment of cerebral autoregulation in diabetic patients with cardiovascular autonomic neuropathy and orthostatic hypotension. Diabetic Medicine. 20, 119-126 (2003).
  5. Symon, L., Held, K., Dorsch, N. W. A study of regional autoregulation in the cerebral circulation to increased perfusion pressure in normocapnia and hypercapnia. Stroke. 4, 139-147 (1973).
  6. Taccone, F. S., et al. Cerebral autoregulation is influenced by carbon dioxide levels in patients with septic shock. Neurocritical Care. 12, 35-42 (2010).
  7. Barry, D. I., et al. Cerebral blood flow in rats with renal and spontaneous hypertension: resetting of the lower limit of autoregulation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 2, 347-353 (1982).
  8. Faraci, F. M., Baumbach, G. L., Heistad, D. D. Cerebral circulation: humoral regulation and effects of chronic hypertension. Journal of the American Society of Nephrology. 1, 53-57 (1990).
  9. Strandgaard, S. Autoregulation of cerebral blood flow in hypertensive patients. The modifying influence of prolonged antihypertensive treatment on the tolerance to acute, drug-induced hypotension. Circulation. 53, 720-727 (1976).
  10. McEwen, S. T., Schmidt, J. R., Somberg, L., de la Cruz, L., Lombard, J. H. Time-course and mechanisms of restored vascular relaxation by reduced salt intake and angiotensin II infusion in rats fed a high-salt diet. Microcirculation. 16, 220-234 (2009).
  11. Allen, L. A., et al. High salt diet impairs cerebral blood flow regulation via salt-induced angiotensin II suppression. Microcirculation. , e12518 (2018).
  12. Smeda, J. S., Payne, G. W. Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats. Stroke. 34, 1484-1490 (2003).
  13. Greene, N. H., Lee, L. A. Modern and Evolving Understanding of Cerebral Perfusion and Autoregulation. Advances in Anesthesia. 30, 97-129 (2012).
  14. Merzeau, S., Preckel, M. P., Fromy, B., Leftheriotis, G., Saumet, J. L. Differences between cerebral and cerebellar autoregulation during progressive hypotension in rats. Neuroscience Letters. 280, 103-106 (2000).
  15. Zagorac, D., Yamaura, K., Zhang, C., Roman, R. J., Harder, D. R. The effect of superoxide anion on autoregulation of cerebral blood flow. Stroke. 36, 2589-2594 (2005).
  16. Hudetz, A. G., Lee, J. G., Smith, J. J., Bosnjak, Z. J., Kampine, J. P. Effects of volatile anesthetics on cerebrocortical laser Doppler flow: hyperemia, autoregulation, carbon dioxide response, flow oscillations, and role of nitric oxide. Advances in Pharmacology. 31, 577-593 (1994).
  17. Hudetz, A. G., Shen, H., Kampine, J. P. Nitric oxide from neuronal NOS plays critical role in cerebral capillary flow response to hypoxia. American Journal of Physiology. 274, H982-H989 (1998).
  18. Okamoto, H., Hudetz, A. G., Roman, R. J., Bosnjak, Z. J., Kampine, J. P. Neuronal NOS-derived NO plays permissive role in cerebral blood flow response to hypercapnia. American Journal of Physiology. 272, H559-H566 (1997).
  19. Okamoto, H., Roman, R. J., Kampine, J. P., Hudetz, A. G. Endotoxin augments cerebral hyperemic response to halothane by inducing nitric oxide synthase and cyclooxygenase. Anesthesia and Analgesia. 91, 896-903 (2000).
  20. Schulte, M. L., Hudetz, A. G. Functional hyperemic response in the rat visual cortex under halothane anesthesia. Neuroscience Letters. 394, 63-68 (2006).
  21. Schulte, M. L., Li, S. J., Hyde, J. S., Hudetz, A. G. Digit tapping model of functional activation in the rat somatosensory cortex. Journal of Neuroscience Methods. 157, 48-53 (2006).
  22. Alkayed, N. J., et al. Inhibition of brain P-450 arachidonic acid epoxygenase decreases baseline cerebral blood flow. American Journal of Physiology. 271, H1541-H1546 (1996).
  23. Alonso-Galicia, M., Hudetz, A. G., Shen, H., Harder, D. R., Roman, R. J. Contribution of 20-HETE to vasodilator actions of nitric oxide in the cerebral microcirculation. Stroke. 30, 2727-2734 (1999).
  24. Kurosawa, M., Messlinger, K., Pawlak, M., Schmidt, R. F. Increase of meningeal blood flow after electrical stimulation of rat dura mater encephali: mediation by calcitonin gene-related peptide. British Journal of Pharmacology. 114, 1397-1402 (1995).
  25. Mayhan, W. G., Faraci, F. M., Heistad, D. D. Impairment of endothelium-dependent responses of cerebral arterioles in chronic hypertension. American Journal of Physiology. 253, H1435-H1440 (1987).
  26. Ghali, M. G. Z. Microsurgical technique for tracheostomy in the rat. MethodsX. 5, 61-67 (2018).
  27. Ghali, M. G. Z. Microsurgical technique for femoral vascular access in the rat. MethodsX. 4, 498-507 (2017).
  28. Takada, J., et al. Valsartan improves the lower limit of cerebral autoregulation in rats. Hypertension Research. 29, 621-626 (2006).
  29. Jones, S. C., Radinsky, C. R., Furlan, A. J., Chyatte, D., Perez-Trepichio, A. D. Cortical NOS inhibition raises the lower limit of cerebral blood flow-arterial pressure autoregulation. American Journal of Physiology. 276, H1253-H1262 (1999).
  30. Smits, G. J., Roman, R. J., Lombard, J. H. Evaluation of laser-Doppler flowmetry as a measure of tissue blood flow. Journal of Applied Physiology (1985). 61, 666-672 (1986).
  31. Durand, M. J., Raffai, G., Weinberg, B. D., Lombard, J. H. Angiotensin-(1-7) and low-dose angiotensin II infusion reverse salt-induced endothelial dysfunction via different mechanisms in rat middle cerebral arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299, H1024-H1033 (2010).
  32. Lombard, J. H., Sylvester, F. A., Phillips, S. A., Frisbee, J. C. High-salt diet impairs vascular relaxation mechanisms in rat middle cerebral arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284, H1124-H1133 (2003).
  33. Weber, D. S., Lombard, J. H. Elevated salt intake impairs dilation of rat skeletal muscle resistance arteries via ANG II suppression. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 278, H500-H506 (2000).
  34. Weber, D. S., Lombard, J. H. Angiotensin II AT1 receptors preserve vasodilator reactivity in skeletal muscle resistance arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 280, H2196-H2202 (2001).
  35. Liu, Y., Rusch, N. J., Lombard, J. H. Loss of endothelium and receptor-mediated dilation in pial arterioles of rats fed a short-term high salt diet. Hypertension. 33, 686-688 (1999).
  36. Priestley, J. R., et al. Reduced angiotensin II levels cause generalized vascular dysfunction via oxidant stress in hamster cheek pouch arterioles. Microvascular Research. 89, 134-145 (2013).
  37. McEwen, S. T., Balus, S. F., Durand, M. J., Lombard, J. H. Angiotensin II maintains cerebral vascular relaxation via EGF receptor transactivation and ERK1/2. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297, H1296-H1303 (2009).
  38. Jensen, N. F., Todd, M. M., Kramer, D. J., Leonard, P. A., Warner, D. S. A comparison of the vasodilating effects of halothane and isoflurane on the isolated rabbit basilar artery with and without intact endothelium. Anesthesiology. 76, 624-634 (1992).
  39. Avram, M. J., et al. Isoflurane alters the recirculatory pharmacokinetics of physiologic markers. Anesthesiology. 92, 1757-1768 (2000).
  40. Wang, Z., Schuler, B., Vogel, O., Arras, M., Vogel, J. What is the optimal anesthetic protocol for measurements of cerebral autoregulation in spontaneously breathing mice? Experimental Brain Research. 207, 249-258 (2010).
  41. Ayata, C., et al. Pronounced hypoperfusion during spreading depression in mouse cortex. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 24, 1172-1182 (2004).
  42. Niwa, K., et al. Cerebrovascular autoregulation is profoundly impaired in mice overexpressing amyloid precursor protein. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283, H315-H323 (2002).
  43. Carreira, S., et al. Diaphragmatic Function Is Preserved during Severe Hemorrhagic Shock in the Rat. Anesthesiology. 120, 425-435 (2014).
  44. Kerby, J. D., et al. Resuscitation from hemorrhagic shock with HBOC-201 in the setting of traumatic brain injury. Shock. 27, 652-656 (2007).
  45. Krejci, V., et al. Continuous measurements of microcirculatory blood flow in gastrointestinal organs during acute haemorrhage. British Journal of Anaesthesia. 84, 468-475 (2000).
  46. Rosengarte, B., Hecht, M., Wolff, S., Kaps, M. Autoregulative function in the brain in an endotoxic rat shock model. Inflammation Research. 57, 542-546 (2008).
  47. Rozet, I., et al. Cerebral autoregulation and CO2 reactivity in anterior and posterior cerebral circulation during sevoflurane anesthesia. Anesthesia and Analgesia. 102, 560-564 (2006).
  48. Hudetz, A. G., Biswal, B. B., Feher, G., Kampine, J. P. Effects of hypoxia and hypercapnia on capillary flow velocity in the rat cerebral cortex. Microvascular Research. 54, 35-42 (1997).
  49. Shi, Y., et al. Interaction of mechanisms involving epoxyeicosatrienoic acids, adenosine receptors, and metabotropic glutamate receptors in neurovascular coupling in rat whisker barrel cortex. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 28, 111-125 (2008).

Tags

Geneeskunde probleem 155 cerebrale doorbloeding bloeding laser doppler flowmetrie autoregulatie microcirculatie doorbloeding
Evaluatie van cerebrale bloedstroom autoregulatie in de rat met behulp van laser doppler flowmetrie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Allen, L. A., Terashvili, M.,… More

Allen, L. A., Terashvili, M., Gifford, A., Lombard, J. H. Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry. J. Vis. Exp. (155), e60540, doi:10.3791/60540 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter