चूहों में न्यूट्रोफिल के प्रवास और घुसपैठ का पता लगाना
Summary
यहां, हम वीवो और इन विट्रो दोनों में न्यूट्रोफिल माइग्रेशन और घुसपैठ का आकलन करने के लिए तीन तरीके पेश करते हैं । इन तरीकों का उपयोग न्यूट्रोफिल माइग्रेशन को लक्षित करने वाले होनहार चिकित्सा विज्ञान की खोज करने के लिए किया जा सकता है।
Abstract
न्यूट्रोफिल जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के एक प्रमुख सदस्य हैं और रोगजनकों और पैथोलॉजिकल भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के खिलाफ मेजबान रक्षा में निर्णायक भूमिका निभाते हैं। न्यूट्रोफिल साइटोकिन्स और केमोकिन्स के मार्गदर्शन के माध्यम से सूजन साइटों पर भर्ती किया जा सकता है। न्यूट्रोफिल की भारी घुसपैठ से अंधाधुंध ऊतक क्षति हो सकती है, जैसे रुमेटी गठिया (आरए) में। पेरिटोनियल एक्सुडेट से अलग किए गए न्यूट्रोफिल ट्रांसवेल या जिगमंड चैंबर में विट्रो में एक परिभाषित कीमोआकर्षितेंट, एन-फोरिल-मेट-ल्यू-पीएचई (एफएमएलपी) का जवाब देते हैं। हवा थैली प्रयोग का उपयोग वीवो में लिपोपॉलीसैकराइड (एलपीएस) की ओर न्यूट्रोफिल की कीमोटैक्सियों का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। न्यायनिर्णयन-प्रेरित गठिया (एए) माउस मॉडल का उपयोग अक्सर आरए अनुसंधान में किया जाता है, और एंटी-मायोपेरोक्क्साइड (एमपीओ) या एंटी-न्यूट्रोफिल इलास्टेस (एनई) एंटीबॉडी के साथ संयुक्त वर्गों के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला को मापने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है न्यूट्रोफिल घुसपैठ। इन तरीकों का उपयोग न्यूट्रोफिल माइग्रेशन को लक्षित करने वाले आशाजनक उपचारों की खोज करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
न्यूट्रोफिल सबसे प्रचुर मात्रा में सफेद रक्त कोशिका हैं और मनुष्यों में पूरे सफेद रक्त कोशिका आबादी का 50−70% हिस्साहै 1। न्यूट्रोफिल तीव्र सूजन के दौरान प्राथमिक उत्तरदाताओं में से एक हैं। न्यूट्रोफिल को ऊतक-निवासी कोशिकाओं2,3,4द्वारा जारी साइटोकिन्स और केमोकिन्स के मार्गदर्शन के माध्यम से सूजन साइटों में भर्ती किया जा सकता है, जो न्यूट्रोफिल और संवहनी एंडोथेलियम कोशिकाओं की सतह पर कोशिका आसंजन अणुओं के बीच बातचीत द्वारा मध्यस्थता की जाती है5। न्यूट्रोफिल रक्षा की मेजबानी करने और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और अन्य ऊतक-हानिकारक अणुओं3,6की रिहाई के माध्यम से ऊतकको नुकसान पहुंचाने की उनकी शक्तिशाली क्षमता के कारण पैथोलॉजिकल भड़काऊ प्रतिक्रियाओं में भूमिका निभाने के लिए मौलिक हैं।
पिछले अध्ययनों चूहों या मनुष्यों से कई न्यूट्रोफिल अलगाव प्रोटोकॉल का वर्णन किया है । ओह एट अल. पूरे मानव रक्त7से मानव न्यूट्रोफिल को अलग करने के लिए एक घनत्व ढाल जुदाई विधि का प्रदर्शन किया । हालांकि, छोटे रक्त की मात्रा के कारण माउस रक्त से पर्याप्त न्यूट्रोफिल का अलगाव मुश्किल है। वैकल्पिक रूप से, बड़ी संख्या में शुद्ध और व्यवहार्य माउस न्यूट्रोफिल को माउस पेरिटोनियल तरल पदार्थ से प्राप्त किया जा सकता है, और इन शुद्ध न्यूट्रोफिल का उपयोग पूर्व वीवो का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें न्यूट्रोफिल घुसपैठ, प्रवासन, कीमोटैक्सिस, ऑक्सीडेटिव फट, साइटोकाइन और न्यूट्रोफिल एक्सट्रासेलुलर ट्रैप (नेट) उत्पादन8शामिल हैं। ट्रांसवेल ने9 या जिगमंड चैंबर परख10,11 का उपयोग विट्रो में न्यूट्रोफिल माइग्रेशन का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। एयर पाउच मॉडल का उपयोग वीवो में न्यूट्रोफिल के प्रवास और घुसपैठ का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। सबसे चमड़े के नीचे हवा थैली मॉडल भड़काऊ कोशिकाओं के प्रवास का अध्ययन करने के लिए वीवो पशु मॉडल में एक सुविधाजनक है।
परंपरागत रूप से, न्यूट्रोफिल को सूजन के तीव्र चरणों में रोगजनक एलिमिनेटर माना जाता था। हालांकि, हाल के निष्कर्षों से पता चला है कि न्यूट्रोफिल जटिल कोशिकाएं हैं जो विशेष कार्यों की एक महत्वपूर्ण विविधता का प्रदर्शन करती हैं। न्यूट्रोफिल कई प्रक्रियाओं जैसे तीव्र चोट और मरम्मत, ट्यूमरिजेनेसिस, ऑटोइम्यून प्रतिक्रिया और पुरानी सूजन12,13 को विनियमित कर सकतेहैं। न्यूट्रोफिल अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को भी मिलाते हैं और बी कोशिकाओं और टी कोशिकाओंको 14,15विनियमित कर सकते हैं । न्यूट्रोफिल की पर्याप्त कमी से मनुष्यों में मृत्यु या गंभीर इम्यूनोडेफिशिएंसी होती है और चूहों में न्यूट्रोफिल की कमी से मृत्यु हो जाती है, जबकि अंगों में न्यूट्रोफिल की अत्यधिक सक्रियता या भर्ती कई प्रतिरक्षा रोगों का कारण बनती है, जैसे रुमेटी गठिया (आरए) और प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमाटस (एसएलई)6। न्यूट्रोफिल आरए रोगियों के सिनोवियल द्रव में सबसे प्रचुर मात्रा में कोशिकाएं हैं। न्यूट्रोफिल क्षरण के माध्यम से माइएलोपेरोक्सिडेस (एमपीओ) और न्यूट्रोफिल इलास्टेस्टेस (एनई) की अत्यधिक मात्रा का उत्पादन करते हैं, जो उपास्थि क्षरण को बढ़ा देता है। एमपीओ एक पेरोक्सिडेस एंजाइम है जो मुख्य रूप से न्यूट्रोफिल16के कणिकाओं में व्यक्त किया जाता है । NE आर्टिकुलर उपास्थि विनाश17के साथ जुड़ा हुआ है । एमपीओ और एनई का उपयोग एआरए रोगियों के ऊतकों में न्यूट्रोफिल माइग्रेशन और घुसपैठ की स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।
यह लेख वीवो और इन विट्रो दोनों में प्रेरित सामान्य न्यूट्रोफिल के प्रवास का मूल्यांकन करने के साथ-साथ माउस संयुक्त-विशिष्ट सूजन मॉडल में पैथोलॉजिकल न्यूट्रोफिल की घुसपैठ के लिए तीन पारंपरिक तरीके प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
परिधीय रक्त7,अस्थि मज्जा और ऊतकों18 से अत्यधिक शुद्ध न्यूट्रोफिल के विस्तृत प्रोटोकॉल लंबे समय से उपलब्ध हैं। यहां हम पेरिटोनियल द्रव19 से न्यूट्रोफिल को अलग करने की एक विधि ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या ८१४३००९९ और ३१५००७०४), अंतरराष्ट्रीय सहयोग और विनिमय परियोजनाओं (अनुदान संख्या २०१४DFA32950), और बीजिंग चीनी चिकित्सा विश्वविद्यालय के अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था ( अनुदान संख्या BUCM-2019-JCRC006 और 2019-JYB-TD013) ।
Materials
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
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