Summary

Afsløring af migration og infiltration af neutrofiler i mus

Published: February 06, 2020
doi:

Summary

Her præsenterer vi tre metoder til at vurdere neutrofil migration og infiltration både in vivo og in vitro. Disse metoder kan bruges til at opdage lovende terapeutiske målretning neutrofile migration.

Abstract

Neutrofiler er et vigtigt medlem af det medfødte immunsystem og spiller afgørende roller i værtsforsvaret mod patogener og patologiske inflammatoriske reaktioner. Neutrofiler kan rekrutteres til inflammation websteder via vejledning af cytokiner og chemokiner. Overvældende infiltration af neutrofiler kan føre til vilkårlige vævsskader, såsom i leddegigt (RA). Neutrofiler isoleret fra peritoneal ekssudat reagere på en defineret kemoattractant, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro i Transwell eller Zigmond kammer analyser. Den luft pose eksperiment kan bruges til at evaluere kemotaxis af neutrofiler mod lipopolysaccharid (LPS) in vivo. Den adjuvanske-induceret arthritis (AA) musemodel anvendes ofte i RA-forskning, og immunhistokemisk farvning af fælles sektioner med anti-myeloperoxidase (MPO) eller anti-neutrofile elastase (NE) antistoffer er en veletableret metode til at måle neutrofil infiltration. Disse metoder kan bruges til at opdage lovende behandlinger rettet mod neutrofile migration.

Introduction

Neutrofiler er de mest rigelige hvide blodlegemer og tegner sig for 50-70% af hele hvide blodlegemer population hos mennesker1. Neutrofiler er en af de primære responders under akut inflammation. Neutrofiler kan rekrutteres til inflammation ssteder via vejledning af cytokiner og chemokiner frigivet af væv-hjemmehørende celler2,3,4, som formidles af samspillet mellem celle vedhæftning molekyler på overfladen af neutrofiler og vaskulære endothelium celler5. Neutrofiler er grundlæggende for at være vært for forsvar og spille en rolle i patologiske inflammatoriske reaktioner på grund af deres magtfulde evne til at skade væv via frigivelse af reaktive iltarter (ROS) og andre vævsskadelige molekyler3,6.

Tidligere undersøgelser har beskrevet flere neutrofile isolationprotokoller fra mus eller mennesker. Oh et al. demonstrerede en densitetgradient separation metode til at isolere menneskelige neutrofiler fra hele humant blod7. Men isolationen af tilstrækkelige neutrofiler fra museblod er vanskelig på grund af den lille blodvolumen. Alternativt kan et stort antal rene og levedygtige mus neutrofiler fremkaldes fra museperitoneal væske, og disse rensede neutrofiler kan bruges ex vivo til at undersøge flere aspekter af cellulære funktioner ex vivo, herunder neutrofil infiltration, migration, kemotaxis, oxidativ brast, cytokin og neutrophil ekstracellulære fælde (NET) produktion8. Transwell assays9 eller Zigmond kammer assays10,11 kan bruges til at vurdere neutrofile migration in vitro. Luftposemodellen bruges til at evaluere migration og infiltration af neutrofiler in vivo. Den subkutane luft pose model er en bekvem in vivo dyremodel til at studere migration af inflammatoriske celler.

Traditionelt blev neutrofiler betragtet som patogeneliminatorer i akutte faser af inflammation. Men, nylige resultater har vist, at neutrofiler er komplicerede celler, der udfører en betydelig række specialiserede funktioner. Neutrofiler kan regulere mange processer såsom akut skade og reparation, tumorigenese, autoimmun reaktion, og kronisk inflammation12,13. Neutrofiler modulerer også adaptive immunrespons og kan regulere B-celler og T-celler14,15. Betydelig mangel på neutrofiler fører til dødelighed eller svær immundefekt hos mennesker og neutrofiludtynding hos mus fører til dødsfald, mens overdreven aktivering eller rekruttering af neutrofiler i organer forårsager flere immunsygdomme, såsom leddegigt (RA) og systemisk lupus erythematosus (SLE)6. Neutrofiler er de mest rigelige celler i synovial væsken af RA patienter. Neutrofiler producerer store mængder myeloperoxidase (MPO) og neutrofile elastase (NE) via nedbrydning, hvilket forværrer bruskerosion. MPO er et peroxidaseenzym, der hovedsagelig udtrykkes i granulatet af neutrofiler16. NE er forbundet med artikulær brusk ødelæggelse17. MPO og NE kunne anvendes til at vurdere status for neutrofil migration og infiltration i væv af RA patienter.

Denne artikel indeholder tre konventionelle metoder til at evaluere migration af normale neutrofiler induceret både in vivo og in vitro, samt infiltration af patologiske neutrofiler i en mus fælles-specifik inflammation model.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer blev gennemgået og godkendt af Beijing University of Chinese Medicine Animal Care and Use Committee. BEMÆRK: C57BL/6 mus (7-8 uger gamle) blev brugt. 1. Neutrofil isolation Erhvervelse af peritoneale ekssudatceller Forbered frisk 10% proteose peptone opløsning i ddH2O. Beregn den nødvendige mængde i henhold til antallet af mus.BEMÆRK: Indstil antallet af mus som N(2N+1) ml opløsning skal opløse…

Representative Results

Peritoneale ekssudatceller blev indsamlet fra lavage væske af mus. Cellerne blev ophængt igen i 1 ml RPMI-1640 komplet medium, lagdelt på en to-trins (54,8% /70.2%) diskontinuerlig densitetsgradient (figur 1A) og centrifugeret ved 1.500 x g i 30 min. Neutrophils (≥95%, ~1 x 107 neutrofiler/mus) blev inddrevet fra den nederste grænseflade (figur 1B). <p class="jove_co…

Discussion

Detaljerede protokoller af højt rensede neutrofiler fra perifert blod7,knoglemarv og væv18 har været tilgængelige i lang tid. Her vedtager vi en metode til at isolere neutrofiler fra peritoneal væske19, hvor modne neutrofiler forbliver inaktiveret for yderligere anti-inflammatoriske og antioxidant undersøgelser.

Vi brugte luftpose eksperimentet til at udforske LPS-induceret infiltration af neutrofiler in vivo. Denne …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (tilskud numre 81430099 og 31500704), Internationalt samarbejde og udvekslingsprojekter (tilskud nummer 2014DFA32950), og forskningsprogram af Beijing University of Chinese Medicine ( tilskudsnumre NEM-2019-JCRC006 og 2019-JYB-TD013).

Materials

0.1% Fast Green Solution Solarbio 8348b Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter
0.1% Safranin O Staining Solution Solarbio 8348a Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 Sigma 324506 Sterile
100% Ethanol Beijing Chemical Works
100% Methanol Beijing Chemical Works
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube Falcon 14-959-53A
23 G x 1 1/4" Needle BD 305120
26 G x 3/8" Needle BD 305110
3% bovine serum albumin (BSA) Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS
3% H2O2 Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol
3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit ZSGB-BIO ZLI-9018
30 G x 1/2" Needle BD 305106
30% H2O2 Beijing Chemical Works
5 mL Syringe BD Z683574
50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube Falcon 14-432-22
50% Ethanol Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O
54.8% Percoll Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still
70% Ethanol Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O
70.2% Percoll Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still
80% Ethanol Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O
95% Ethanol Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O
Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution Beyotime C0165S
ANTIBODIES
Anti-Myeloperoxidase Antibody Abcam ab208670
Anti-Neutrophil Elastase Antibody Abcam ab21595
Automatic Hematology Analyzer Sysmex XS-800i
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 0332-100G
Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml sigma 1002036152
Cover Slip CITOGLAS 10212432C
Dial Thickness Gauge Mitutoyo 7301
Eppendorf Microtubes, 1.5 mL Sigma Z606340
Foetal Bovine Serum (FBS) Premium PAN P30-1302
Gas Anesthesia System ZS Dichuang ZS-MV-IV
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) PPLYGEN C1309 This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-016-1A Sterile
Hematoxylin Staining Solution ZSGB-BIO ZLI-9609
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L3012
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit Solarbio G1371
N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma 47729
Penicillin Streptomycin Solution, 100× Invitrogen 1514022
Percoll GE Healthcare 10245207 Density gradient medium
Permeabilization Buffer Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100
Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved
Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
POWDER
Proteose Peptone Oxoid 1865317
Retrieval Buffer Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0
Retrieval Buffer A Stock for IHC Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5OH2O) in 200 mL dH2O
Retrieval Buffer B Stock for IHC Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium Sigma R8758
RPMI-1640 Complete Medium RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.
Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL BD 328421
Slide CITOGLAS 10127105P-G
SOLUTION
Stock Isotonic Percoll (SIP) Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min
Wash Buffer in Air Pouch Assay Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS
Xylene Beijing Chemical Works

References

  1. Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
  2. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. S. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. , 23-35 (2007).
  3. Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
  4. Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
  5. Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
  6. Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
  7. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
  8. Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
  9. Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
  10. Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).
  11. Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
  12. Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil’s Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
  13. Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).
  14. Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
  15. Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
  16. Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
  17. Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
  18. Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
  19. Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
  20. Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
  21. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
  22. Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
  23. Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
  24. Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).

Play Video

Cite This Article
Lu, Q., Yuan, K., Li, X., Jiang, H., Huo, G., Jia, W., Huang, G., Xu, A. Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice. J. Vis. Exp. (156), e60543, doi:10.3791/60543 (2020).

View Video