Afsløring af migration og infiltration af neutrofiler i mus
Summary
Her præsenterer vi tre metoder til at vurdere neutrofil migration og infiltration både in vivo og in vitro. Disse metoder kan bruges til at opdage lovende terapeutiske målretning neutrofile migration.
Abstract
Neutrofiler er et vigtigt medlem af det medfødte immunsystem og spiller afgørende roller i værtsforsvaret mod patogener og patologiske inflammatoriske reaktioner. Neutrofiler kan rekrutteres til inflammation websteder via vejledning af cytokiner og chemokiner. Overvældende infiltration af neutrofiler kan føre til vilkårlige vævsskader, såsom i leddegigt (RA). Neutrofiler isoleret fra peritoneal ekssudat reagere på en defineret kemoattractant, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro i Transwell eller Zigmond kammer analyser. Den luft pose eksperiment kan bruges til at evaluere kemotaxis af neutrofiler mod lipopolysaccharid (LPS) in vivo. Den adjuvanske-induceret arthritis (AA) musemodel anvendes ofte i RA-forskning, og immunhistokemisk farvning af fælles sektioner med anti-myeloperoxidase (MPO) eller anti-neutrofile elastase (NE) antistoffer er en veletableret metode til at måle neutrofil infiltration. Disse metoder kan bruges til at opdage lovende behandlinger rettet mod neutrofile migration.
Introduction
Neutrofiler er de mest rigelige hvide blodlegemer og tegner sig for 50-70% af hele hvide blodlegemer population hos mennesker1. Neutrofiler er en af de primære responders under akut inflammation. Neutrofiler kan rekrutteres til inflammation ssteder via vejledning af cytokiner og chemokiner frigivet af væv-hjemmehørende celler2,3,4, som formidles af samspillet mellem celle vedhæftning molekyler på overfladen af neutrofiler og vaskulære endothelium celler5. Neutrofiler er grundlæggende for at være vært for forsvar og spille en rolle i patologiske inflammatoriske reaktioner på grund af deres magtfulde evne til at skade væv via frigivelse af reaktive iltarter (ROS) og andre vævsskadelige molekyler3,6.
Tidligere undersøgelser har beskrevet flere neutrofile isolationprotokoller fra mus eller mennesker. Oh et al. demonstrerede en densitetgradient separation metode til at isolere menneskelige neutrofiler fra hele humant blod7. Men isolationen af tilstrækkelige neutrofiler fra museblod er vanskelig på grund af den lille blodvolumen. Alternativt kan et stort antal rene og levedygtige mus neutrofiler fremkaldes fra museperitoneal væske, og disse rensede neutrofiler kan bruges ex vivo til at undersøge flere aspekter af cellulære funktioner ex vivo, herunder neutrofil infiltration, migration, kemotaxis, oxidativ brast, cytokin og neutrophil ekstracellulære fælde (NET) produktion8. Transwell assays9 eller Zigmond kammer assays10,11 kan bruges til at vurdere neutrofile migration in vitro. Luftposemodellen bruges til at evaluere migration og infiltration af neutrofiler in vivo. Den subkutane luft pose model er en bekvem in vivo dyremodel til at studere migration af inflammatoriske celler.
Traditionelt blev neutrofiler betragtet som patogeneliminatorer i akutte faser af inflammation. Men, nylige resultater har vist, at neutrofiler er komplicerede celler, der udfører en betydelig række specialiserede funktioner. Neutrofiler kan regulere mange processer såsom akut skade og reparation, tumorigenese, autoimmun reaktion, og kronisk inflammation12,13. Neutrofiler modulerer også adaptive immunrespons og kan regulere B-celler og T-celler14,15. Betydelig mangel på neutrofiler fører til dødelighed eller svær immundefekt hos mennesker og neutrofiludtynding hos mus fører til dødsfald, mens overdreven aktivering eller rekruttering af neutrofiler i organer forårsager flere immunsygdomme, såsom leddegigt (RA) og systemisk lupus erythematosus (SLE)6. Neutrofiler er de mest rigelige celler i synovial væsken af RA patienter. Neutrofiler producerer store mængder myeloperoxidase (MPO) og neutrofile elastase (NE) via nedbrydning, hvilket forværrer bruskerosion. MPO er et peroxidaseenzym, der hovedsagelig udtrykkes i granulatet af neutrofiler16. NE er forbundet med artikulær brusk ødelæggelse17. MPO og NE kunne anvendes til at vurdere status for neutrofil migration og infiltration i væv af RA patienter.
Denne artikel indeholder tre konventionelle metoder til at evaluere migration af normale neutrofiler induceret både in vivo og in vitro, samt infiltration af patologiske neutrofiler i en mus fælles-specifik inflammation model.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detaljerede protokoller af højt rensede neutrofiler fra perifert blod7,knoglemarv og væv18 har været tilgængelige i lang tid. Her vedtager vi en metode til at isolere neutrofiler fra peritoneal væske19, hvor modne neutrofiler forbliver inaktiveret for yderligere anti-inflammatoriske og antioxidant undersøgelser.
Vi brugte luftpose eksperimentet til at udforske LPS-induceret infiltration af neutrofiler in vivo. Denne …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (tilskud numre 81430099 og 31500704), Internationalt samarbejde og udvekslingsprojekter (tilskud nummer 2014DFA32950), og forskningsprogram af Beijing University of Chinese Medicine ( tilskudsnumre NEM-2019-JCRC006 og 2019-JYB-TD013).
Materials
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. S. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. , 23-35 (2007).
- Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
- Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
- Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
- Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).
- Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil’s Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).
- Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
- Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
- Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
- Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
- Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
- Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
- Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
- Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
- Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).
