Summary
Этот протокол генерирует биочастицы микроаррей, которые обеспечивают пространственно контролируемых нейтрофилов роятся. Он обеспечивает легкий доступ к посредникам, которые нейтрофилы высвобождают во время миграции, и позволяет проводить количественный анализ изображений.
Abstract
Нейтрофил роятся совместно процесс, с помощью которого нейтрофилы запечатать сайт инфекции и содействовать реорганизации тканей. Рой классически изучался в vivo в животных моделях, показывающих характерные закономерности миграции клеток. Однако модели in vivo имеют ряд ограничений, в ключая межклеточные посредники, которые трудно доступны и анализируют, а также неспособность непосредственно анализировать нейтрофилы человека. Из-за этих ограничений, существует необходимость в in vitro платформы, которая изучает роятся с человеческими нейтрофилов амии и обеспечивает легкий доступ к молекулярным сигналам, генерируемым во время роя. Здесь многоступенчатый процесс микроштамповки используется для генерации микроаря биочастиц, который стимулирует рой, имитируя инфекцию in vivo. Биочастица microarray индуцирует нейтрофилов роиться в контролируемой и стабильной образом. На микроарере нейтрофилы увеличивают скорость и образуют стабильные стаи вокруг скоплений биочастиц. Кроме того, был проанализирован супернатант, генерируемый нейтрофиловами, и было обнаружено, что 16 белков были дифференциально выражены в течение роя. Эта платформа in vitro роя облегчает прямой анализ миграции нейтрофилов и высвобождения белка воспроизводимым, пространственно контролируемым образом.
Introduction
Нейтрофилы, наиболее распространенные белые кровяные клетки в крови1, приобретают внимание в качестве потенциальных диагностических и терапевтических целей2,3, потому что они могут быть вовлечены в различные медицинские условия, включая подагра4, сепсис3, травма5,рак1,7,8, и различные аутоиммунные заболевания5,9. Нейтрофил роятся многоступенчатый, жестко регулируется процесс со сложностью, что делает его особенно интересным фокусом исследования5,10,11. Во время роя, нейтрофилы изолируют участок воспаления от окружающих здоровыхтканей 5,10,11. Правильная регуляция нейтрофила роя имеет важное значение для содействия заживлению ран и в конечном счете, разрешение воспаления5,12. Нейтрофил роя в первую очередь изучался в vivo у грызунов12,13,14,15 и зебрафиш10,11,12,15 моделей. Тем не менее, характер этих моделей in vivo животных приводит к ограничениям5. Например, посредники, выпущенные нейтрофиловами во время роя, не так легко доступны для анализа5. Кроме того, Есть много потенциальных источников для данного посредника in vivo, так что эксперимент in vivo должен ввести генетический дефицит, чтобы ингибировать клеточного производства и / или взаимодействия для того, чтобы исследовать роль этого посредника в данном процессе13. Эксперимент in vitro обходит это осложнение, позволяя наблюдение за нейтрофилами без контекста дополнительных клеток. Кроме того, исследования, описывающие человека нейтрофил скоординированной миграцииограничено 16. На платформе витро роятся, человека нейтрофилов может быть непосредственно проанализированы. Платформа in vitro роя может расширить знания, полученные в результате исследований in vivo, предоставив возможности для заполнения пробелов, оставленных ограничениями исследований in vivo.
Для удовлетворения потребности в платформе in vitro, которая имитирует в ививо-нейтрофил роятся, мы разработали платформу микроштампов, которая позволяет нам узор биочастицы микроаррей, которые стимулируют нейтрофил роятся в пространственно контролируемым образом. Мы генерируем биочастицы микроаррей на стеклянных слайдах в двухэтапном процессе. Во-первых, мы используем микроштамповку для создания микроарра пятенного полиэлектролита (CP). Во-вторых, мы добавляем раствор биочастиц, которые придерживаются cp пятна через электростатическое взаимодействие. При первом узоре слое CP, мы можем выборочно шаблон отрицательно заряженных биочастиц для создания желаемого нейтрофила роя картины. Положительно заряженный слой удерживает отрицательно заряженные биочастицы через энергичную шаг стирки, которая удаляет биочастицы из областей на стеклянной горке, которые не имеют CP. Кроме того, CP используется здесь, кополимер акриламид и quaternized cationic мономер, является биосовместимым, так что это не вызывает реакцию от нейтрофилов. Он имеет очень высокий поверхностный заряд, который обездвиживает биочастицы размером с микрон к стеклянной горке, тем самым препятствуя нейтрофилу нейтрофилов удалять частицы из узорчатого положения на стеклянном слайде. Это приводит к биочастий кластеров, расположенных в microarray. Когда мы добавили нейтрофилов в микроаррей, они образовали стабильные стаи вокруг скоплений биочастиц. С помощью отслеживания миграции нейтрофилов мы обнаружили, что роятся нейтрофилы, активно мигрирующие в кластеры биочастиц. Кроме того, мы использовали эту платформу для анализа некоторых посредников, которые нейтрофилы высвобождают во время рояния. Мы нашли 16 посредников, которые дифферепрециально выражены во время роя. Их концентрации следуют трем общим тенденциям с течением времени: увеличение, уменьшение или всплеск. Наша платформа in vitro neutrophil swarming облегчает анализ пространственно контролируемого кишат нейтрофила, а также сбор и анализ посредников, выпущенных нейтрофилами. В предыдущей публикации, мы показали, что пациенты с определенными заболеваниями (травма, аутоиммунные заболевания и сепсис), были нейтрофилы, которые функционировали иначе, чем у здоровых доноров5. В будущих исследованиях, наша платформа может быть использована для анализа функции нейтрофилов среди различных популяций пациентов. Эта платформа может количественно проанализировать сложную координацию, связанную с нейтрофил роя. Дополнительные исследования могут быть сделаны, чтобы дать представление о нейтрофильной функции конкретной популяции пациентов или нейтрофил ответ на патоген, представляющий интерес.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Авторы признают здоровых добровольцев, которые любезно сдали свою кровь. Образцы крови были получены после информированного согласия добровольцев в соответствии с протоколом институционального совета по обзору (IRB) #2018H0268 рассмотрены Комитетом по биомедицинским наукам при Университете штата Огайо.
1. Микрофабрикация биочастиц ымикроаря
- Используя стандартные фотолитографические процедуры, создайте мастер кремниевые пластины.
- Создайте доказательство желаемого дизайна с помощью компьютерного дизайна (CAD) программного обеспечения, а затем отправить в фотомаску производителя для производства хром фотомаски. Конструкция, используемая здесь, представляет собой 4 мм х 4 мм прямоугольные массивы диаметром 30 мкм, заполненные кругами с интервалом 150 мкм от центра к центру. Эта конструкция может быть изменена по желанию для различных приложений.
- Spincoat 40 м толщиной слой отрицательного фотоустойчивость на кремниевые пластины. Выпекать при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 5 мин и 95 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
- Выставлять на ультрафиолетовый свет через хромированную фотомаску со 150-160 мДж/см2 (рисунок 1А).
- Выпекать при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 5 мин и 95 градусов по Цельсию в течение 10 мин. Погрузить вафельу в фоторезистой разработчика в течение 10 минут и промыть изопропиловым спиртом. На этом этапе рисунок должен быть виден на вафельной(рисунок 1B).
- Тщательно смешать 10:1 соотношение полидиметилсилоксанпрея преполимера и его лечащий агент (т.е. 20 г преполимера и 2 г лечащий агент) и залить неизлечимых полидиметилсилоксан (PDMS) смесь над мастер в чашке Петри (Рисунок 1C).
- Вакуумная обработка неизлечимых pdMS смеси, пока не пузырьки воздуха присутствуют над мастер. Лечить при 65 градусах Цельсия на ночь.
- Используйте скальпель, чтобы разрезать вокруг внешней части узорной части пластины, и медленно удалить вылечить плиту PDMS. Поместите плиту PDMS на чистую разделочную доску с узорчатой стороной вверх(рисунок 1D).
- Выпукать отдельные марки из плиты PDMS с 8 мм биопсии удар(Рисунок 1E). Для одной стеклянной горки потребуется восемь марок.
- Поместите каждую марку лицом вниз на клеевую ленту, чтобы удалить любой мусор.
- Заранее приготовьте раствор CP в воду 1,6 мг/мл.
- Добавьте в воду необходимое количество порошка CP (например, от 0,8 г до 500 мл).
- Смешайте на перемешать пластины при комнатной температуре на ночь, или до тех пор, пока все твердые растворяется в воде. Раствор CP может храниться при комнатной температуре в течение 6 месяцев.
- При желании сделайте раствор CP флуоресцентным, добавив поли-L-лизин с маркировкой флуоресцеина изотиоцианата (PLL-FITC).
- Aliquot около 10 мл решения CP. Добавьте небольшое количество PLL-FITC (0,05 мг) к aliquoted объему. Сумма может быть изменена, чтобы настроить яркость флуоресценции по желанию.
- Vortex CP решение помечены FITC для 20 с, или пока решение единого, бледно-желтого цвета. Защитите от света и храните при 4 градусах По Цельсию до 1 месяца.
- С марками лицом вверх, премьер каждая марка с 100 л 1,6 мг /мл решение CP, обеспечивая отсутствие пузырьков воздуха форме между решением CP и штамп (Рисунок 1F).
- Перевернуть марки на слой решения CP(рисунок 1G).
- Удалите марки из решения CP после 1 ч.
- Dab каждый мокрый штамп лицом вниз на чистую стеклянную горку 6-8x, чтобы удалить лишнюю жидкость.
- Вакуумная обработка марок в течение 1-2 мин.
- Придерживайтесь восемь скважин, 9 мм диаметром изображения прокладка на верхней части чистого стекла слайд в качестве руководства для размещения штампа. С помощью этого прокладки, каждый стеклянный слайд может иметь восемь microarrays.
- Поместите штамп лицом вниз на стеклянную горку в центре каждого колодца прокладки изображения (т.е. используйте восемь марок всего).
- Поместите 5,6 и 0,1 г сбалансированного веса поверх каждой марки и позвольте 10 минут для штамповки(рисунок 1H). Сбалансированный вес необходим для обеспечения того, чтобы марка равномерно надавлялась на стеклянную горку и способствовала равномерному переносу CP на стеклянную горку.
- Удалите веси и марки со стеклянной горки(рисунок 1I). Разрешить CP слой высохнуть при комнатной температуре в течение 24 ч, прежде чем добавить биочастицы, как описано в шаге 1.17. Если CP помечен FITC, эффективность штамповки может быть проверена в этот момент с флуоресцентным микроскопом на 488 нм, прежде чем приступить к шагу 1.17(Рисунок 1M).
- Вырежьте пустую плиту PDMS до размера просмочонии изображения и используйте пунш биопсии 8 мм для того чтобы создать скважины в PDMS которые выравнивают с наилучшимобразом образом spacer изображения. Придерживайтесь плиты PDMS к стеклянной слайд с визуализации спейсер(Рисунок 1J).
- Оттепель раствор биочастиц (например, кишечной палочки или зимосана) и разбавить до 500 мкг/мл в воде для инъекций (WFI).
ПРИМЕЧАНИЕ: Биочастицы не должны быть opsonized. Нейтрофильные поверхностные рецепторы непосредственно распознают молекулы на этих биочастицах19,20,21. - Добавьте 100 л раствора биочастиц к каждому PDMS наилучшим образом на стекольке стекла(рисунок 1K).
- Раскачивай стеклянную горку в течение 30 минут.
- Тщательно промыть колодцы водой. Микроаррей биочастицы может храниться в свободной от пыли среде при 4 градусах Цельсия в течение 3 месяцев. На данный момент, картина должна быть проверена с флуоресцентным микроскопом на 594 нм, прежде чем приступить к шагу 2.1 (Рисунок 1N).
2. Подготовка образцов
- Соберите не менее 2 мл свежей крови в трубках K2-EDTA от желаемого донора. Ожидаемый выход нейтрофилов составляет 1-2 х 106 клеток/1 мл цельной крови. Анализ изображения требует примерно 1,5 х 10 5 нейтрофилов, а анализ супернатанта требует 1 х 106 нейтрофилов. Используйте кровь в течение 4 ч.
- Отделите эритроциты (RBCs) путем добавления агента агрегации эритроцитов в соотношении 1:5 ко всей крови. Подождите 45 минут для полупрозрачного слоя (буффи пальто), чтобы отделитьот от слоя РБК.
- Снимите буйный слой и промойте фосфат буферным сольниковым раствором (PBS) с помощью 1 мл шубной шерсти: 9 мл PBS.
- Центрифуга в течение 5 мин при 190 х г и 20 градусов по Цельсию.
- Приготовьте супернатант и отдохните гранулы на 5 х 107 клеток/мл.
- Используйте отрицательный набор иммуномагнитного отбора для изоляции нейтрофилов.
- Добавьте 50 зл антител, коктейль ный коктейль/1 мл клеточной подвески. Подождите 10 минут.
- Добавьте 100 зл магнитных бусин/1 мл клеточной подвески. Подождите 10 минут.
- Добавьте суспензию в трубку с круглым дном и поместите в цилиндрический магнит. Подождите 10 минут.
- Налейте супернатант в центрифуги трубки. Добавьте до 10 мл PBS. Центрифуга в течение 5 мин при 190 х г и 20 градусов по Цельсию.
- Аспирсупернатан. Отдохните белые гранулы в IMDM с 0,4% человеческого сыворотки альбумина.
- Ядра пятна с 20 мкг/мл Hoechst 33342 для 10 мин при 37 градусах По Цельсия.
- Добавьте 5 мл IMDM с 0,4% человеческого сывороточного альбумина для промывки. Центрифуга в течение 5 мин при 190 х г и 20 градусов по Цельсию.
- Resuspend клетки на 7,5 х 105 клеток / мл в IMDM с 0,4% человека сыворотки альбумина.
- Добавьте 100 зЛ клеточной суспензии в PDMS, содержащий биочастицу микроаррей. Убедитесь, что суспензия ячейки выпуклой поверх PDMS хорошо и не содержит пузырьков.
- Печать с крышкой диаметром 12 мм. Обложка открытия PDMS хорошо с 12 мм диаметром coverslip. Нажмите вниз осторожно на крышку с помощью пинцета, чтобы избыток подвески ячейки ускользает к краю колодца. Используйте ткань для удаления избыточной клеточной суспензии.
3. Проведение анализа и анализа изображений
- Загрузите массив микрочастиц с клетками на станции визуализации живых клеток с микроскопом, оснащенным инкубатором клетки, установленным до 37 градусов по Цельсию, 5% CO2и 90% относительной влажности.
- Используйте флуоресцентные и яркие микроскопии для записи изображений при 10-кратном увеличении каждые 10 с при 405 нм, 594 нм и ярком поле. В типичном эксперименте изображения собираются до 2 ч.
- Используйте автоматизированное программное обеспечение для отслеживания клеток для отслеживания миграции отдельных нейтрофилов к скоплению биочастиц.
- Используйте режим автоматической регрессии программного обеспечения для отслеживания ячейки обнаружения пятен. Установите радиус пятна до 5 мкм (приблизительный размер ядра нейтрофила). Установите минимальную длину трека до 120 с и максимальный размер зазора одного кадра.
- Из данных, генерируемых программным обеспечением для отслеживания клеток, извлекайте файлы, содержащие положение и скорость нейтрофилов. Эти файлы могут быть использованы с графиком программного обеспечения для генерации нейтрофилов миграционных треков(рисунок 2C) и тепловой карты скорости по сравнению с временем(рисунок 2D), соответственно.
- Используйте 405 нм флуоресцентные изображения для отслеживания размера роя с течением времени на программное обеспечение анализа изображений по вашему выбору.
- Определите области, представляющие интерес (ROIs) вокруг каждого кластера биочастиц, где будут роиться нейтрофилы. Держите тот же размер рентабельности инвестиций для анализа каждого кластера биочастиц.
- Проанализируйте средняя интенсивность флуоресцентных изображений 405 нм в пределах каждой рентабельности инвестиций с течением времени.
- Создайте кривую калибровки средней интенсивности флуоресцентного до размера роя, принимая ручные измерения на различных размерах роя от 0 мкм2 до максимального размера роя. Используйте эту калибровку, чтобы вычислить размер роя с течением времени.
4. Сбор супернатантов и обнаружение белка
- Инкубировать нейтрофилов в скважинах, содержащих биочастицы микроаррей на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 на 3 ч. Возьмите пробы в нужных временных точках. Как правило, пробы берутся при 0, 0,5, 1 и 3 ч. Чтобы преодолеть предел обнаружения протеинового массива, для каждой временной точки использовался весь объем супернатанта одного колодца (200 л). Каждый раз точка анализировалась в тройном.
- Используя яркий микроскоп, убедитесь, что стаи образуются на микроарле.
- Приготовьте супернатант с 200-мл пипеткой и загрузите в 0,45 мкм центрифуги фильтра трубки.
- Centrifuge супернатант на 190 х г и 20 градусов по Цельсию в течение 5 минут и собирать фильтрованный объем.
- Храните образцы при -80 градусах по Цельсию до времени обработки.
- Используйте набор microarray, который обнаруживает ряд человеческих белков для обработки образцов.
- Добавьте 200 л каждого образца в отдельную диализную трубку с комплектом.
- Поместите диализные трубки в стакан, содержащий не менее 500 мл PBS (pH 8.0). Аккуратно перемешайте на тарелке перемешать, по крайней мере 3 ч при 4 градусах Цельсия. Измените PBS в стакане и повторите этот шаг.
- Перенесите каждый образец в чистую центрифугу и центрифугу при 9000 х г в течение 5 мин, чтобы удалить все осадки. Перенесите каждый супернатант на чистую трубку.
- Биотинилат каждый образец, добавляя 36 юртей 1x маркировки реагента из комплекта на 1 мг общего белка в диализированном образце до 180 л диализированного образца. Инкубировать при 20 градусах по Цельсию в течение 30 мин. Смешайте осторожно каждые 5 минут.
- Добавьте в каждый образец трубки 3 злиста стоп-решения, снабженного комплектом. Перенесите каждый образец на свежую диализную трубку и повторите шаги 4.6.2-4.6.3. На этом этапе образец может храниться при -20 градусах или -80 градусов по Цельсию до тех пор, пока вы не будете готовы к продолжению.
- Стеклянная горка с комплектом хранится при -20 градусах Цельсия. Разрешить ему прийти к комнатной температуре. Поместите собранную стеклянную горку в ламинарный капот потока на 1-2 ч при комнатной температуре.
- Добавьте 400 qL блокирующего буфера с комплектом в каждую скважину собранного стеклянного слайда. Инкубировать при комнатной температуре 30 мин.
- Centrifuge подготовленные образцы в течение 5 мин на 9000 х г, чтобы удалить осадки или частицы. Разбавить 5x блокирующим буфером.
- Удалите блокирующий буфер из каждого колодца. Добавьте 400 л разбавленных образцов в соответствующие скважины. Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре во время раскачивания.
- Декант образцы из каждой скважины. Вымойте 3x с 800 л из 1x мыть буфера я предоставил комплект при комнатной температуре в течение 5 минут каждый в то время как качание.
- В чистом контейнере, погрузить собранное стекло слайд в 1x мыть буфер I. Вымойте 2x при комнатной температуре в течение 5 минут каждый во время качания.
- Добавьте 400 л из 1x Cy3-конъюгированного стрептавидина к каждому подмассиву. Накрыть пластиковыми клейки полосками. Защитите от света на оставшуюся часть протокола.
- Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре во время раскачивания.
- Оснастить раствор и разобрать стеклянную горку из образцовых камер.
- В 30 мл центрифуги трубки с комплектом, тщательно добавить стеклянный слайд и достаточно 1x мыть буфер i для покрытия стеклянной слайд. Вымойте 3x для 10 минут каждый при комнатной температуре во время качания.
- В 30 мл центрифуги трубки, мыть 2x с 1x мыть буфер II в течение 5 минут каждый при комнатной температуре во время качания.
- Вымойте стеклянную горку с 30 мл ddH2O в течение 5 мин. Снимите стеклянную горку из центрифуги трубки и дайте высохнуть в течение 20 минут в ламинарном капоте. Подготовленная стеклянная горка может храниться при -20 градусов до готовности к сканированию.
- Сканирование стеклянной горки с помощью сканера микроаррей при флуоресценции 555 нм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Когда нейтрофилы добавляются в микроаррей биочастиц, нейтрофилы, которые контактируют с скоплениями биочастиц, активируются и инициируют реакцию роятся. Биочастица microarray была проверена с помощью замедленного флуоресцентной микроскопии для отслеживания миграции нейтрофилов к скоплениям биочастиц(Видео S1). Миграция отдельных ядер нейтрофилов отслеживается по мере их миграции в скопление биочастиц. Когда нейтрофилы достигают скопления биочастиц, их ядра пересекаются с другими ядрами в кластере. Таким образом, с помощью этого метода невозможно точно отследить нейтрофиля в кластере. Кластеры биочастиц Зимосан а также кишечной палочки приводят к порождению нейтрофилов. Для получения наших результатов на рисунке 2B используются данные из стай нейтрофилов, генерируемых частицами кишечной палочки. На рисунке 3 и на других панелях рисунка 2 используются нейтрофильные стаи, генерируемые частицами зимосана. Полученные результаты свидетельствуют о том, что биочастицы групп стимулирует активацию нейтрофилов, когда нейтрофил связался с скоплением, что в конечном итоге привело к образованию стабильных нейтрофиловых стай вокруг каждого кластера после 30-60 мин(рисунок 2А, сверху). В отличие от этого, нейтрофилы не показали коллективной миграции в отсутствие скоплений биочастиц(рисунок 2A, дно, и видео S2). Используя флуоресцентную интенсивность окрашенных ядер нейтрофилов на уровне 405 нм, средний размер нейтрофила стаи около 30 мкм диаметром E. coli биочастиц ы было установлено, что 1490 и 680 мкм2 (средний SD, Рисунок 2B, сверху). Интенсивность флуоресценции данного региона, представляющего интерес, где нет скоплений биочастиц, была примерно постоянной с течением времени, что подтвердило отсутствие коллективной миграции в этой обстановке(рисунок 2B, дно). Следы миграции нейтрофилов показывают, что нейтрофилы сходились на скоплении биочастиц, когда один присутствовал(рисунок 2C, сверху). И наоборот, в системе управления не наблюдалось сближения(рисунок 2C,вниз). Была измерена скорость (расстояние/время) роятся и неактивированные нейтрофилы и обнаружена статистически значимая разница в распределении скорости (ANOVA, p zlt; 0.0001), как показано на рисунке 2D. Средняя скорость для роевых нейтрофилов составила 20,6 и 13,0 мкм/мин (средняя скорость для контрольных нейтрофилов, то средняя - 2,0 и 2,2 мкм/мин.
Кроме того, была проанализирована концентрация 16 белков, выделяемых нейтрофилов во время рояния(рисунок 3). Была рассчитана нормализованная концентрация каждого белка в разных точках времени в процессе рояния (т 0, 0,5, 1 и 3 ч), где нормализованная концентрация (C - Cмин)/ (Cmax - Cmin). 10 белков увеличилось в концентрации во всем роятся. Эти белки были адипсин, галектин-3, ГРОА, ИЛ-6Р, МИП-1а, ММП-8, ММП-9, Нидоген-1, TIMP-1 и TLR2. Два белка (пентраксин 3 и РАНК) снизили концентрацию во всем роятся. Остальные четыре белка (кластерин, PF4, RANTES и Trappin-2) увеличились в течение первого часа роя, но затем уменьшились. Другими словами, концентрации этих белков "spiked" во время роятся. Из 16 выявленных белков, 12 белков были выявлены в нашей предыдущей публикации5. Adipsin, galectin-3, nidogen-1, pentraxin 3, TIMP-1 и TLR2, были показаны как кишит-специфические, в то время как кластерин, IL-6R, MMP-8, и MMP-9, RANK, и trappin-2 не были5.
Рисунок 1: Производство биочастиц ы микроаррей. Кремниевая пластина, покрытая отрицательным фоторезистом, подвергается воздействию УФ-излучения через хромированную фотомаску(A). После того, как кремниевая пластина запекается и развивается, на поверхности кремниевой пластины остается фоторезисточенный узор. Это мастер (B). В чашке Петри, смесь PDMS добавляется в верхней части мастер пластины. PDMS вылечивается на ночь при 65 градусах По Цельсию, чтобы сформировать форму PDMS(C). Плесень PDMS вырезана из мастер и биопсия удар используется для удара из отдельных марок PDMS (D). Марка PDMS(E) покрыта раствором CP(F). Марка переворачивается на тонкий слой решения CP(G). После инкубации в решении CP в течение 1 ч, марка смыта на стеклянную горку, чтобы удалить избыток CP. Восемь марок затем нажата на чистую стеклянную горку с весом 5,6 и 0,1 г, выровнены с визуализацией прокладки (H). При удалении штампа остается шаблон CP(I). Плита PDMS с предрезаны скважинами прилипает к стеклянной горке(J). Затем, биочастица раствор добавляется поперек шаблона CP (K). Отрицательно заряженные биочастицы связываются с положительно заряженным полиэлектролитом с помощью электростатического взаимодействия. Избыток раствора биочастиц смывается, оставляя биочастицы узорчатые поверх шаблона CP(L). (M) Флуоресцентное изображение слоя CP помечены FITC (Шкала баров 50 мкм, большое изображение; Шкала бар 25 мкм, всет/всет). (N) Флуоресцентное изображение узорчатых биочастиц зимосана, спряженных с Texas Red (шкала бар 100 мкм, большое изображение; Шкала бар 50 мкм, всет/всет). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Рост роя нейтрофилов вокруг скоплений биочастиц. При наличии скоплений биочастиц нейтрофилы подвергаются коллективной миграции в сторону скоплений биочастиц (дно,контроль нейтрофилов). Когда биочастиц нет, нейтрофилы не выполняют коллективную миграцию. (A) В присутствии лизозановых скоплений биочастиц, нейтрофилы образуют стаи в 30 мин. Без скоплений биочастиц не образуются стаи (шкала баров - 50 мкм). (B) Нейтрофильные стаи растут до среднего размера 1490 и 680 мкм2 (средний sD) около 30 мкм диаметра E. coli биочастиц кластеров. Контроль нейтрофилов обладают постоянной плотностью, что не соответствует росту роя (ANOVA, р-л; 0,0001, n - 32 нейтрофильных стаи, N - 1 донор, бары ошибок - стандартное отклонение). (C) Следы роятся нейтрофилов сходятся на зимозан биочастиц кластеров, в то время как контроль нейтрофилов не показывают сходящихся точки (Шкала баров 50 мкм). (D) Нейтрофилы роятся к цели zymosan имеют средней скорости 20.6 и 13.0 мкм/мин (средний SD), в то время как контроль нейтрофилов имеют средняя скорость 2,0 и 2,2 мкм/мин. Каждый счет на тепловой карте представляет собой нейтрофил с заданной мгновенной скоростью в данный момент времени. Эти тепловые карты являются репрезентативными для одного эксперимента (n no 1 рой; N No 1 донор; АНОВА, 6114 - роятся нейтрофилы, 32 116 - контроль ный нейтрофилы, стр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Бесплатные посредники, освобожденные роятся нейтрофиловами. Нейтрофил роя влияет на производство различных белков с течением времени. Концентрация белка была измерена на уровне 0, 0,5, 1 и 3 ч. Точки данных были оснащены сглажеными splines (No 0,05). Эти белки, как правило, следуют одной из трех характерных тенденций: уменьшение с течением времени, увеличение с течением времени, или пики около 1 ч, а затем уменьшение (Ошибка баров и стандартное отклонение; n - 3 репликации; N No 1 донор). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Видео S1: Нейтрофил роятся в направлении кластеров биочастиц зимосан. Нейтрофильные ядра показаны синим цветом. Цели зимосана отмечены красными кругами (шкала бар 50 мкм; первоначальное время приобретения 60 мин). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Видео S2: Неактивированная нейтрофил случайная миграция. Ядра нейтрофилов показаны синим цветом (шкала бар 50 мкм; первоначальное время приобретения 60 мин). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы разработали платформу микроштамповки для генерации однородных массивов биочастиц для стимулирования роятся в пробирке нейтрофила. In vitro характер нашей платформы позволяет нам обойти осложнения, которые возникают с in vivo роятся эксперименты, а именно плохая способность анализировать посредников освобождены роятся нейтрофилов5. Кроме того, модели in vivo обычно выполняются у грызунов11,12,13,15,22, 23, или зебрафиш11,12,15,23. Наша платформа использует человека нейтрофилов, что позволяет нам более непосредственно интерпретировать наши результаты в контексте болезни человека, хотя некоторые сходства между мышью и человека нейтрофилов наблюдались5,11. Кроме того, мы поддерживаем пространственно-контролируемую среду, которая отличает нашу платформу от моделей in vivo, обеспечивая высокий уровень воспроизводимости, который облегчает анализ коллективной миграции нейтрофилов человека, а также сбор и анализ посредников, выпущенных роящимися нейтрофиловами.
Во время разработки нашего протокола микроштамповки возникло несколько проблем, которые требовали тщательного устранения неполадок. Во-первых, CP, используемый для микроштамповки, является высоко гидрофильной, а марки PDMS гидрофобны. Поскольку CP не имеет высокого сродства к PDMS, наша процедура была тщательно разработана, чтобы избежать образования пузырьков и способствовать смачиванию. Сначала грунтовка штамп с CP в то время как лицом вверх (шаг 1.8), мы свести к минимуму образование пузырьков между CP и штамп. Затем марка переворачивается на слой CP и инкубируется в течение 1 ч. Это долгое время инкубации гарантирует, что каждый раздел марки смачивается. Во-вторых, процесс удаления избытка CP перед штамповкой на чистом стеклянном слайде (шаг 1.11) может быть непоследовательным. При выполнении шага 1.11 штамп должен быть тщательно изучен. Когда шаблон начинает становиться видимым, штамп готов к шагу 1.12. Кроме того, необходимое время вакуума для высыхания марок (шаг 1.12) может варьироваться. Это в первую очередь зависит от погоды. В теплый, влажный день требуется 2 мин вакуумного времени. В прохладный, сухой день достаточно 1 мин вакуумного времени.
Мы показали, что нейтрофилы от здоровых доноров образуют стабильные стаи вокруг скоплений биочастиц. С замедленной флуоресцентной микроскопией, мы можем количественно размер роя и отслеживать нейтрофил миграции, которая позволяет нам анализировать нейтрофил хемотаксис количественно5. Например, мы ранее показали, что эта платформа может быть использована для расчета химиотаксического индекса (CI, cosine угла между нейтрофил скорость вектор и вектор положения между нейтрофил и ближайший кластер биочастиц), скорость (расстояние нейтрофилов путешествует делится на время), радиальная скорость (скорость умноженная НА CI), и общая разница в нейтрифиле. В отличие от большинства исследований in vitro24,25,26, наша платформа не имеет искусственного хемотаксического градиента, поэтому нейтрофил межклеточной связи является единственной движущей силой миграции нейтрофилов. Кроме того, супернатант, генерируемый роевыми нейтрофиловами, легко доступен. Мы можем собирать и анализировать супернатант для межклеточных посредников, выпущенных нейтрофиловами без вмешательства других типов клеток, которые присутствуют в vivo. Было отмечено 16 белков, экспрессия которых во время рояния может быть охарактеризована как одна из трех тенденций: увеличение (10 белков), уменьшение (два белка) и шип (четыре белка). Шесть из этих белков подтвердили ранее сообщалось тенденции во время роятся с течением времени5. Некоторые из выявленных белков ранее были показаны, чтобы быть роя-специфических, в то время как другие были выражены дифферециально активированных не-роя нейтрофилов5. Белки, которые увеличиваются в концентрации с течением времени, вероятно, связаны с про-воспаление ответ. Некоторые белки, которые увеличивают концентрацию с течением времени, уже известно, что участвуют в провоспалительных ответ (например, галектин-3 и MMP-9)27,28. Взаимосвязь между другими белками и воспалением менее хорошо понимается. Белки, которые всплеск или уменьшение во время роя может быть вовлечен в регуляции воспаления. Тем не менее, дальнейшие исследования необходимы, чтобы понять роль воспаления многих белков, которые дифферепрециально выражены во время рояния. Анализ выпущенных посредников наряду с миграцией нейтрофилов может помочь нам лучше понять сложную картину воспаления и как нейтрофилы влияют на окружающие ткани во время роя.
В будущих исследованиях наша платформа может быть использована для тщательного изучения способности нездоровых нейтрофилов генерировать стабильные стаи вокруг узорчатых скоплений биочастиц. Различные медицинские условия были связаны с нейтрофилов, в том числе сепсис3, травма6, и рак1,8,17,18, что свидетельствует о нейтрофилы у этих пациентов, возможно, изменены функции. Эта платформа может быть использована для изучения различий между межклеточными посредниками, выпущенными здоровыми и нездоровыми нейтрофилями. Кроме того, эта платформа может быть изменена на шаблон живых микробов и использоваться для анализа нейтрофилов ответ на живые микробы в пробирке.
В заключение мы разработали новую платформу для анализа нейтрофилов роятся в пробирке. Высококонтролируемый характер нашей платформы позволяет нам смягчить проблемы, возникающие во время экспериментов по потеплению виво-нейтрофиля. Нейтрофил роятся на микроарре биочастицы легко поддается количественной оценке с помощью флуоресцентной микроскопии замедленного потока. Кроме того, мы можем собирать посредников, выпущенных нейтрофиловами без вмешательства других тканей, которые присутствуют в vivo. Эта платформа может быть использована в будущих исследованиях для количественной оценки различий между миграционным поведением нейтрофилов от здоровых и нездоровых доноров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана финансированием со стороны Уильяма Г. Лоури Департамента химической и биомолекулярной инженерии и Всеобъемлющего онкологического центра в Университете штата Огайо. Данные, представленные в этом докладе, были получены из изображений, обработанных с помощью Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane), доступных в Campus Microscopy and Imaging Facility, Университет штата Огайо. Этот объект поддерживается частично грантом P30 CA016058, Национальным институтом рака, Bethesda, MD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "The Big Easy" EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18001 | Magnet to use with neutrophil isolation kit |
| Cell Incubator | Okolab | 777057437 / 77057343 | Okolab cage incubator for temperature and CO2 control |
| EasySep Human Neutrophil Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17957 | Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils |
| Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | MEA54010 / MEF55037 | Inverted research microscope |
| Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array |
| Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch | Sigma Aldrich | Z708925 | To cut PDMS stamps |
| HetaSep | STEMCELL Technologies | 7906 | Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nucleus fluorescent stain |
| Human L1000 Array | Raybiotech Inc. | AAH-BLG-1000-4 | High density array to detect 1000 human proteins |
| Human Serum Albumin (HSA) | Sigma Aldrich | A5843 | Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils |
| Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | To resuspend isolated neutrophils |
| K2-EDTA tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-657-32 | Tubes for blood collection |
| Low Reflective Chrome Photomask | Front Range Photomask | N/A | Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D) |
| Microarray Scanner | Perkin Elmer | ASCNGX00 | Fluorescence reader of protein patterned microdomains |
| Microscopy Image Analsysis Software - Imaris | Bitplane | 9.3.0 | Software for automatic cell tracking analysis |
| NiS Elements Advanced Research Software Package | Nikon Instruments | MQS31100 | Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation |
| Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) | Sigma Aldrich | P3069-10MG | 30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution |
| SecureSeal 8-well Imaging Spacer | Grace Bio-Labs | 654008 | 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer |
| Silicon Wafer | University Wafer | 590 | Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test |
| Spin Coater | Laurell | WS-650MZ-23NPPB | Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer |
| SU-8 2025 | MicroChem | 2025 | Negative photoresist to make silicon master wafer |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer |
| Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) | Dow | 1673921 | 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells |
| UV Exposure Masking System | Kloé | UV-KUB 2 | Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light |
| Water | Thermo Fisher Scientific | A1287303 | High quality water to dilute bioparticles |
| Zetag 8185 | BASF | 8185 | Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water |
| Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | Z2843 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array |
References
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).
- Ellett, F., et al. Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay. Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).
- Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century. The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).
- Reátegui, E., et al. Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).
- Morgan, A. S. Risk factors for infection in the trauma patient. Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).
- Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. 566, 553-557 (2019).
- Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L.
- Grayson, P. C., Kaplan, M. J. At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases. Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).
- Lämmermann, T. In the eye of the neutrophil swarm--navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues. Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).
- Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
- de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
- Lämmermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
- Lämmermann, T. Cell migration: Arraying neutrophils in swarms. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).
- Powell, D. R., Huttenlocher, A.
- Uribe-querol, E., Rosales, C. Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin. Journal of Immunology Research. 2015, (2015).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection. Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).
- Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors. Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).
- Thomas, C. J., Schroder, K. Pattern recognition receptor function in neutrophils. Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).
- Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. The role of TLRs in neutrophil activation. Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).
- Tan, S. Y., Weninger, W. Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk. Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).
- Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro. European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).
- Afonso, P. V., et al. LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis. Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).
- Gounni, A. S., et al. In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo. The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).
- Dumic, J., Dabelic, S., Flögel, M.
- Padmanabhan Iyer, R., et al. Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart. Proteomics - Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).
