Summary
Este protocolo genera microarrays de biopartículas que proporcionan enjambre de neutrófilos controlado espacialmente. Proporciona un fácil acceso a los mediadores que los neutrófilos liberan durante la migración y permite el análisis cuantitativo de imágenes.
Abstract
El enjambre de neutrófilos es un proceso cooperativo por el cual los neutrófilos cierran un sitio de infección y promueven la reorganización de los tejidos. El enjambre se ha estudiado clásicamente in vivo en modelos animales que muestran patrones característicos de migración celular. Sin embargo, los modelos in vivo tienen varias limitaciones, incluyendo mediadores intercelulares que son difíciles de acceder y analizar, así como la incapacidad de analizar directamente a los neutrófilos humanos. Debido a estas limitaciones, es necesario una plataforma in vitro que estudia el enjambre de neutrófilos humanos y proporcione un fácil acceso a las señales moleculares generadas durante el enjambre. Aquí, un proceso de microsello de varios pasos se utiliza para generar un microarray de biopartículas que estimula el enjambre imitando una infección in vivo. El microarray de biopartículas induce a los neutrófilos a enjambre de una manera controlada y estable. En el microarray, los neutrófilos aumentan en velocidad y forman enjambres estables alrededor de los cúmulos de biopartículas. Además, se analizó el sobrenadante generado por los neutrófilos y se descubrió que 16 proteínas se expresaron diferencialmente en el transcurso del enjambre. Esta plataforma de enjambre in vitro facilita el análisis directo de la migración de neutrófilos y la liberación de proteínas de una manera reproducible y controlada espacialmente.
Introduction
Los neutrófilos, el glóbulo blanco más abundante en el torrente sanguíneo1, están ganando atención como posibles dianas diagnósticas y terapéuticas2,3 porque pueden estar involucrados en una variedad de condiciones médicas incluyendo gota4, sepsis3, trauma5,6, cáncer1,7,8, y diversas enfermedades autoinmunes5,9. El enjambre de neutrófilos es un proceso multietapa, estrechamenteregulado con una complejidad que lo convierte en un foco particularmente interesante de estudio5,10,11. Durante el enjambre, los neutrófilos aíslan un sitio de inflamación del tejido sano circundante5,10,11. La regulación adecuada del enjambre de neutrófilos es esencial para promover la cicatrización de heridas y, en última instancia, la resolución de inflamación5,12. El enjambre de neutrófilos se ha estudiado principalmente in vivo en roedores12,13,14,15 y pez cebra10,11,12,15 modelos. Sin embargo, la naturaleza de estos modelos animales in vivo da lugar a limitaciones5. Por ejemplo, los mediadores liberados por neutrófilos durante el enjambre no son fácilmente accesibles para el análisis5. Además, hay muchas fuentes potenciales para un mediador dado in vivo, por lo que un experimento in vivo debe introducir una deficiencia genética para inhibir la producción celular y / o la interacción con el fin de investigar el papel de ese mediador en un proceso dado13. Un experimento in vitro elude esta complicación al permitir la observación de neutrófilos sin el contexto de células adicionales. Además, la investigación que describe la migración coordinada por neutrófilos humanos es limitada16. En una plataforma de enjambre in vitro, los neutrófilos humanos pueden ser analizados directamente. Una plataforma de enjambre in vitro podría ampliar los conocimientos adquiridos a partir de estudios in vivo proporcionando oportunidades para llenar las lagunas que dejan las limitaciones de los estudios in vivo.
Para hacer frente a la necesidad de una plataforma in vitro que imita el enjambre de neutrófilos in vivo, desarrollamos una plataforma de microsello que nos permite patrones de microarrays de biopartículas que estimulan el enjambre de neutrófilos de una manera controlada espacialmente. Generamos microarrays de biopartículas en portaobjetos de vidrio en un proceso de dos pasos. En primer lugar, utilizamos microestampado para generar un microarray de puntos de polielectrolito catiónico (CP). En segundo lugar, añadimos una solución de biopartículas que se adhieren a los puntos CP a través de la interacción electrostática. Al crear primero el patrón de la capa CP, podemos patrón selectivo de biopartículas cargadas negativamente para generar el patrón de enjambre de neutrófilos deseado. La capa cargada positivamente contiene las biopartículas cargadas negativamente a través del vigoroso paso de lavado que elimina las biopartículas de las áreas en el tobogán de vidrio que no tienen el CP. Tiene una carga superficial muy alta que inmoviliza las biopartículas del tamaño de un micron al portaobjetos de vidrio, inhibiendo así a los neutrófilos de eliminar las partículas de la posición patrón en el portaobjetos de vidrio. Esto da como resultado racimos de biopartículas dispuestos en un microarray. Cuando añadimos neutrófilos al microarray, formaron enjambres estables alrededor de los cúmulos de biopartículas. A través del seguimiento de la migración de neutrófilos, descubrimos que los neutrófilos enjambres migran activamente hacia los cúmulos de biopartículas. Además, utilizamos esta plataforma para analizar ciertos mediadores que los neutrófilos liberan durante el enjambre. Encontramos 16 mediadores que se expresan diferencialmente durante el enjambre. Sus concentraciones siguen tres tendencias generales a lo largo del tiempo: aumento, disminución o pico. Nuestra plataforma de enjambre de neutrófilos in vitro facilita el análisis del enjambre de neutrófilos humanos controlado espacialmente, así como la recopilación y análisis de mediadores liberados por enjambre de neutrófilos. En una publicación anterior, demostramos que los pacientes con ciertas condiciones médicas (trauma, enfermedad autoinmune y sepsis), tenían neutrófilos que funcionaban de manera diferente a los de los donantes sanos5. En futuros estudios de investigación, nuestra plataforma podría utilizarse para analizar la función de neutrófilos entre una variedad de poblaciones de pacientes. Esta plataforma puede analizar cuantitativamente la compleja coordinación involucrada en el enjambre de neutrófilos. Se pueden realizar estudios adicionales para proporcionar información sobre la función neutrófila de una población de pacientes específica o la respuesta de neutrófilos a un patógeno de interés.
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Protocol
Los autores reconocen a los voluntarios sanos que amablemente donaron su sangre. Los especímenes de sangre se obtuvieron después del consentimiento informado de los voluntarios de acuerdo con el protocolo de la Junta de Revisión Institucional (IRB) #2018H0268 revisado por el Comité de Ciencias Biomédicas de la Universidad Estatal de Ohio.
1. Microfabricación de microarray de biopartículas
- Usando procedimientos de fotolitografía estándar, genere la oblea de silicio maestra.
- Genere una prueba del diseño deseado utilizando un software de diseño asistido por ordenador (CAD) y, a continuación, envíelo a un fabricante de fotomáscaras para producir una fotomáscara cromada. El diseño utilizado aquí es de 4 mm x 4 mm de matrices rectangulares de 30 mm de diámetro rellenadas en círculos con un espaciado de centro a centro de 150 m. Este diseño se puede modificar como se desee para diferentes aplicaciones.
- Espírese una capa de 40 m de espesor de un fotorresistente negativo sobre una oblea de silicio. Hornee la oblea a 65oC durante 5 min y 95oC durante 10 min.
- Exponga la oblea a la luz UV a través de una fotomascarilla cromada con 150–160 mJ/cm2 (Figura 1A).
- Hornee la oblea a 65oC durante 5 min y 95oC durante 10 min. Sumergir la oblea en el desarrollador fotorresistente durante 10 min y enjuagar con alcohol isopropílico. En esta etapa, el patrón debe ser visible en la oblea(Figura 1B).
- Mezclar a fondo una proporción de 10:1 de prepolímero de polidimetilsiloxano y su agente de curado (es decir, 20 g de prepolímero y 2 g de agente de curado) y verter la mezcla de polidimetilsiloxano no curado (PDMS) sobre la oblea maestra en una placa Petri(Figura 1C).
- Trate al vacío la mezcla PDMS no curada hasta que no haya burbujas de aire presentes sobre la oblea maestra. Curar a 65oC durante la noche.
- Utilice un bisturí para cortar alrededor del exterior de la sección estampada de la oblea y retire lentamente la losa PDMS curada. Coloque la losa PDMS en una tabla de corte limpia con el lado estampado hacia arriba(Figura 1D).
- Repartir sellos individuales de la losa PDMS con un punzón de biopsia de 8 mm(Figura 1E). Para un portaobjetos de vidrio, se necesitarán ocho sellos.
- Coloque cada sello boca abajo en la cinta adhesiva para eliminar los restos.
- De antemano, prepare una solución de 1,6 mg/ml de CP en agua.
- Añadir la cantidad adecuada de polvo de CP al agua (por ejemplo, 0,8 g a 500 ml).
- Mezclar en una placa de agitación a temperatura ambiente durante la noche, o hasta que todo el sólido se disuelva en el agua. La solución de CP se puede almacenar a temperatura ambiente durante 6 meses.
- Si se desea, hacer la solución de CP fluorescente mediante la adición de poli-L-lisina etiquetado con isotiocianato de fluoresceína (PLL-FITC).
- Aliquot a unos 10 ml de la solución CP. Añadir una pequeña cantidad de PLL-FITC (0,05 mg) al volumen alícundo. La cantidad se puede modificar para ajustar el brillo de la fluorescencia como se desee.
- Vortex la solución CP etiquetada con FITC para 20 s, o hasta que la solución sea de un color amarillo pálido uniforme. Proteger de la luz y almacenar a 4 oC durante un máximo de 1 mes.
- Con los sellos boca arriba, prepara cada sello con 100 l de solución de 1,6 mg/ml de CP, asegurando que no se formen burbujas de aire entre la solución CP y el sello(Figura 1F).
- Invierta los sellos en una capa de solución CP(Figura 1G).
- Retire los sellos de la solución CP después de 1 h.
- Atraviese cada sello húmedo boca abajo sobre un portaobjetos de vidrio limpio de 6 a 8 veces para eliminar el exceso de líquido.
- Tratar al vacío los sellos durante 1-2 min.
- Adherir un espaciador de imágenes de ocho pozos y 9 mm de diámetro en la parte superior de una corredera de vidrio limpio como guía para la colocación de sellos. Con este espaciador, cada diapositiva de vidrio puede tener ocho microarrays.
- Coloque un sello boca abajo en la diapositiva de vidrio en el centro de cada pocal del espaciador de imágenes (es decir, utilice ocho sellos en total).
- Coloque un peso equilibrado de 5,6 x 0,1 g encima de cada sello y permita 10 minutos para el estampado(Figura 1H). Se requiere un peso equilibrado para asegurar que el sello se presiona uniformemente sobre el portaobjetos de vidrio y promover la transferencia uniforme del CP a la diapositiva de vidrio.
- Retire los pesos y sellos de la diapositiva de vidrio(Figura 1I). Deje que la capa CP se seque a temperatura ambiente durante 24 horas antes de añadir las biopartículas, como se describe en el paso 1.17. Si el CP está etiquetado con FITC, la eficacia del estampado se puede comprobar en este punto con un microscopio fluorescente a 488 nm antes de continuar con el paso 1.17(Figura 1M).
- Corte una losa PDMS en blanco al tamaño del espaciador de imágenes y utilice el punzón de biopsia de 8 mm para crear pozos en PDMS que se alineen con los pozos de un espaciador de imágenes. Adherir la losa PDMS a la diapositiva de vidrio con el espaciador de imágenes(Figura 1J).
- Descongelar una solución de biopartículas (p. ej., E. coli o zymosan) y diluir a 500 g/ml en agua para inyección (WFI).
NOTA: No es necesario opsonizar las biopartículas. Los receptores de superficie de neutrófilos reconocen directamente moléculas en estas biopartículas19,20,21. - Añadir 100 l de solución de biopartículas a cada pozo PDMS en la diapositiva de vidrio(Figura 1K).
- Mece el tobogán de cristal durante 30 min.
- Enjuague bien los pozos con agua. El microarray de biopartículas se puede almacenar en un ambiente libre de polvo a 4 oC durante un máximo de 3 meses. En este punto, el patrón debe comprobarse con un microscopio fluorescente a 594 nm antes de proceder al paso 2.1(Figura 1N).
2. Preparación de muestras
- Recoger al menos 2 ml de sangre fresca en tubos K2-EDTA del donante deseado. El rendimiento esperado de los neutrófilos es de 1–2 x 106 células/1 ml de sangre entera. El ensayo de imágenes requiere aproximadamente 1,5 x 105 neutrófilos, y el análisis del sobrenadante requiere 1 x 106 neutrófilos. Use la sangre dentro de las 4 h.
- Separe los glóbulos rojos (RBR) añadiendo un agente de agregación de eritrocitos en una proporción de 1:5 a toda la sangre. Espere 45 minutos para que una capa translúcida (capa de color) se separe de la capa de RBR.
- Retire la capa buffy y lávela con solución salina tamponada de fosfato (PBS) usando una capa buffy de 1 ml: 9 mL PBS.
- Centrífuga durante 5 min a 190 x g y 20oC.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet a 5 x 107 células/ml.
- Utilice un kit de selección inmunomagnética negativo para aislar a los neutrófilos.
- Añadir 50 l de cóctel de anticuerpos/1 ml de suspensión celular. Espere 10 minutos.
- Añadir 100 l de perlas magnéticas/1 ml de suspensión celular. Espere 10 minutos.
- Agregue la suspensión de la celda a un tubo de fondo redondo y colóquelo en un imán cilíndrico. Espere 10 minutos.
- Vierta el sobrenadante en un tubo centrífugo. Agregue hasta 10 mL de PBS. Centrífuga durante 5 min a 190 x g y 20oC.
- Aspirar sobrenadante. Resuspenda el pellet blanco en la IMDM con albúmina sérica humana al 0,4%.
- Núcleos de manchas con 20 g/ml Hoechst 33342 durante 10 min a 37 oC.
- Añadir 5 ml de IMDM con 0,4% de albúmina sérica humana para enjuagar. Centrífuga durante 5 min a 190 x g y 20oC.
- Resuspender células a 7,5 x 105 células/ml en IMDM con 0,4% de albúmina sérica humana.
- Añadir 100 l de la suspensión celular a un pozo PDMS que contenga un microarray de biopartículas. Asegúrese de que la suspensión de la celda es convexa sobre la parte superior del pozo PDMS y no contiene ninguna burbuja.
- Cierre con un cubreobjetos de 12 mm de diámetro. Cubra bien la abertura del PDMS con un cubreobjetos de 12 mm de diámetro. Presione suavemente sobre la cubierta con pinzas para que el exceso de suspensión celular escape al borde del pozo. Use un pañuelo para eliminar el exceso de suspensión celular.
3. Ejecución del ensayo y el análisis de imágenes
- Cargue la matriz de micropartículas con células en la estación de imágenes de células vivas con un microscopio equipado con una incubadora de jaulas establecida en 37 oC, 5% CO2y 90% de humedad relativa.
- Utilice la microscopía fluorescente y de campo brillante para grabar imágenes a un aumento de 10x cada 10 s a 405 nm, 594 nm y campo brillante. En un experimento típico, las imágenes se recogen hasta 2 h.
- Utilice un software automatizado de seguimiento celular para realizar un seguimiento de la migración de neutrófilos individuales hacia el clúster de biopartículas.
- Utilice el modo de regresión automática de un software de seguimiento de celdas de detección de puntos. Establezca el radio de la mancha en 5 m (el tamaño aproximado de un núcleo de neutrófilos). Establezca la longitud mínima de la pista en 120 s y un tamaño de separación máximo de un fotograma.
- A partir de los datos generados por el software de seguimiento de la célula, extraer los archivos que contienen la posición y la velocidad de los neutrófilos. Estos archivos se pueden utilizar con un software de gráficos para generar pistas de migración de neutrófilos (Figura 2C) y un mapa de calor de la velocidad frente al tiempo (Figura 2D), respectivamente.
- Utilice las imágenes fluorescentes de 405 nm para realizar un seguimiento del tamaño del enjambre a lo largo del tiempo en un software de análisis de imágenes de su elección.
- Definir regiones de interés (ROI) alrededor de cada grupo de biopartículas donde los neutrófilos se enjambre. Mantenga el mismo tamaño de ROI para analizar cada clúster de biopartículas.
- Analice la intensidad fluorescente media de las imágenes de 405 nm dentro de cada ROI a lo largo del tiempo.
- Genere una curva de calibración de la intensidad fluorescente media para el tamaño del enjambre tomando medidas manuales en varios tamaños de enjambre desde 0 m2 hasta el tamaño máximo del enjambre. Utilice esta calibración para calcular el tamaño del enjambre a lo largo del tiempo.
4. Recolección de supernadantes y detección de proteínas
- Incubar los neutrófilos en los polos que contienen el microarray de biopartículas a 37oC y 5%co2 durante 3 h. Tome muestras en los puntos de tiempo deseados. Normalmente, las muestras se tomarán a 0, 0,5, 1 y 3 h. Para superar el límite de detección del ensayo de matriz de proteínas, se utilizó todo el volumen de sobrenadante de un solo pozo (200 l) para cada punto de tiempo. Cada punto de tiempo fue analizado por triplicado.
- Usando un microscopio de campo brillante, verifique que se formen enjambres en el microarray.
- Aspirar el sobrenadante con una pipeta de 200 ml y cargar en un tubo de filtro de centrífuga de 0,45 m.
- Centrifugar el sobrenadante a 190 x g y 20 oC durante 5 min y recoger el volumen filtrado.
- Almacene las muestras a -80 oC hasta el tiempo de procesamiento.
- Utilice un kit de microarray que detecte una gama de proteínas humanas para procesar muestras.
- Agregue 200 ml de cada muestra a un tubo de diálisis separado suministrado con el kit.
- Coloque los tubos de diálisis en un vaso de precipitados que contenga al menos 500 ml de PBS (pH a 8,0). Revuelva suavemente sobre una placa de agitación durante al menos 3 h a 4 oC. Cambie el PBS en el vaso de precipitados y repita este paso.
- Transfiera cada muestra a un tubo de centrífuga limpio y centrífuga a 9.000 x g durante 5 min para eliminar los precipitados. Transfiera cada sobrenadante a un tubo limpio.
- Biotinylacada cada muestra añadiendo 36 l de reactivo de etiquetado 1x del kit por cada 1 mg de proteína total en la muestra dializada a 180 ml de muestra dializada. Incubar a 20oC durante 30 min. Mezclar suavemente cada 5 min.
- Añadir 3 ml de solución de tope provista sin el kit en cada tubo de muestra. Transfiera cada muestra a un tubo de diálisis nuevo y repita los pasos 4.6.2–4.6.3. En esta etapa, la muestra se puede almacenar a -20 oC o -80 oC hasta que esté listo para continuar.
- El portaobjetos de vidrio suministrado con el kit se almacena a -20 oC. Deje que llegue a temperatura ambiente. Coloque el portaobjetos de vidrio montado en una campana de flujo laminar durante 1-2 h a temperatura ambiente.
- Añadir 400 l del tampón de bloqueo suministrado con el kit en cada poca del tobogán de vidrio montado. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
- Centrifugar las muestras preparadas durante 5 min a 9.000 x g para eliminar precipitados o partículas. Diluir 5x con tampón de bloqueo.
- Retire el búfer de bloqueo de cada poca. Añadir 400 l de las muestras diluidas en los pozos apropiados. Incubar durante 2 h a temperatura ambiente mientras se balancea.
- Decantar las muestras de cada pozo. Lavar 3x con 800 sl del tampón de lavado 1x que proporcioné con el kit a temperatura ambiente durante 5 minutos cada uno mientras mece.
- En un recipiente limpio, sumerja el portaobjetos de vidrio montado en 1x tampón de lavado I. Lavar 2x a temperatura ambiente durante 5 minutos cada uno mientras se balancea.
- Agregue 400 s l de 1 x estreptavidina conjugada con Cy3 a cada submatriz. Cubierta con tiras adhesivas de plástico. Proteger de la luz para el resto del protocolo.
- Incubar durante 2 h a temperatura ambiente mientras se balancea.
- Decantar la solución y desmontar la corredera de vidrio de las cámaras de muestra.
- En el tubo centrífugo de 30 ml suministrado con el kit, agregue cuidadosamente el portaobjetos de vidrio y suficiente tampón de lavado 1x I para cubrir el portaobjetos de vidrio. Lavar 3 x durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente mientras se balancea.
- En el tubo centrífugo de 30 ml, lave 2x con 1x tampón de lavado II durante 5 minutos cada uno a temperatura ambiente mientras se balancea.
- Lavar el portaobjetos de vidrio con 30 ml de ddH2O durante 5 min. Retire el portaobjetos de vidrio del tubo de centrífuga y deje secar durante 20 minutos en una campana de flujo laminar. El portaobjetos de vidrio preparado puede almacenarse a -20 oC hasta que esté listo para escanear.
- Escanee el portaobjetos de vidrio con un escáner de microarray a una emisión de fluorescencia de 555 nm.
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Representative Results
Cuando se añaden neutrófilos al microarray de biopartículas, los neutrófilos que contactan con los cúmulos de biopartículas se activan e inician la respuesta de enjambre. El microarray de biopartículas fue validado mediante microscopía fluorescente de lapso de tiempo para rastrear la migración de neutrófilos hacia los cúmulos de biopartículas (Video S1). La migración de núcleos de neutrófilos individuales se realiza un seguimiento a medida que migran hacia el cúmulo de biopartículas. Cuando los neutrófilos alcanzan el cúmulo de biopartículas, sus núcleos se superponen con otros núcleos del cúmulo. Por lo tanto, no es posible realizar un seguimiento preciso de un neutrófilo dentro del cúmulo utilizando este método. Los cúmulos de biopartículas de Zymosan y E. coli dan como resultado la generación de enjambres de neutrófilos. Para nuestros resultados, la Figura 2B utiliza datos de enjambres de neutrófilos generados por partículas de E. coli. La Figura 3 y los otros paneles de la Figura 2 utilizan enjambres de neutrófilos generados por partículas cimosas. Los resultados obtenidos demuestran que los cúmulos de biopartículas estimulan la activación de neutrófilos cuando un neutrófilo contactó con el racimo, lo que finalmente condujo a la formación de enjambres de neutrófilos estables alrededor de cada racimo después de 30-60 min(Figura 2A,parte superior). Por el contrario, los neutrófilos no mostraron migración colectiva en ausencia de cúmulos de biopartículas(Figura 2A,fondo y Vídeo S2). Utilizando la intensidad fluorescente de los núcleos neutrófilos manchados a 405 nm, se encontró que el tamaño medio de enjambre de neutrófilos alrededor de 30 m de diámetro de los cúmulos de biopartículas de E. coli era de 1.490 a 680 m2 (media de SD, Figura 2B,superior). La intensidad de fluorescencia de una región determinada de interés donde no hay cúmulos de biopartículas presentes fue aproximadamente constante en el tiempo, lo que confirmó la ausencia de migración colectiva en este entorno(Figura 2B,fondo). Las pistas de migración de neutrófilos muestran que los neutrófilos convergieron en un grupo de biopartículas cuando uno estaba presente(Figura 2C,superior). Por el contrario, no se observó convergencia en el sistema de control(Figura 2C,inferior). Se midió la velocidad (distancia recorrida/tiempo) de los neutrófilos enjambres y no activados y se encontró una diferencia estadísticamente significativa en las distribuciones de velocidad (ANOVA, p < 0.0001), como se muestra en la Figura 2D. La velocidad media de los neutrófilos enjambres fue de 20,6 a 13,0 m/min (media de SD), y la velocidad media de los neutrófilos de control fue de 2,0 a 2,2 m/min.
Además, se analizó la concentración de 16 proteínas que los neutrófilos liberaron durante el enjambre(Figura 3). Se calculó la concentración normalizada de cada proteína en diferentes puntos de tiempo en el proceso de enjambre (t a 0, 0,5, 1 y 3 h), donde la concentración normalizada es (C – Cmin) / (Cmax – Cmin). 10 proteínas aumentaron en concentración a lo largo del enjambre. Estas proteínas eran adipsina, galectina-3, GROa, IL-6R, MIP-1a, MMP-8, MMP-9, Nidogen-1, TIMP-1 y TLR2. Dos proteínas (pentraxina 3 y RANK) disminuyeron en concentración a lo largo del enjambre. Las cuatro proteínas restantes (clusterin, PF4, RANTES y Trappin-2) aumentaron durante la primera hora de enjambre, pero disminuyeron a partir de entonces. En otras palabras, las concentraciones de esas proteínas "pincharon" durante el enjambre. De las 16 proteínas identificadas, 12 proteínas fueron identificadas en nuestra publicación anterior5. Se demostró que Adipsin, galectin-3, nidogen-1, pentraxin 3, TIMP-1 y TLR2 eran específicos de enjambre, mientras que clusterin, IL-6R, MMP-8 y MMP-9, RANK y trappin-2 no eran5.
Figura 1: Producción de microarray de biopartículas. Una oblea de silicio recubierta con fotorresistente negativo se expone a la luz UV a través de una fotomáscara cromada (A). Después de que la oblea de silicio se hornea y se desarrolla, un patrón de fotorresistente permanece en la superficie de la oblea de silicio. Esta es la oblea maestra (B). En un plato de Petri, se añade una mezcla PDMS a la parte superior de la oblea maestra. El PDMS se cura durante la noche a 65 oC para formar el molde pdmS (C). El molde PDMS se corta de la oblea maestra y se utiliza un punzón de biopsia para perforar sellos PDMS individuales (D). Un sello PDMS (E) está recubierto con la solución CP (F). El sello se invierte en una fina capa de solución CP (G). Después de incubar en la solución de CP durante 1 h, el sello se borra en una diapositiva de vidrio para eliminar el exceso de CP. Ocho sellos se presionan en un portaobjetos de vidrio limpio con un peso de 5,6 x 0,1 g, alineado con un espaciador de imágenes (H). Cuando se quita el sello, un patrón CP permanece (I). Una losa PDMS con pozos precortados se adhiere a la diapositiva de vidrio (J). A continuación, se añade una solución de biopartículas sobre el patrón CP (K). Las biopartículas cargadas negativamente se unen al polielectrolito cargado positivamente a través de la interacción electrostática. El exceso de solución de biopartículas se lava, dejando las biopartículas modeladas sobre el patrón CP (L). (M) Imagen fluorescente de la capa CP etiquetada con FITC (Barras de escala de 50 m, imagen grande; Barra de escala a 25 m, reinserción). (N) Imagen fluorescente de biopartículas cimosas estampadas conjugadas con Texas Red (Barra de escala de 100 m, imagen grande; Barra de escala a 50 m, reinserción). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Crecimiento de enjambre de neutrófilos alrededor de los cúmulos de biopartículas. En presencia de cúmulos de biopartículas, los neutrófilos se someten a una migración colectiva hacia los cúmulos de biopartículas (inferior,controlar a los neutrófilos). Cuando no hay biopartículas presentes, los neutrófilos no realizan la migración colectiva. (A) En presencia de cúmulos de biopartículas cimosas, los neutrófilos forman enjambres en 30 min. Sin racimos de biopartículas, no se forman enjambres (barras de escala de 50 m). (B) Los enjambres de neutrófilos crecen hasta un tamaño medio de 1.490 x 680 m2 (media de SD) alrededor de los racimos de biopartículas de E. coli de 30 m de diámetro. Los neutrófilos de control presentan una densidad constante que no corresponde a ningún crecimiento de enjambre (ANOVA, p < 0.0001, n a 32 enjambres de neutrófilos, N a 1 donante, barras de error , desviación estándar). (C) Las pistas de neutrófilos enjambres convergen en los cúmulos de biopartículas cimosas, mientras que los neutrófilos de control no muestran ningún punto convergente (barras de escala de 50 m). (D) Los neutrófilos que se enjambren hacia un objetivo cimosa no tiene una velocidad media de 20,6 a 13,0 m/min (media de SD), mientras que los neutrófilos de control tienen una velocidad media de 2,0 a 2,2 m/min. Cada recuento en el mapa de calor representa un neutrófilo con la velocidad instantánea dada en el momento dado. Estos mapas de calor son representativos de un experimento (n 1 enjambre; N a 1 donante; ANOVA, 6.114 - Neutrófilos enjambres, 32.116 - controlar neutrófilos, p < 0.0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Mediadores libres liberados por neutrófilos enjambres. El enjambre de neutrófilos afecta la producción de varias proteínas con el tiempo. La concentración de proteínas se midió a 0, 0,5, 1 y 3 h. Los puntos de datos se han equipado con splines de suavizado (a 0,05). Estas proteínas tienden a seguir una de las tres tendencias características: disminuir con el tiempo, aumentar con el tiempo, o escupir alrededor de 1 h y luego disminuir (Barras de error - desviación estándar; n a 3 réplicas; N.o 1 donante). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video S1: Enjambre de neutrófilos hacia los cúmulos de biopartículas cimosas. Los núcleos neutrófilos se muestran en azul. Los objetivos de Zymosan están marcados con círculos rojos (barra de escala de 50 m; tiempo de adquisición original a 60 min). Haga clic aquí para descargar este video.
Video S2: Migración aleatoria de neutrófilos no activados. Los núcleos neutrófilos se muestran en azul (barra de escala a 50 m; tiempo de adquisición original a 60 min). Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
Desarrollamos una plataforma de microsello para generar matrices uniformes de biopartículas para estimular el enjambre de neutrófilos in vitro. La naturaleza in vitro de nuestra plataforma nos permite eludir las complicaciones que surgen con los experimentos in vivo enjambre, a saber, la mala capacidad para analizar los mediadores liberados por los neutrófilos enjambres5. Además, los modelos in vivo se realizan típicamente en roedores11,12,13,15,22,23, o pez cebra11,12,15,23. Nuestra plataforma utiliza neutrófilos humanos, lo que nos permite interpretar más directamente nuestros resultados en el contexto de la enfermedad humana, aunque se han observado ciertas similitudes entre el ratón y los neutrófilos humanos5,11. Además, mantenemos un entorno de enjambre controlado espacialmente que distingue nuestra plataforma de los modelos in vivo proporcionando un alto nivel de reproducibilidad que facilita el análisis de la migración colectiva de neutrófilos humanos, así como la recopilación y análisis de mediadores liberados por neutrófilos enjambres.
Durante el desarrollo de nuestro protocolo de microsello, surgieron varios desafíos que requirieron una solución de problemas cuidadosa. En primer lugar, el CP utilizado para el microsello es altamente hidrófilo, y los sellos PDMS son hidrófobos. Debido a que el CP no tiene una alta afinidad por PDMS, nuestro procedimiento fue cuidadosamente diseñado para evitar la formación de burbujas y promover la humectación. Al cebar primero el sello con CP mientras está boca arriba (paso 1.8), minimizamos la formación de burbujas entre el CP y el sello. El sello se invierte en una capa de CP y se incuba durante 1 h. Este largo tiempo de incubación asegura que cada sección del sello esté mojada. En segundo lugar, el proceso de eliminación del exceso de CP antes de estampar en una diapositiva de vidrio limpio (paso 1.11) puede ser inconsistente. Durante la realización del paso 1.11, el sello debe ser examinado cuidadosamente. Cuando el patrón comienza a ser visible, el sello está listo para el paso 1.12. Además, el tiempo de vacío necesario para secar los sellos (paso 1.12) puede variar. Esto depende principalmente del clima. En un día cálido y húmedo, se requiere 2 minutos de tiempo de vacío. En un día fresco y seco, 1 min de tiempo de vacío es suficiente.
Hemos demostrado que los neutrófilos de donantes sanos forman enjambres estables alrededor de los cúmulos de biopartículas. Con la microscopía fluorescente de lapso de tiempo, podemos cuantificar el tamaño del enjambre y realizar un seguimiento de la migración de neutrófilos, lo que nos permite analizar cuantitativamente la quimiotaxis de neutrófilos5. Por ejemplo, hemos demostrado previamente que esta plataforma se puede utilizar para calcular el índice quimiotáctico (CI, el coseno del ángulo entre el vector de velocidad de neutrófilos y el vector de posición entre el neutrófilo y el cúmulo debiopartículas más cercano), la velocidad (distancia que el neutrófilos recorre dividido por el tiempo), la velocidad radial (la velocidad multiplicada por CI) y la distancia total recorrida (la diferencia entre la posición inicial y la posición final de neutrófilos) de la posición de neutrofnófilos individual. A diferencia de la mayoría de los estudios in vitro24,25,26, nuestra plataforma no tiene un gradiente quimiotáctico artificial, por lo que la comunicación intercelular de neutrófilos es la única fuerza motriz de la migración de neutrófilos. Además, el sobrenadante generado por los neutrófilos enjambres es fácilmente accesible. Podemos recopilar y analizar el sobrenadante para mediadores intercelulares liberados por neutrófilos sin interferencia de otros tipos de células que están presentes in vivo. Se observaron 16 proteínas cuya expresión durante el enjambre podría describirse como una de las tres tendencias: aumento (10 proteínas), disminución (dos proteínas) y pico (cuatro proteínas). Seis de estas proteínas confirmaron las tendencias previamente reportadas durante el enjambre a lo largo del tiempo5. Algunas de las proteínas identificadas se demostraron anteriormente que eran específicas del enjambre, mientras que otras fueron expresadas diferencialmente por neutrófilos activados no enjambres5. Las proteínas que aumentan la concentración con el tiempo probablemente se asocian con la respuesta pro-inflamación. Algunas de las proteínas que aumentan la concentración con el tiempo ya se sabe que están implicadas en la respuesta proinflamatoria (por ejemplo, galectina-3 y MMP-9)27,28. La relación entre otras proteínas y la inflamación es menos bien entendida. Las proteínas que pican o disminuyen durante el enjambre pueden estar involucradas en la regulación de la inflamación. Sin embargo, es necesario seguir investigando para entender el papel en la inflamación de muchas de las proteínas que se expresan diferencialmente durante el enjambre. Analizar los mediadores liberados junto con la migración de neutrófilos puede ayudarnos a comprender mejor el complejo panorama de la inflamación y cómo los neutrófilos afectan el tejido circundante durante el enjambre.
En estudios futuros, nuestra plataforma se puede utilizar para estudiar a fondo la capacidad de los neutrófilos no saludables para generar enjambres estables alrededor de los cúmulos de biopartículas con patrones. Varias condiciones médicas se han relacionado con neutrófilos, incluyendo sepsis3, trauma6, y el cáncer1,8,17,18, que sugiere que los neutrófilos en estos pacientes pueden haber alterado la función. Esta plataforma se puede utilizar para examinar las diferencias entre los mediadores intercelulares liberados por neutrófilos sanos e insalubres. Además, esta plataforma podría ser modificada para patrones de microbios vivos y utilizada para analizar la respuesta de neutrófilos a microbios vivos in vitro.
En conclusión, hemos desarrollado una plataforma novedosa para analizar el enjambre de neutrófilos in vitro. La naturaleza altamente controlada de nuestra plataforma nos permite mitigar los problemas que surgen durante los experimentos de enjambre de neutrófilos in vivo. El enjambre de neutrófilos en un microarray de biopartículas es fácilmente cuantificable a través de microscopía fluorescente de lapso de tiempo. Además, podemos recoger los mediadores liberados por los neutrófilos sin la interferencia de otros tejidos que están presentes in vivo. Esta plataforma se puede utilizar en futuras investigaciones para cuantificar las diferencias entre los comportamientos migratorios de los neutrófilos de donantes sanos y no saludables.
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Disclosures
Los autores no declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos del Departamento William G. Lowrie de Ingeniería Química y Biomolecular y el Centro Integral del Cáncer de la Universidad Estatal de Ohio. Los datos presentados en este informe provienen de imágenes procesadas con Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) disponibles en el Centro de Microscopía e Imagen del Campus, La Universidad Estatal de Ohio. Esta instalación es apoyada en parte por la subvención P30 CA016058, Instituto Nacional del Cáncer, Bethesda, MD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "The Big Easy" EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18001 | Magnet to use with neutrophil isolation kit |
| Cell Incubator | Okolab | 777057437 / 77057343 | Okolab cage incubator for temperature and CO2 control |
| EasySep Human Neutrophil Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17957 | Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils |
| Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | MEA54010 / MEF55037 | Inverted research microscope |
| Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array |
| Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch | Sigma Aldrich | Z708925 | To cut PDMS stamps |
| HetaSep | STEMCELL Technologies | 7906 | Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nucleus fluorescent stain |
| Human L1000 Array | Raybiotech Inc. | AAH-BLG-1000-4 | High density array to detect 1000 human proteins |
| Human Serum Albumin (HSA) | Sigma Aldrich | A5843 | Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils |
| Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | To resuspend isolated neutrophils |
| K2-EDTA tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-657-32 | Tubes for blood collection |
| Low Reflective Chrome Photomask | Front Range Photomask | N/A | Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D) |
| Microarray Scanner | Perkin Elmer | ASCNGX00 | Fluorescence reader of protein patterned microdomains |
| Microscopy Image Analsysis Software - Imaris | Bitplane | 9.3.0 | Software for automatic cell tracking analysis |
| NiS Elements Advanced Research Software Package | Nikon Instruments | MQS31100 | Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation |
| Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) | Sigma Aldrich | P3069-10MG | 30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution |
| SecureSeal 8-well Imaging Spacer | Grace Bio-Labs | 654008 | 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer |
| Silicon Wafer | University Wafer | 590 | Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test |
| Spin Coater | Laurell | WS-650MZ-23NPPB | Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer |
| SU-8 2025 | MicroChem | 2025 | Negative photoresist to make silicon master wafer |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer |
| Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) | Dow | 1673921 | 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells |
| UV Exposure Masking System | Kloé | UV-KUB 2 | Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light |
| Water | Thermo Fisher Scientific | A1287303 | High quality water to dilute bioparticles |
| Zetag 8185 | BASF | 8185 | Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water |
| Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | Z2843 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array |
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