Summary
Цель юаней протокола состоит в том, чтобы сплавить два различных типа клеток для создания гибридных ячеек. Флуоресценция микроскопии анализ сросшиеся клетки используется для отслеживания клетки происхождения клеточных органелл. Этот асссможно использовать для изучения того, как клеточная структура и функция реагируют на возмущение путем слияния клеток.
Abstract
В липидных мембранах жизнь пространственно разделена, чтобы позволить изолированное образование различных молекулярных состояний внутри клеток и органелл. Слияние клеток представляет собой слияние двух или более клеток для формирования одной клетки. Здесь мы предоставляем протокол для слияния клеток двух различных типов клеток. Сросые гибридные клетки обогащаются сортировкой на основе цитометрии потока, за которой следует флуоресцентная микроскопия структуры и функции гибридных клеток. Флуоресцентно помеченные белки, генерируемые при редактировании генома, образуются внутри сброшенных клеток, что позволяет идентифицировать клеточные структуры на основе выбросов флуоресценции и ссылаться на тип клеточного происхождения. Этот надежный и общий метод может быть применен к различным типам клеток или органеллам, представляющим интерес, чтобы понять клеточную структуру и функции по целому ряду фундаментальных биологических вопросов.
Introduction
Гомеостасическое поддержание клеточной структуры имеет решающее значение для жизни. Клетки имеют характерные морфологии, субклеточные числа органелл и внутренний биохимический состав. Понимание того, как эти фундаментальные свойства генерируются и как они идут наперекосяк во время болезни, требуют лабораторных инструментов, чтобы возмутить их.
Слияние клеток представляет собой слияние двух или более отдельных клеток. Слияние клеток, возможно, имеет решающее значение для появления эукариотической жизни1. В организме человека, слияние клеток является относительно редким, происходящих во время ограниченных условий развития и типов тканей, таких как во время оплодотворения или формирования мышц, костей и плаценты2. Этот протокол описывает индукцию слияние клеток в линиях клеток культуры ткани с дифференциально флуоресцентно обозначенными органеллами, как инструмент для того чтобы понять механизмы контролируя структуру и функцию клетки.
В пробирке индуцированных клеточных клеток слияния имеет центральное значение для производства моноклональных антител3, важный инструмент для биологических исследований и лечения заболеваний. Слияние клеток также было использовано, чтобы задать много различных фундаментальных клеточных биологических вопросов о доминировании клеточного цикла4, aneuploidy5,6, клеточное перепрограммирование7,8, ремонт поврежденных нейронов9, вирусное пролиферации10, апоптоз11, tumorigenesis12, цитоскелетная динамика13, и мембранного синтеза14,15. Лабораторные методы, чтобы вызвать слияние клеток16,17,18,19 индуцировать липидной мембраны объединения через физическое слияние двух двух слоев в один. Слияние клеток может быть вызвано электричеством18, вирусные методы17, термоплазмонное отопление20, трансгенное выражение19, и химических веществ, включая полиэтиленгликоль (PEG)16,21,22.
Центросомами являются микротубулы, организуя центры, контролирующие клеточную форму, подвижность, поляризацию и деление23. Центросомные корни представляют собой волокнистые структуры, простирающиеся от центросомы, содержащие белок rootletin24 (кодируется геном CROCC). Недавно мы использовали клеточные клетки слияния, чтобы понять, как центросомы положение и число меняется внутри гетерокарионов по отношению к родительским клеткам24. Обоснование использования этого метода заключается в отслеживании клетки происхождения корней в гетерокарионе после слияния дифференциально флуоресцентно отмеченных родительских клеток, и, таким образом, к изображению слиянию и делению органеллы. Флуоресцентно помеченные белки rootletin-meGFP или rootletin-mScarlet-I создаются путем редактирования генома в отдельных клеточных линиях, которые затем сливается с PEG-опосредованного синтеза клеток. Мы описываем использование клеточных красителей(Таблица материалов) для идентификации сросшиеся клетки по цитометрии потока и последующей флуоресценционной микроскопии идентификации центросомной клетки происхождения и морфологии (Рисунок 1). Этот подход является надежным и уникальным методом для изучения того, как основные изменения в клеточном состоянии, включая число органелл посягают на гомеостаз клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Дифференциальная флуоресцентная клеточной маркировки
- Ген пометки с CRISPR Cas9
- Используйте редактирование генома CRISPR Cas9, чтобы пометить rootletin (или другие гены, представляющие интерес) с флуоресцентными белками meGFP или mScarlet-I в линиях раковых клеток человека.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные протоколы для редактирования генома покрыты в другом месте24,25,26.
- Используйте редактирование генома CRISPR Cas9, чтобы пометить rootletin (или другие гены, представляющие интерес) с флуоресцентными белками meGFP или mScarlet-I в линиях раковых клеток человека.
- Флуоресцентная маркировка красителей
- Выращивайте раковые клетки Cal51 человека в модифицированной среде Орла (DMEM) Dulbecco, дополненной 10% сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS), L-глютамином и 100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина при 37 и 5% CO2 в увлажненном инкубаторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно обеспечить, чтобы клетки регулярно проверялись на отсутствие загрязнения микоплазмы, а также на идентичность клеточной линии. Не используйте клетки, которые были широко проложены в культуре (No gt;15 проходов). Клетки должны быть здоровыми и расти в геометрической прогрессии. Избегайте недотефности или чрезмерной выпуклости. - Семена каждого типа клеток (rootletin-meGFP, rootletin-mScarlet-I и родительские немаркированные клетки Cal51) так, что на следующий день для каждого образца присутствуют 6 х 106 ячеек, при выпуклости 70–90%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это приблизительно одна колба культуры T75 или одно тарелку 10 сантиметров в тип клетки. Родительские немаркированные ячейки необходимы в качестве отрицательного контроля позже в протоколе. Этот протокол позволяет вырабатывать 20 000 сросательных ячеек, но это число может быть увеличено за счет увеличения протокола с увеличением количества партий. - На следующий день, претеплый DMEM, трипсин и 1x фосфат-буферный солен (PBS), поместив их в водяную ванну при 37 градусах Цельсия.
- Вымойте rootletin-meGFP и rootletin-mScarlet-I клетки 2x в PBS путем заливки или аспирации от среднего и замены с 10 мл PBS.
- Этикетка Cal51 rootletin-meGFP клеток, добавив 500 Нм фиолетовый краситель клеток (Таблица материалов) в PBS в течение 1 мин при комнатной температуре (RT).
- Этикетка Cal51 rootletin-mScarlet-I клеток, добавив 200 нм гораздо красных клеток красителя (Таблица материалов) в PBS в течение 1 мин на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите образцы защищены от света, где это возможно после флуоресцентного окрашивания, чтобы избежать фотоотбелевания флуоресценции. - Остановите реакцию маркировки красителя, добавив 10 мл DMEM в течение 5 мин.
- Удалить немаркированные родительские клетки Cal51 из инкубатора (от шага 1.2.2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти ячейки будут использоваться позже в качестве немаркированных отрицательных элементов управления (шаг 3.3.2). - Вымойте все клетки один раз, выливая от роста среды и замены с 10 мл PBS.
- Налейте PBS и инкубировать в течение 5 минут в культурных условиях с 1 мл предварительно подогретого 1x трипсина.
- Перенесите клетки в пластиковую коническую трубку 15 мл и центрифугу при 1000 х г в течение 5 мин.
- Тщательно удалить и выбросить трипсин из клеточной гранулы с пипеткой.
- Аккуратно resuspend фиолетовый и далеко красный помечены клеточные гранулы в 1 мл PBS.
- Аккуратно приостановите родительские (нелюморометательные) клеточные гранулы в 1 мл DMEM и вернитесь в инкубатор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот образец не будет проходить слияние клеток, но будет использоваться позже во время цитометрии потока.
- Выращивайте раковые клетки Cal51 человека в модифицированной среде Орла (DMEM) Dulbecco, дополненной 10% сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS), L-глютамином и 100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина при 37 и 5% CO2 в увлажненном инкубаторе.
2. Слияние клеток
- Смешайте 3 х 106 фиолетовых помеченных клеток с 3 х 106 далеко красные помечены клетки в 15 мл трубки, мягко pipetting вместе 0,5 мл каждого типа клеток с помощью 1 мл пипетки.
- Центрифуги оставшиеся несмешанные клетки со ступени 2,1 на 1000 х г в течение 5 мин, затем слить PBS, resuspend гранулы в 1 мл DMEM и вернуться в инкубатор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшиеся несмешанные образцы с одной маркировкой будут использованы позднее в качестве отрицательного и компенсационного контроля в разделе 3 протокола. - Центрифуги смешанных клеток от шага 2,1 на 1000 х г в течение 5 минут и тщательно аспирации PBS с помощью 1 мл пипетка.
- Добавьте 0,7 мл 50% 1450 PEG раствор в dropwise моды на клетки гранулы (шаг 2.3) с помощью 1 мл пипетки в течение 30 с.
- Оставьте на 3,5 мин на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации с ПОМОЩЬю ПЭГ может быть оптимизировано в зависимости от типа клеток, хотя обратите внимание, что более длительное время инкубации увеличивает токсичность клеток. - Добавьте 10 мл безысыворотки DMEM dropwise на 30 с и оставьте в инкубаторе на 10 минут.
- Спин вниз на 1000 х г в течение 5 минут, отбросить супернатант, и повторно в 1 мл полной среде (DMEM, содержащий FBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Перейдите непосредственно к разделу 3. Существует токсичность, связанная с воздействием ПЭГ, за которым следует цитометрия потока и визуализация, поэтому держите клетки в культурных условиях как можно больше, быстро протекая между шагами.
3. Флуоресценция активированная сортировка клеток (FACS) для обогащения слитых ячеек
- Подготовьте все клетки для цитометрии потока, аккуратно пайпетируя каждый образец отдельно через фильтр 70 мкм в трубку FACS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Требуются четыре образца: слитые клетки, одномаркированные далеко красные клетки, одномаркированные фиолетовые клетки, немаркированные родительские клетки. После удаления из стерильной ткани культуры капот, клетки имеют возможность заразиться, так что свести к минимуму время воздействия образцов в нестерильной среде отсюда и далее. Клетки сортируются в полной среде DMEM. - Используйте цитометр, способный сортировать одноклеточные ячейки.
- Настройка сортировки ячейки для асептического сортировки. Выполняйте контроль качества прибора в порядке рекомендации производителя.
- Нарисуйте участок вперед рассеяния против бокового рассеяния и двойной различения участка.
- Создание ворот для идентификации сброшенных ячеек.
- Возбуждайте флуоресцентные красители на длинах волн 405 нм и 635 нм. Обнаружение на 450 нм и 660 нм (фиолетовые и дальнекрасные длины волн, соответственно). Участок далеко красный против фиолетовых длин волн.
- Запуск немаркированных родительских клеток через цитометр и записывать интенсивность флуоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Значения выше этого базового определить положительность для окрашивания красителя. - Выполнить одиночные помеченные фиолетовые клетки через цитометр. Подтвердите, что нет разлива фиолетового в далеком красном канале.
- Выполнить одинпомеченных далеких красных клеток через цитометр и подтвердить, что нет разлива далеко красный в фиолетовый канал.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для представленных репрезентативных данных клетки были отсортированы в 20 пси на сортировке, оборудованном соплом площадью 100 мкм. - Кратко запустите образец синтеза, чтобы подтвердить, что слитые ячейки видны с воротами, созданными в шаге 3.3.
- Выровнять сортировку поток централизованно в 8-хорошо изображения блюдо.
- FACS сортируют сросшиеся клетки, присутствующие в виде двойных положительных фиолетовых и далеко-красных помеченных клеток непосредственно в 8-колодское изображение блюдо, содержащее 100 л среды роста.
ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальное рекомендуемое количество клеток составляет 50 000 евро за 8-хорошо блюдо. Обеспечить работоспособность клеток во время сортировки. Клеточная стельность может влиять на здоровье клеток, поэтому держите клетки между 20-90% сортировки, сортируя соответствующее количество клеток для изображения блюда. Каждая отсортированная капля содержит приблизительно 3 нл оболочки жидкости. Убедитесь, что оболочка жидкости не значительно разбавить среды роста во время сортировки. - Непосредственно после сортировки, взять клетки обратно в инкубатор и оставить на 2 ч или на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приверженные клетки будут постепенно повторно придерживаться coverslip в течение этого периода, от сортировки вперед, и, следовательно, их морфология будет меняться с течением времени, если принимать непосредственно к микроскопу.
4. Иммунофлуоресцентное окрашивание и визуализация клеточных сплавов
ПРИМЕЧАНИЕ: Сброшенные клетки могут быть изображены жить или после фиксации и дальнейшего флуоресцентного окрашивания (или оба), в зависимости от экспериментов и измерений требуется.
- Визуализация живых клеток
- Замените среду роста с изображением среды без фенола красный (Таблица материалов) и перейти непосредственно к визуализации.
- Фиксация и окрашивание
- Приготовьте свежий 4% параформальдегида (PFA) в PBS.
- Исправьте клетки, инкубируя их в 100 qL 4% PFA в течение 15 мин на RT. Удалить PFA после 15 мин.
ПРЕДЕКТО: PFA является токсичным при вдыхании, поэтому этот шаг должен быть выполнен в дым капот с соответствующими средства индивидуальной защиты.
ПРИМЕЧАНИЕ: После фиксации эксперимент можно приложить и перезапустить позже, если потребуется. При необходимости храните образец при 4 градусах по Цельсию, защищенных от света. - Вымойте клетки 3x в 200 Л ПБС на RT.
- Пермябилизируемые клетки в течение 10 мин при РТ в 200 л 0,1% неионического сурфактанта(Таблица материалов)и 0,1% неионического моющего средства(Таблица материалов),разбавленных в PBS.
- Блок в 200 л 3% бычьего сыворотки альбумина в PBS в течение 30 минут на RT.
- Инкубировать антителами в 150 Л PBS, содержащими 3% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% неионического сурфактанта и 0,05% неионического моющего средства в течение 1 ч на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Основными антителами, используемыми для генерации репрезентативных результатов, являются флуоресцентно конъюгированные анти-GFP nanobody (используется при разбавлении 1:400) и флуоресцентно спряжение противмоголочного и наноа (используется в 1:500 разбавления). Они усиливают сигнал уже флуоресцентных белков. - Вымойте 2x в течение 5 минут в 300 Л ПБС, а затем оставить в 200 Л ПБС.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы отображаются в PBS. Образцы могут храниться при 4 градусах По Цельсию, защищенных от света.
- Приобретение изображения
- Приобретайте изображения с соответствующим флуоресцентным микроскопом, способным к четырехцветной визуализации (например, конфокальный, широкоугольный, структурированный подсветка).
- Возбуждают каналы meGFP и mScarlet-I с лазерами длиной 488 нм и длиной 561 нм соответственно. Установите детекторы для обнаружения на уровне 505-550 нм и 590-650 нм. Возбуждайте фиолетовые и гораздо красные красительные каналы с 405 нм и 633 нм лазеров, соответственно. Установите детекторы для обнаружения на уровне 430-500 нм и 660-750 нм.
- Эмпирически определить интенсивность лазера таким образом, что значительное фотоотбеление не происходит, и что клетки остаются здоровыми (если живой визуализации клеток).
- Эмпирически определить выигрыш так, что сигнал получается без насыщения или искусственного отсечения значений пикселей.
- Соберите данные о стеке, такие, чтобы изображения были трехмерными, охватывающими диапазон от 20–60 мкм с размером шага в 500 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения, показанные в репрезентативных данных, были получены либо confocal(рисунок 2B),Airyscan(Рисунок 2C) или структурированной микроскопией освещения(рисунок 2D). Каждая клетка является добросовестным гетерокарионом, если она содержит как фиолетовые, так и далекие красные красители, перекрывающиеся в цитоплазме.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Соответствующим образом помечены клетки видны во время потока цитометрии по флуоресценции сигнал выше, чем немаркированные контрольные элементы(Рисунок 2A). Ворота настроены на сортировку двойных положительных клеток, обогащая эту популяцию непосредственно в визуализацию блюд для дальнейшего микроскопического анализа. Сброшенные клетки обнаруживаются как отдельные двойные флуоресцентно положительные клетки и составляют около 1% населения.
Слияние вызывает значительные перестановки клеточной архитектуры путем смешивания двух клеток в одну(Рисунок 2B). Гетерокарионы идентифицируются на микроскопе как клетки, содержащие как флуоресцентные сигналы красителя, смешанные внутри одной клетки (без вмешательства плазменных мембран). Кроме того, два ядра могут быть видны в сброшенных клетках с помощью контраста яркого поля/дифференциального интерференции или флуоресценции. Обратите внимание, что триплоидные или другие, более высоко полиплоидные состояния возможны в дополнение к диплоидных слияний однако, и поэтому сигнал красителя двух цветов должны быть использованы для подтверждения личности ссоединенных клеток.
Структура и функция клеток дополнительно исследуются путем слияния клеток, содержащих MEGFP и mScarlet-I помеченных белков. Слияние приводит к удвоению числа центросомного внутри гетерокарионов в результате слияния двух клеток. Таким образом, если клетки с флуоресцентно маркированными центросомами слиты, то по крайней мере четыре перицентролярных вещества наблюдаются при флуоресцентном пометке (NEDD1-mRuby3; Рисунок 2C). Слияние клеток с эндогенно флуоресцентно помеченным корнелетином (rootletin-meGFP и rootletin-mScarlet-I) позволяет идентифицировать клетку происхождения каждой ценрозомы в гетерокарионе. Rootletin в центросомных корнях имеет ограниченный диффузионный оборот24, и поэтому присутствует как отчетливо цветные волокна в гетерокарионах, изображенных с флуоресценционной микроскопией (Рисунок 2D).
Рисунок 1: слияние клеток и флуоресценция изображений экспериментального рабочего процесса. Схема четырехступенчатого экспериментального рабочего процесса. (1) Две популяции клеток диффереприметизируются, с красителями и флуоресцентными белками синтеза. Cyan представляет окрашивание с фиолетовым красителем клетки и пурпурный представляет окрашивание с краисьми красных клеток. Зеленый цвет представляет пометки meGFP, а красный цвет – пометки mScarlet-I. (2) Клетки сливается через инкубацию с полиэтиленгликоль. (3) Сброшенные клетки обогащаются цитометрией потока, сортируя двойные флуоресцентно положительные клетки (далеко красные и фиолетовые). (4) Срослые клетки изображены флуоресценционной микроскопией, чтобы понять, как изменяются клеточные структуры и функции (изображение зеленых и красных каналов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Репрезентативное обогащение цитометрии и флуоресцентная визуализация сброшенных клеток. (A) Представитель gating стратегии, используемой в потоке цитометрии сортировки сброшенных ячеек. Сброшенные клетки, которые вдвойне флуоресцентны, указаны черным квадратом. (B) Представитель конфокальной флуоресценции микроскопии сросшиеся клетки, двойной маркировки с фиолетовыми и далеко красные красители. Показаны примеры успешно слитых ячеек, которые являются либо тетраплоидными, либо гексаплоидными (верхние и нижние панели соответственно). Шкала бар No 10 мкм. (C) Представитель живой клетки Airyscan confocal изображения центросом в одной сроской ячейки, содержащей эндогенно помечены центросомальные корни (rootletin-meGFP) и центросомный перицентролярный материал (NEDD1-mRuby3). Шкала бар No 1 мкм. (D) Клетки, выражающие эндогенно помечены rootletin-meGFP были слиты с клетками, выражающими эндогенно помечены rootletin-mScarlet-I. Клетки были зафиксированы и окрашены и изображены структурированной иллюминационной микроскопией. Показана максимально интенсивная z-проекция центросом в одной сросшной клетке. Шкала бар No 1 мкм. Панель D была изменена от Mahen24 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы демонстрируем поверхностный и экономичный протокол для сплавливки клеток и визуализации последующей архитектуры клеточных гибридов с помощью микроскопии, что занимает около двух дней от начала до конца. Критическими частями этого протокола являются обогащение срослых ячеек сортировкой клеток (протокольная секция 3) и тщательная проверка срослых клеток с помощью микроскопии (протокольная секция 4). Эти разделы гарантируют, что сброшенные клетки легко получаются и являются добросовестными гетерокарионами. Следует соблюдать концентрации и время инкубации. Например, при использовании в более высоких концентрациях или с более длительным временем инкубации, клеточные красители могут быть слишком яркими и насыщать детекторы во время цитометрии потока или флуоресценции микроскопии, или вызвать перекрестное излучение в зависимости от условий изображения. При отсутствии цитометра потока, другие технологии способны обогащать сброшенные клетки, в том числе двойной отбор антибиотиков27 и микрофлюидные устройства захвата28. Эти технологии либо медленнее, либо требуют более заказной экспериментальной установки, однако.
Другие методы клеточного синтеза имеют преимущества и недостатки по сравнению с описанным здесь протоколом. Электро-фьюжн или вирусной основе методов синтеза могут в некоторых случаях быть изображены с микроскопией во время слияния8,29, что делает их хорошими альтернативами, если предпочтительнее наблюдать сам процесс синтеза. Однако эти различные методы могут потребовать специализированного оборудования (например, электрофузионного оборудования или вирусных трансгенов). Все методы синтеза клеток имеют потенциал, чтобы посягать на здоровье клеток. Вирусные методы синтеза, как правило, опираются на продолжающееся выражение вирусных трансгенов, в отличие от преходящего возмущения, предоставляемого ПЭГ или электрофузией. Сотовый фусогенный потенциал и токсичность после воздействия ПЭГ является переменной в различных типах клеток27, и, следовательно, титрование времени инкубации ПЭГ может потребоваться (протокол шаг 2.4), признавая, что увеличение воздействия ПЭГ увеличивает гибель клеток30. Максимальное здоровье клеток имеет решающее значение, сохраняя время вне культурных условий к минимуму. Здоровье клеток можно проверить во время протокола путем измерения переднего рассеяния по сравнению с боком рассеяния на цитометре и путем наблюдения морфологии во время микроскопии.
Тщательное рассмотрение экспериментального дизайна, чтобы дифференциальная маркировка с флуоресцентными метками имеет важное значение. Самый простой дизайн использует две отдельные флуоресцентные этикетки. Тем не менее, эндогенно выраженные флуоресцентные белки синтеза часто имеют низкий уровень экспрессии и, следовательно, трудно однозначно обнаружить с помощью цитометрии потока или визуализации на уровне одной клетки. Мы представляем дизайн, который преодолевает это ограничение, включая четыре флуоресцентных метки с CRISPR Cas9-опосредованного редактирования генома и красителя на основе методов окрашивания. Флуоресцентные зонды должны иметь различные спектры выбросов, различимые друг от друга, и быть достаточно яркими, чтобы отличить от немаркированных клеток на одном уровне клеток. Зонды должны оставаться привязаны к клетке, а не рассеиваться извне. Необратимая привязка внутренне на субклеточном уровне не является существенной, но может быть желательно. Как только клетки сливаются, устойчивый обмен состояния клеточных компонентов может свободно происходить. Так как корни диффузионно стабильны, они позволяют отслеживать клеточной истории, определяя клетку происхождения данной центросомы. Возможная модификация метода заключается в том, чтобы пометить другие клеточные структуры, представляющие интерес, но устойчивые сборки имеют потенциал для смешивания после синтеза, в зависимости от скорости внутриклеточной динамики(рисунок 2C).
Слияние клеток вызывает уникальное изменение в клеточной архитектуре17,19,24, последствия которых до сих пор не до конца поняты. Это и ограничение протокола, и захватывающая область для дальнейшего исследования. Хотя ясно, что плазменные мембраны сливается в единую структуру в гетерокарионах31, как другие клеточные структуры реагируют плохо понимается. Слияние клеток может быть использовано для дальнейшего понимания того, как слияние и расщепление органелл регулируется путем визуализации дифферезационно обозначенных органелл24,32. Будущая работа с слиянием клеток может решить, как euploidy, органеллы номер и клеточные размеры посягает на функции клеток. Так как аномальное слияние клеток наблюдается в процессах заболевания, в опухолях33 и после вирусной инфекции10,17, этот протокол также используется для решения целого ряда вопросов в фундаментальной и прикладной биологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была профинансирована Wellcome Trust Генри Wellcome стипендий Р.М. (https://wellcome.ac.uk/grant номер 100090/12 /). Фонднера не принимала никакого значения в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. Мы благодарим Ашока Венкитарамана и Пола Френка за критические советы и рекомендации по проекту. Мы благодарим Кьяру Коссетти и Габриэлу Грондис-Котарба в Кембриджском институте медицинских исследований Потока Цитометрии объекта за отличную поддержку. Мы благодарим Лиама Кассидея, Томаса Миллера и Джанмарко Контино за коррективы рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | Sarstedt | 62554502 | |
| 37% formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope | Carl Zeiss | ||
| 8-well imaging dishes | Ibidi | 80826 | |
| Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cell Filters (70 μm) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody | NanoTag Biotechnologies | N1302-At565 | |
| L15 CO2 independent imaging medium | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| Phenol red free DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| Phosphate buffered saline (1x PBS) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1 L | ||
| Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| Polypropylene tubes | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | nonionic surfactant |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | nonionic detergent |
References
- Lane, N. Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).
- Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Rao, P. N., Johnson, R. T. Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis. Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instability in colorectal cancers. Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).
- Fournier, R. E., Ruddle, F. H. Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).
- Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).
- Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. Microfluidic control of cell pairing and fusion. Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).
- Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs. Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).
- Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. A primate virus generates transformed human cells by fusion. The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).
- Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis. Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).
- Duelli, D. M., et al. A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion. Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).
- Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins. Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).
- Lentz, B. R. PEG as a tool to gain insight into membrane fusion. European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).
- Lentz, B. R., Lee, J. K. Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release? Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).
- Pontecorvo, G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment. Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).
- Okada, Y. Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation. Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).
- Zimmermann, U. Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).
- Hu, C., et al. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).
- Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).
- Kao, K. N., Michayluk, M. R. A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts. Planta. 115 (4), 355-367 (1974).
- Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. Mechanisms of cell fusion. Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).
- Mahen, R., Venkitaraman, A. R. Pattern formation in centrosome assembly. Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).
- Mahen, R. Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence. PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).
- Mahen, R., et al. Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells. Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Yang, J., Shen, M. H. Polyethylene glycol-mediated cell fusion. Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).
- Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT). Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).
- Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies. Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).
- Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines. Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).
- Frye, L. D., Edidin, M. The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons. Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).
- Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin. FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).
- Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor. Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).
