Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

תא תא פיוז'ן של הגנום בעריכה קווי תאים עבור פרטורבציה של מבנה הסלולר ותפקוד

Published: December 7, 2019 doi: 10.3791/60550
Automatic Translation
1,2, 3
1Photonics Group, Department of Physics, Imperial College London, 2The Medical Research Council Cancer Unit, Hutchison/MRC Research Centre, Cambridge Biomedical Campus, University of Cambridge, 3Cambridge Institute for Medical Research, Cambridge Biomedical Campus, University of Cambridge

Summary

מטרת פרוטוקול זה היא לנתיך שני סוגי תאים שונים כדי ליצור תאים היברידיים. ניתוח מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית של תאים התמזגו משמש כדי לעקוב אחר התא של המקור של אורגלים הסלולר. ניתן להשתמש באפשרות זו כדי לחקור כיצד המבנה התאי והפונקציה מגיבים להפרעות באיחוי התאים.

Abstract

החיים מחולק למחיצות בתוך קרום השומנים כדי לאפשר היווצרות מבודדת של מצבים מולקולריים ברורים בתוך תאים ואורגלים. Fusion תא הוא מיזוג של שני תאים או יותר כדי ליצור תא בודד. כאן אנו מספקים פרוטוקול למיזוג תאים של שני סוגי תאים שונים. תאים היברידית התמזגו מועשרים על ידי מיון cy, מבוססי הזרמת הזרם, ואחריו מיקרוסקופ פלואורסצנטית של מבנה תאים היברידית ותפקוד. פלואור שתייגת חלבונים שנוצרו על ידי עריכת הגנום הם התמונה בתוך תאים התמזגו, המאפשר מבנים סלולריים להיות מזוהה מבוסס על פליטת הזריחה והפניה בחזרה לסוג התא של המקור. השיטה האיתנה והכללית יכולה להיות מוחלת על סוגי תאים שונים או על-ידי אורגלים של עניין, להבין את המבנה התאי והתפקוד על-פני מגוון של שאלות ביולוגיות בסיסיות.

Introduction

הומסטטי תחזוקה של מבנה הסלולר הוא קריטי לחיים. לתאים יש מורפולוגיות אופייניות, מספרי משנה-תאית וקומפוזיציה ביוכימית פנימית. הבנת האופן שבו מאפיינים בסיסיים אלה נוצרים וכיצד הם משתבש במהלך המחלה מחייב כלי מעבדה כדי לperturb אותם.

Fusion תא הוא המיזוג בין שני תאים נפרדים או יותר. היתוך תא אולי היה קריטי הופעתה של חיים איקריוטית1. בגוף האדם, פיוז'ן התא הוא נדיר יחסית, המתרחשים בנסיבות התפתחותיות מוגבלות סוגי רקמות, כגון במהלך הפריה או היווצרות של שריר, עצם השליה2. פרוטוקול זה מתאר את האינדוקציה של היתוך תא התא בקווי תרבות של רקמה עם שורות מפורטות בצורה מסודרת, ככלי להבנת המנגנונים השולטים במבנה התאים ובתפקוד.

בהשפעת מחוץ לגוף היתוך תא התא הוא מרכזי לייצור נוגדנים חד שבטיים3, כלי חשוב עבור מחקר ביולוגי וטיפול במחלות. הפיוז תא גם שימש כדי לשאול שאלות רבות שונות ביולוגית תא ביולוגי על מחזור התא הדומיננטיות4, אנאפלואידיה5,6, הסלולר מחדש7,8, תיקון של נוירונים פגומים9, ויראלי התפשטות10, אפופטוזיס11, tuמוריגנזה12, ציטושלד דינמיקה13, ו ממברנה פיוז'ן14,15. מעבדה מבוסס שיטות כדי לגרום היתוך תא תא16,17,18,19 לגרום לשומנים הממברנה ממברנה דרך המיזוג הפיזי של שני bilayers לתוך אחד. היתוך תא יכול להיגרם על ידי חשמל18, שיטות ויראלי מבוסס17, חימום תרמוטרמונית20, הביטוי הטרנסגנטי19, וכימיקלים כולל פוליאתילן גליקול (יתד)16,21,22.

הסנטזומים הם מרכזי ארגון השולטים בצורה התאית, בתנועתיות, בקיטוב ובחטיבה23. השורשים הסנטורזומוניים הם מבנים סיבי הארכת מ סנטרוזומים המכילים את החלבון שורטלטין24 (מקודד על ידי הגנים crocc). השתמשנו לאחרונה היתוך תא התא כדי להבין כיצד centrosome מיקום ומספר משתנה בתוך heterokaryons יחסית לתאי הורים24. הרציונל מאחורי השימוש בשיטה זו היא לעקוב אחר התא של המקור של שורשים בתוך הטרולויון לאחר היתוך של מתויג באופן שולי בתאי הורים מסומנים, ובכך היתוך אורגונל התמונה ביקוע. הפלואור מתויג בעזרת חלבונים שרוסטין-ממגה או שורטלטין-mScarlet-I נוצר על ידי עריכת הגנום בקווים נפרדים תאים אשר התמזגו אז על ידי היתוך תא יתד בתיווך. אנו מתארים את השימוש בצבעי תאים (טבלה של חומרים) כדי לזהות תאים התמזגו על ידי זרימה cy, ולאחר מכן זיהוי המיקרוסקופיה של מיקרוסקופ של תא של מקור ומורפולוגיה (איור 1). גישה זו היא שיטה איתנה וייחודית ללמוד כיצד השינויים העיקריים במצב הסלולר, כולל מספר ארגונית המגלגל על הומאוסטזיס התאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תא פלורסנט משלים התיוג

  1. התיוג הגנטי עם Cas9
    1. השתמש ב-CRISPR Cas9 הגנום עריכה לתייג שורטלטין (או גנים אחרים של עניין) עם חלבונים פלורסנט meGFP או mScarlet-I בתאי הסרטן האנושי.
      הערה: פרוטוקולים מפורטים עבור עריכת הגנום מכוסים במקום אחר24,25,26.
  2. תוויות צבע פלורסנט
    1. לגדול Cal51 תאים סרטניים אנושיים במדיום שונה של מדיום הנשר (DMEM) שיושלם עם 10% סרום עוברי (FBS), L-גלוטמין, ו 100 μg/mL פניצילין/סטרפטומיצין ב 37 ° צ' ו 5% CO2 באינקובטור מחולל.
      הערה: חשוב לוודא כי התאים נבדקים באופן קבוע להעדר זיהום mycoplasma, ולזהות קו התא. אין להשתמש בתאים שעברו בהרחבה בתרבות (> 15 מעברים). התאים חייבים להיות בריאים וגדלים באופן אקספוננציאלי. הימנע בשטף או בשטף.
    2. זרע כל סוג תא (וורטלטין-מגלוקס, שורטלטין-משני-אני והורי Cal51 תאים) כגון ~ 6 x 106 תאים נמצאים למחרת עבור כל דגימה, בשטף של 70 ל-90%.
      הערה: זה כ 1 T75 התרבות רקמה בקבוקון או 1 10 ס"מ צלחת לכל סוג תא. התאים הלא מתויגים של ההורים נדרשים כפקד שלילי בהמשך הפרוטוקול. פרוטוקול זה מאפשר ייצור של ~ 20,000 תאים התמזגו, אבל מספר זה יכול להיות מוגבר באמצעות שינוי גודל הפרוטוקול עם מספר גדל של אצוות.
    3. למחרת היום, DMEM לחמם את הבית, טריפסין ו-1x פוספט באגירה מלוחים (PBS) על ידי הצבת אותם באמבט מים ב 37 ° c.
    4. שטוף שורטלטין-מגלוקס ושורטלטין-מני תאים 2x בערוץ הpbs על ידי שפיכת או לשטוף את המדיום והחלפת עם 10 מ ל של PBS.
    5. תווית Cal51 ורטלטין-מגלוב תאים על ידי הוספת 500 ננומטר לצבוע תא (טבלת חומרים) ב-PBS עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    6. התווית Cal51 ורטלטין-משני תאי-I על-ידי הוספת 200 ננומטר לצביעת תא אדום רחוק (טבלת חומרים) ב-PBS עבור 1 דקות בשעה RT.
      הערה: לשמור דגימות מוגן מפני אור בכל מקום שניתן לאחר כתמים פלורסנט, כדי למנוע הלבנה של זריחה.
    7. להפסיק את התגובות תוויות הצבע על ידי הוספת 10 מ ל DMEM עבור 5 דקות.
    8. הסר תאים Cal51 הורים ללא תווית מהאינקובטור (משלב 1.2.2).
      הערה: תאים אלה ישמשו מאוחר יותר כפקדים שליליים שאינם מסומנים בתווית (step 3.3.2).
    9. לשטוף את כל התאים פעם אחת על ידי שפיכת הצמיחה בינונית והחלפה עם 10 מ ל של PBS.
    10. יוצקים את PBS ו-דגירה עבור 5 דקות בתנאי התרבות עם 1 מ ל של מחומם טרום טריפסין 1x.
    11. העברת תאים ל 15 מ"ל שפופרת פלסטיק חרוטי ו צנטריפוגה ב 1000 x g עבור 5 דקות.
    12. בזהירות להסיר ולמחוק טריפסין מתוך הגלולה תא עם פיפטה.
    13. השהה מחדש בעדינות את כדורי התאים הסגולים המוצגים באדום ובמרחק של 1 מ ל של PBS.
    14. השהה מחדש בעדינות את הגלולה של תא הורים (לא פלורסנט) ב-1 מ ל של DMEM וחזור לחממה.
      הערה: מדגם זה לא יעבור היתוך תא התא אך יהיה בשימוש מאוחר יותר במהלך הזרימה cy, לנסות.

2. תא תאים פיוז'ן

  1. מערבבים 3 x 106 תאים סגול מתויג עם 3 x 106 תאים אדומים הרבה מתויג בצינור 15 מ ל על ידי ליטוף בעדינות ביחד 0.5 mL של כל סוג תא באמצעות פיפטה 1 mL.
  2. צנטריפוגה את התאים הנותרים שלא התערבבו משלב 2.1 בשעה 1,000 x g עבור 5 דקות, ואז לשפוך את PBS, להשעות את הגלולה ב 1 מ ל של dmem ולחזור לחממה.
    הערה: הדגימות הנותרות שאינן מעורבות בתווית אחת ישמשו מאוחר יותר כפקדים שליליים ופיצוי בסעיף 3 של הפרוטוקול.
  3. צנטריפוגה את התאים המעורבים משלב 2.1 בשעה 1,000 x g עבור 5 דקות ובזהירות לאכול PBS באמצעות פיפטה 1 mL.
  4. הוסף 0.7 mL של 50% 1450 הפתרון יתד בצורה dropwise אל הגלולה תא (שלב 2.3) באמצעות פיפטה 1 mL על פני תקופה של 30 s.
  5. השאירו 3.5 דקות בשעה RT.
    הערה: דגירה זמן עם פג עשוי להיות ממוטב בהתאם לסוג התא, למרות הערה כי זמן הדגירה ארוך יותר מגביר רעילות התאים.
  6. הוסף 10 מ ל של הסרום-free DMEM dropwise עבור 30 s ולעזוב בחממה עבור 10 דקות.
  7. ספין למטה ב 1,000 x g עבור 5 דקות, למחוק supernatant, ולהשעות בעדינות 1 מ ל של בינוני מלא (dmem המכיל fbs).
    הערה: . המשך ישירות לאגף 3 יש רעילות הקשורים לחשיפה יתד ואחריו הזרמת cy, הדמיה, כך לשמור על תאים בתנאי התרבות ככל האפשר על ידי הליך במהירות בין שלבים.

3. מיון תאים פלואורסצנטית-מופעל (FACS) כדי להעשיר את התאים התמזגו

  1. הכינו את כל התאים להזרמת cy, בעדינות על ידי ליטוף כל מדגם בנפרד באמצעות מסנן 70 יקרומטר לתוך צינור facs.
    הערה: ארבע דגימות נדרשות: תאים מוהתמזגו, תאים אדומים הרחק מסומנים בודדים, תאים סגולים שסומנו בלבד, תאים הורים ללא תווית. לאחר שהוסר ממכסה המנוע של הרקמה הסטרילית, לתאים יש את היכולת להידבק, ולכן מזער את זמן החשיפה של דגימות לסביבה לא סטרילית מכאן ואילך. תאים ממוינים במדיום DMEM מלאה.
  2. השתמש cytometer מסוגל מיון תא יחיד.
    1. הגדר את סדרן התא עבור מיון אספטי. בצע את בקרת איכות המכשיר לפי המלצת היצרן.
    2. ציירו מגרש של פיזור לפנים לעומת פיזור בצד והעלילה האפליה מספק.
  3. ליצור שערים כדי לזהות תאים התמזגו.
    1. לרגש את צבעי פלורסנט באורכי גל של 405 ננומטר ו 635 ננומטר. זיהוי ב 450 ננומטר ו 660 nm (סגול ואורכי גל אדום, בהתאמה). מתווה אדום הרבה לעומת אורכי גל סגול.
    2. הפעל תאים הורים ללא תווית דרך cytometer ולהקליט את עוצמת הקרינה.
      הערה: ערכים מעל תוכנית בסיסית זו מגדירים חיוביות לצביעת צבע.
    3. הפעל בודד שמסומנת בתאים סגולים דרך הציטומטר. ודא כי אין לשפוך-מעל של סגול לתוך הערוץ האדום הרחוק.
    4. הפעל בודד מתויג תאים אדומים רחוק דרך cytometer וודא כי אין לשפוך-מעל של הרבה אדום לתוך הערוץ הסגול.
      הערה: עבור נתוני המייצג המוצג, תאים ממוינים ב 20 psi על סדרן מצויד זרבובית יקרומטר 100.
    5. הפעל בקצרה את דגימת ההיתוך כדי לוודא שהתאים התמזגו גלויים עם השערים שנוצרו בשלב 3.3.
  4. יישר את זרם המיון במיקום מרכזי לתוך צלחת הדמיה של 8 היטב.
  5. FACS מיון תאים התמזגו, הנוכחי כפול חיובי סגול ותאים המסומנת באדום הרבה ישירות לתוך הצלחת 8-להדמיה המכיל 100 μL של גידול בינוני.
    הערה: מספר התאים המקסימלי המומלץ הוא ~ 50,000 לכל מאכל 8-והכל. ודא שתקינות התא במהלך המיון. שטף התא יכול להשפיע על בריאות התא כך לשמור על תאים בין 20 ל 90% השטף לאחר מיון על ידי מיון מספר מתאים של תאים לצלחת ההדמיה. כל droplet ממוין מכיל כ-3 nL של נוזל נדן. ודא כי נוזל מעטפת אינו מדלל באופן משמעותי את מדיום הצמיחה במהלך מיון.
  6. ישירות לאחר מיון, לקחת תאים בחזרה לחממה ולעזוב > 2 h או לילה.
    הערה: תאים חסיד יהיה מחדש בהדרגה לדבוק שמיכות במהלך תקופה זו, מיון ואילך, ומכאן המבנה שלהם ישתנה לאורך זמן אם נלקח ישירות למיקרוסקופ.

4. מכשירי כתמים והדמיה של תא-תא Fusions

הערה: תאים התמזגו יכול להיות התמונה חי או לאחר קיבעון וכתמים פלורסנט נוסף (או שניהם), בהתאם לניסויים ומדידות הנדרשים.

  1. הדמיית תאים בשידור חי
    1. החלף בינונית צמיחה עם מדיום הדמיה ללא פנול אדום (לוח חומרים) ולהמשיך ישירות להדמיה.
  2. קיבוע וצביעת
    1. הכן טרי 4% פאראפורמלדהיד (בכיוון הבמה) ב-PBS.
    2. תקן את התאים על-ידי דגירה אותם ב-100 μL של 4% כלפי מע עבור 15 דקות ב-RT. הוצא את הכדורגלן לאחר 15 דקות.
      זהירות: הקליולית היא רעילה כאשר היא שאפה כך ששלב זה צריך להתבצע בתוך מכסה עם ציוד הגנה אישי מתאים.
      הערה: לאחר הקיבעון, ניתן להשהות את הניסוי ולהפעיל אותו מחדש במקרה הצורך. אחסן את המדגם ב -4 ° צ' מוגן מפני אור במידת הצורך.
    3. לשטוף את התאים 3x ב 200 μL של PBS ב RT.
    4. תאים הניתנים לחדירות עבור 10 דקות ב-RT ב 200 μL של 0.1% nonionic (טבלת חומרים) ו 0.1% nonionic אבקת (טבלת חומרים) מדולל ב-PBS.
    5. לחסום ב 200 μL של 3% בסרום שור הערוץ ב-PBS עבור 30 דקות ב-RT.
    6. דגירה עם נוגדנים ב-150 μL של PBS המכיל 3% בסרום בקר אלבומין ו 0.1% nonionic סורסטנט ו 0.05% nonionic ניקוי עבור 1 h ב RT.
      הערה: הנוגדנים העיקריים המשמשים כדי לייצר את התוצאות הנציגים הם fluorescently מעלה מעלה אנטי GFP ננוגוף (משמש ב 1:400 דילול), ו fluorescently מעלה מעלה אנטי mScarlet-I ננוגוף (משמש ב 1:500 דילול). אלה לשפר את האות של חלבונים כבר פלורסנט.
    7. לשטוף 2x עבור 5 דקות ב 300 μL של PBS ולאחר מכן לעזוב ב 200 μL של PBS.
      הערה: דגימות מתמונות מתמונות ב-PBS. ניתן לאחסן דגימות ב -4 ° c מוגן מפני אור.
  3. רכישת תמונה
    1. לרכוש תמונות עם מיקרוסקופ המתאים לקרינה פלואורסצנטית מסוגל הדמיה ארבעה צבעים (למשל, confocal וקד, שטח, תאורה מובנית).
    2. לרגש meGFP ו mScarlet-I עם 488 ננומטר ו 561 לייזרים באורך גל ננומטר, בהתאמה. הגדר גלאים כדי לזהות ב ~ 505-550 ננומטר ו ~ 590-650 ננומטר. לרגש סגול וצבע אדום הרחוק עם 405 ננומטר ו 633 לייזרים nm, בהתאמה. הגדר גלאים לזיהוי ב-~ 430-500 ננומטר ו-~ 660-750 ננומטר.
    3. באופן אמפירי לקבוע עוצמת לייזר כגון photobleaching לבנה משמעותית לא מתרחשת, כי תאים נשארים בריאים (אם לחיות הדמיה תא).
    4. האופן האמפירי קובע את הרווח כך שהאות מתקבל ללא שיקוף או באופן מלאכותי מסיכה ערכי פיקסלים.
    5. איסוף נתוני מחסנית Z, כגון תמונות הן תלת-ממדיות, כיסוי טווח של 20 עד 60 יקרומטר עם גודל השלב ~ 500 יקרומטר.
      הערה: התמונות המוצגות בנתונים מייצגים נרכשו על ידי קונפוקלית וקד (איור 2B), airyscan (איור 2ג) או מיקרוסקופ תאורה מובנית (איור 2ד). כל תא הוא הטרואוארייון בתום ובכן אם הוא מכיל הן סגול והן צבעים אדומים הרבה חופפים בציטופלסמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תאים מסומנים כראוי גלויים במהלך הזרימה cy, לנסות על ידי אות פלואורסצנטית גבוה יותר מאשר בתאי בקרה בלתי מסומן (איור 2א). גייטס מוגדר למיון תאים חיוביים כפולים, העשרת האוכלוסייה הזאת ישירות לתוך מנות הדמיה לניתוח מיקרוסקופי נוסף. תאים התמזגו הם לזיהוי ברורים כפול פלואורוסקופים תאים חיוביים ומהווים כ-~ 1% מהאוכלוסייה.

פיוז'ן גורם לסידור מחדש של האדריכלות התאית באמצעות ערבוב של שני תאים לתוך אחד (איור 2ב). Heterokaryons מזוהים על המיקרוסקופ כמו תאים המכילים הן אותות צבע פלורסנט מעורב בתא בודד (ללא ממברנות פלזמה ההתערבות). בנוסף, שני גרעינים עשויים להיות גלויים בתאים מותתים על-ידי ביוברייטפילד/הפרעות דיפרנציאליות או הדמיה של קרינה פלואורסצנטית. שים לב כי triploid או אחרים מאוד פוליפלויד מדינות אפשריות בנוסף דיפלואידי fusions אולם, ולכן האות צבע של שני צבעים יש להשתמש כדי לאשר את זהותו של תאים התמזגו.

מבנה התא ותפקוד הם נחקרו עוד יותר באמצעות מיזוג של תאים המכילים meGFP ו mScarlet-I מתויג חלבונים. היתוך תוצאות ההכפלה של מספר centrosome בתוך heterokaryons וכתוצאה מכך היתוך של שני תאים. לפיכך, אם התאים עם מוקדי המסומנות בצורה פלואורוסקופים הם התמזגו, לפחות ארבע כדוריות החומר לקרום הלב הם נצפו כאשר מרכיב כלקרום הלב NEDD1 מתויג באופן פלואורוסקופים (NEDD1-mRuby3; איור 2ג). פיוז'ן של תאים בעלי מתייג מתויג שורטלטין (רוטלטין-מגניר ושורטלטין-משני-I) מאפשר לזהות את התא של המקור של כל סנטורכמה שניתן לזהותו בתוך הטרוקיון. לורטלטין בשורשים הסנטורזומקיים מחזור מצומצם מאוד24, ולכן הוא נוכח כסיבים צבעוניים במובהק בheterokaryons התמונה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית (איור 2ד).

Figure 1
איור 1: היתוך תא תאים והדמיה פלואורסצנטית זרימת עבודה ניסיונית. תרשים סכימטי של העבודה הניסיונית בת ארבעת השלבים. (1) שתי אוכלוסיות תאים מתויג באופן משני, עם צבעים וחלבונים פיוז'ן פלורסנט. ציאן מייצג כתמים בצבע תא סגול ומגנטה מייצג כתמים בצבע תא אדום רחוק. ירוק מייצג תיוג ממגה-בוקס ואדום מייצג את התיוג של mScarlet-I. (2) התאים הם התמזגו דרך דגירה עם פוליאתילן גליקול. (3) תאים התמזגו מועשר על ידי cy, מיון התאים החיוביים הכפולים (אדום הרבה וסגול). (4) התאים התמזגו מתמונים על-ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להבין כיצד המבנה התאי והפונקציה משתנים (הדמיה של הערוצים הירוקים והאדומים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: זרימה מייצגת של העשרה והדמיה של תאים מוזרמים. (א) מייצגאת האסטרטגיה המשמשת בזרימה cy, לנסות מיון של תאים התמזגו. תאים התמזגו פלורסנט כפליים מסומנים על ידי הריבוע השחור. (ב) נציג המיקרוסקופיה של תאים מותענים, מתויג כפולה עם צבעי סגול וצבעים אדומים רחוקים. מוצגים הם דוגמאות של תאים התמזגו בהצלחה, שהם או טטרפלואיד או hexaploid (לוחות העליון והתחתון בהתאמה). סרגל בקנה מידה = 10 μm. (ג) נציג לחיות הדמיה של מוקד הקשר של מוקדי הקשר של הסנטורזומים בתא יחיד המכיל שורשים בעלי מכלול מתויג באופן שגרתי (רוסלטין-מגניב) וחומרי קרום המוח (NEDD1-mRuby3). סרגל בקנה מידה = 1 μm. (ד) תאים ביטוי מתויג באופן מרושני שורטלטין-מגfp היו מאוחדים עם תאים המבטאים מתויג באופן מידי שרוטלטין-mscarlet-I. התאים היו מקובעים ומוכתמים ומוכתמות בעזרת מיקרוסקופ תאורה מובנה. המוצג הוא בעוצמה מקסימלית z-הקרנת של מסנטזומים בתא התמזגו אחד. סרגל בקנה מידה = 1 μm. פאנל D שונה מ-mahen24 עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מדגימים נתיישב ופרוטוקול חסכוני עבור תאים פיוזינג ומדמיין את הארכיטקטורה הבאה של תאים היברידיות עם מיקרוסקופ, לוקח בערך יומיים מתחילתו ועד סופו. חלקים קריטיים של פרוטוקול זה הם העשרת התאים המוחלקים על-ידי מיון התאים (מקטע פרוטוקול 3) ואימות קפדני של תאים מוחלקים באמצעות מיקרוסקופ (פרוטוקול סעיף 4). סעיפים אלה להבטיח כי תאים התמזגו מתקבלים בקלות והם בתום heterokaryons. יש לדבקה בריכוזים ובזמני דגירה. לדוגמה, כאשר נעשה שימוש בריכוזים גבוהים יותר או בזמני דגירה ארוכים יותר, צבעי תאים יכולים להיות בהירים מדי ולהרוות את הגלאים במהלך הזרימה cy, או מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית, או לגרום לפליטה בהתאם לתנאי הדימות. בהעדר של cytometer טכנולוגיות אחרות מסוגלות להעשיר תאים התמזגו, כולל בחירת אנטיביוטי כפול27 ו microflu, השמנה מכשירים28. הטכנולוגיות האלה איטיות יותר או מחייבות התקנה ניסיונית יותר, עם זאת.

לשיטות אחרות של פיוז'ן תאים יש יתרונות וחסרונות בהשוואה לפרוטוקול המתואר כאן. היתוך אלקטרו-פיוז'ן או ויראלי מבוססי טכניקות פיוז'ן עשוי במקרים מסוימים להיות התמונה עם מיקרוסקופ במהלך היתוך8,29, מה שהופך אותם חלופות טובות אם עדיף להתבונן בתהליך היתוך עצמו. עם זאת, שיטות שונות אלה עשויות לדרוש ציוד מיוחד (כגון ציוד אלקטרו-פיוז'ן או טרנסגנים ויראליות). כל שיטות ההיתוך תא התא יש פוטנציאל פגוע על בריאות התא. שיטות פיוז'ן מבוססות ויראליות מסתמכות בדרך כלל על המשך הביטוי של הטרנסגנים ויראליים, בניגוד לפרטורציה הארעית שמספקת פג או אלקטרופיוז. פוטנציאל בתאי fusogenic ורעילות לאחר החשיפה יתד משתנה סוגים שונים של תאים27, ולכן טיטור של זמן הדגירה של יתד עשוי להידרש (פרוטוקול שלב 2.4), תוך הכרה כי החשיפה מוגברת של יתד מגביר מוות תא30. למקסם את בריאות התא הוא קריטי על ידי שמירה על הזמן מחוץ לתנאי התרבות למינימום. בריאות התא ניתן לבדוק במהלך פרוטוקול על ידי מדידת פיזור קדימה לעומת פיזור בצד על cytometer ובאמצעות התבוננות של מורפולוגיה במהלך מיקרוסקופ.

התחשבות מדוקדקת של תכנון ניסיוני כדי לאפשר תיוג דיפרנציאלי עם תגי פלורסנט היא חיונית. העיצוב הפשוט ביותר משתמש בשתי תוויות פלורסנט נפרדות. עם זאת, באופן שכיח הביע חלבונים היתוך פלורסנט הם לעתים קרובות ברמת ביטוי נמוכה ולכן קשה לזהות באופן חד משמעי על ידי cy, לנסות או הדמיה על רמת התא בודד. אנו מציגים עיצוב הגוברת על מגבלה זו על ידי כולל ארבעה תגי פלורסנט עם CRISPR Cas9 בתיווך הגנום עריכת ושיטות צביעת מבוסס-צבען. בבדיקות פלורסנט חייב להיות ספקטרום פליטה ברורים ניכר אחד מהשני ולהיות בהיר מספיק כדי להבדיל בין תאים בלתי מסומנים ברמת תא בודד. רגשים חייבים להישאר מאוגדים לתא במקום מתמוסס חיצוני. כריכה בלתי הפיכה פנימית ברמה התת-תאית אינה חיונית אך עשויה להיות רצויה. ברגע שתאים מתמזגים, חילוף המצב הקבוע של רכיבים סלולריים יכול להתרחש בחופשיות. מאחר והשורשים יציבים, הם מאפשרים מעקב אחר היסטוריית הסלולר, זיהוי התא של המקור של מרחב נתון. שינוי אפשרי של השיטה היא לתייג מבנים סלולריים אחרים של עניין, אבל הרכבות במצב יציב יש פוטנציאל לערבב לאחר היתוך, בהתאם לקצב של דינמיקה תאיים (איור 2ג).

תא תאים פיוז'ן מעורר שינוי ייחודי באדריכלות התאית17,19,24, ההשלכות של אשר עדיין לא מובנים לגמרי. זהו גם מגבלה של הפרוטוקול ואזור מרתק לחקירה נוספת. למרות ברור כי ממברנות פלזמה פתיל לתוך מבנה אחד ב heterokaryons31, איך אחרים מבנים סלולריים להגיב מובן בצורה גרועה. ניתן להשתמש במיזוג תאים כדי להבין עוד כיצד הפיוז והביקוע של ארגון מוסדרים באמצעות הדמיה של מנות24,32. העבודה העתידית עם היתוך התאים יכולה להתייחס לאופן בו אאופולודיה, מספר אורגל וגודל התאים הסלולאריים בתפקוד התא. מאז היתוך התא נורמלי נצפתה בתהליכי מחלות, בגידולים33 ובעקבות זיהום נגיפי10,17, פרוטוקול זה הוא גם שימוש לטיפול במגוון שאלות בביולוגיה בסיסית ויישומית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו ממומנת על ידי ברוכים העקב חומרי גלם באמון מחבר הנרי ברוכים המספרים (https://wellcome.ac.uk/grant מספר 100090/12/Z). לפאנדר לא היה כל תפקיד בעיצוב הלמידה, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד. אנו מודים לאשוק ולפול פרנץ ' לייעוץ ביקורתי ולהדרכה על הפרויקט. אנו מודים לקיארה וגבריאלה Grondys-Kotarba במכון קיימברידג ' לזרימת המחקר הרפואי מתקן Cy, לתמיכה מעולה. , אנו מודים לליאם קסידיי, תומס מילר. וג'אנמרקו קונארו על הגהה של כתב היד

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL tube Sarstedt 62554502
37% formaldehyde solution Sigma-Aldrich F8875
880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope Carl Zeiss
8-well imaging dishes Ibidi 80826
Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody Chromotek gba-488
BD Influx Cell Sorter BD Biosciences
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
Cell Filters (70 μm) Biofil CSS010070
CellTrace Far Red ThermoFisher Scientific C34572
CellTrace Violet ThermoFisher Scientific C34571
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate ThermoFisher Scientific 31966021
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 10270-106
FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody NanoTag Biotechnologies N1302-At565
L15 CO2 independent imaging medium Sigma-Aldrich 21083027
Penicillin/streptomycin Sigma-Aldrich 15140122
Phenol red free DMEM, high glucose ThermoFisher Scientific 21063029
Phosphate buffered saline (1x PBS) 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1 L
Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 Sigma-Aldrich P7181
Polypropylene tubes BD Falcon 352063
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151 nonionic surfactant
Trypsin Sigma-Aldrich T4049
Tween 20 Fisher BioReagents BP337 nonionic detergent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lane, N. Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).
  2. Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
  3. Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
  4. Rao, P. N., Johnson, R. T. Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis. Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).
  5. Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instability in colorectal cancers. Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).
  6. Fournier, R. E., Ruddle, F. H. Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).
  7. Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).
  8. Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. Microfluidic control of cell pairing and fusion. Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).
  9. Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs. Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).
  10. Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. A primate virus generates transformed human cells by fusion. The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).
  11. Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis. Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).
  12. Duelli, D. M., et al. A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion. Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).
  13. Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins. Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).
  14. Lentz, B. R. PEG as a tool to gain insight into membrane fusion. European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).
  15. Lentz, B. R., Lee, J. K. Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release? Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).
  16. Pontecorvo, G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment. Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).
  17. Okada, Y. Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation. Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).
  18. Zimmermann, U. Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).
  19. Hu, C., et al. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).
  20. Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).
  21. Kao, K. N., Michayluk, M. R. A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts. Planta. 115 (4), 355-367 (1974).
  22. Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. Mechanisms of cell fusion. Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).
  23. Mahen, R., Venkitaraman, A. R. Pattern formation in centrosome assembly. Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).
  24. Mahen, R. Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence. PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).
  25. Mahen, R., et al. Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells. Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).
  26. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  27. Yang, J., Shen, M. H. Polyethylene glycol-mediated cell fusion. Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).
  28. Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT). Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).
  29. Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies. Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).
  30. Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines. Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).
  31. Frye, L. D., Edidin, M. The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons. Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).
  32. Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin. FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).
  33. Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor. Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).

Tags

ביולוגיה התפתחותית סוגיה 154 היתוך תא תא סנטרוכמה אאופולודיה הטרופאון זרם cy פוליאתילן גליקול (פג) מיקרוסקופ פלואורסצנטית אורגל fusogen
תא תא פיוז'ן של הגנום בעריכה קווי תאים עבור פרטורבציה של מבנה הסלולר ותפקוד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mahen, R., Schulte, R. Cell-cell… More

Mahen, R., Schulte, R. Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function. J. Vis. Exp. (154), e60550, doi:10.3791/60550 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter