Summary
במודלים של בעלי מבחנה של אנגיוגנזה כלילית ניתן לעשות שימוש לגילוי המנגנון הסלולר והמולקולרי של אנגיוגנזה כלילית. באופן מתורבת תרבויות של הסינוס venosus ורקמות אנדוקרדיום להראות צמיחה חזקה בתגובה ל-ולהציג דפוס דומה של הביטוי הפיכה-TFII כמו ב vivo.
Abstract
כאן, אנו מתארים בתוך שיטת תרבות מבחנה לחקר אנגיוגנזה כלילית. כלי דם כליליים מזינים את שריר הלב והינם בעלי חשיבות קלינית. פגמים בכלי זה מייצגים סיכונים בריאותיים חמורים כגון טרשת עורקים, אשר יכול להוביל שריר הלב infarctions וכישלונות לב בחולים. כתוצאה מכך, מחלת עורק כלילית היא אחת הסיבות המובילות בעולם למוות. למרות החשיבות הקלינית שלה, התקדמות קטנה יחסית נעשתה על איך לחדש את העורקים הכליליים פגום. אף על פי כן, ההתקדמות האחרונה נעשתה בהבנת המקור הסלולר ומסלולי הבידול של פיתוח כלי קיבול כלילית. הופעתו של כלים וטכנולוגיות המאפשרים לחוקרים לתייג באופן מרשים בתאי קדמון, לעקוב אחר גורלם, ולהמחיש progenies בvivo היתה אינסטרומנטלית בהבנת התפתחות כלי הקיבול כלילית. במחקרים vivo הם יקרי ערך, אך יש להם מגבלות מבחינת מהירות, נגישות וגמישות בתכנון ניסיוני. לחילופין, מדויק במודלים מחוץ לגוף של אנגיוגנזה כלילית יכול לעקוף מגבלות אלה ולאפשר לחוקרים לחקור שאלות ביולוגיות חשובות במהירות ובגמישות. חוסר ההתאמה במערכות מודל החוץ-גופית עלול להיות מפריע להתקדמות בהבנת המנגנון הסלולר והמולקולרי של צמיחת כלי קיבול כלילית. כאן, אנו מתארים מערכת תרבות מבחנה לגדל כלי כלילית מן venosus סינוס (SV) ו אנדוקרדיום (אנדו), שתי רקמות הקדמון שממנו רבים של כלי כלילית להתעורר. כמו כן, אנו מאשרים כי התרבויות באופן מדויק לכידה של חלק הידוע במנגנונים vivo. למשל, אנו מראים כי נבטי האנגיוגנטי בתרבות מ-SV הפחתת הפיכה-TFII הביטוי דומה למה שנצפה ב vivo. בנוסף, אנו מראים כי מרכיב ה-אנגיוf-A, גורם מוכר היטב בvivo, מעורר את האנגיוגנזה הן מתרבויות הSV והן מתרביות האנדו. באופן קולקטיבי, המציאו מודל מדויק של תרבות מבחנה לחקר אנגיוגנזה כלילית.
Introduction
כלי הדם של הלב נקראים בדרך כלל כלי דם כליליים. כלי הדם מורכבים מעורקים, עורקים ונימים. במהלך פיתוח, נימים מאוד מסוקנים מבוססים על הראשון, אשר לאחר מכן לשפץ לתוך עורקים וורידים כליליים1,2,3,4,5. הנימים הראשוניים האלה בנויים מתאי מחולל שורש שנמצאו בתוך הפרואפידיום, הסינוס venosus (SV), ו אנדוקרדיום (אנדו) רקמות1,6,7,8. SV הוא האיבר הנכנס של הלב העובריים ואנדו הוא הציפוי הפנימי של הלב לומן. תאי מחולל שורש שנמצאו ב-SV ו-אנדו בונים את רוב העורקים הכליליים, ואילו הפרואפידיום תורמת לחלק קטן יחסית ממנו2. התהליך בו הרשת הקפילר של כלי הדם הכליליים גדלים בלב התאים הקודמיים הקיימים נקראת אנגיוגנזה כלילי. מחלת עורק כלילית היא אחד הגורמים המובילים למוות ברחבי העולם, ובכל זאת, טיפול יעיל למחלה זו חסר. הבנת המנגנונים הסלולאריים והמולקולריים המפורטים באנגיוגנזה כלילית יכולים להועיל בעיצוב הטיפולים החדשניים והיעילים לתיקון ולחידוש העורקים הכליליים שנפגעו.
לאחרונה, גל ההבנה שלנו כיצד מתפתחים כלי קיבול כליליים הושג באופן חלקי באמצעות פיתוח כלים וטכנולוגיות חדשים. בפרט, בשנת vivo התוויות היוחסין וטכנולוגיות הדמיה מתקדמות שימושי מאוד לחשוף את המקור הסלולר בידול מסלולים של כלי כלילית9,10,11,12. למרות היתרונות של אלה בכלים vivo, קיימות מגבלות במונחים של מהירות, גמישות ונגישות. לכן, מערכות מודל מבחנה חזקות יכולות להשלים במערכות vivo כדי להבהיר את המנגנונים הסלולאריים והמולקולריים של אנגיוגנזה כלילית בצורה של תפוקה גבוהה.
כאן, אנו מתארים מודל מתורבת של אנגיוגנזה כלילית. פיתחנו מערכת תרבות התפתחות מחוץ גופית כדי לגדל כלי קיבול כלילית משני רקמות קדמון, SV ו אנדו. עם המודל הזה, אנו מראים כי ברקמות הרקמה מחוץ למוח החוקר לגדול ניצנים כלילית כאשר מגורה על ידי מדיום הצמיחה. בנוסף, תרבויות ההסבר גדלות במהירות בהשוואה לשליטה בזמן הגירוי על ידי גורם הגדילה של כלי הדם A ("וואפ-א"), חלבון אנגיוגנטי חזק במיוחד. יתרה מזאת, גילינו כי נבטי האנגיוגנטית מתרבות ה-SV עוברים הבחנה ורידים (אובדן הבעת ההפיכה-TFII), מנגנון הדומה לאנגיוגנזה של SV ב-vivo1. נתונים אלה מצביעים על כך שמערכת התרבות התרבותית של החברה ממריצה בנאמנות אירועים של אנגיוגנטי המתרחשים בvivo. באופן קולקטיבי, במודלים של האנגיוגנזה המתוארים כאן, הם אידיאליים לבדיקה של מנגנונים סלולאריים ומולקולריים של אנגיוגנזה כלילית בצורה של תפוקה גבוהה ונגישה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
השימוש של כל בעלי החיים בפרוטוקול זה בעקבות כדור המדינה מוסדיים טיפול בעלי חיים הוועדה השימוש (IACUC) הנחיות.
1. הקמת מגדלים עכבר זיהוי אטמי נרתיקי עבור הריונות מתוזמן
- להקים כלוב הרבייה עכבר עם מסוג פראי גברים ועכברים נקבה. ודא שגיל העכברים הוא בין 6-8 שבועות. להקים זוג (1 זכר ו 1 נקבה) או כשלישייה (1 זכר ו 2 נקבה) להתרבות.
- בדקו למחרת את הפקק הנרתיק. השתמש במכשיר מתכת זוויתי כדי לזהות תקע עמוק על ידי הוספתו לתוך פתח הנרתיק. לייעד את הבוקר של תקע חיובי הנרתיק להיות היום העובריים 0.5 (e 0.5).
הערה: תקע מהנרתיק יכול להיות שטחי (שניתן לראותו בקלות, ראה איור 1) או עמוק (שאינו גלוי בקלות). נוכחות של תקע עמוק יחסום החדרת מלאה של המכשיר בעוד העדר תקע יאפשר הכנסה מלאה ללא התנגדות. - לשמור על ההריון מתוזמן עד העוברים להגיע e 11.5 שבו הם ייקצרו. כדי לאשר הריון לפני לקצור עוברים, להקליט את המשקל של העכברים הנשיים בין e 7.5 ו-e 11.5.
הערה: הגידול היומי במשקל האם יציין הריון מוצלח, בעוד ששום שינוי במשקל לא יציין הריון כושל.
2. קצירת עוברים מעכברים בהריון
הערה: לפני תחילת, הקפד לקבל את הציוד הבאים ריאגנטים: קאמרית CO2 המתת חסד, 70% אתנול, מגבות נייר, מלקחיים רגיל, מלקחיים משובחים, מספריים, 1x מלוחים סטרילית באגירה (PBS), 10 ס מ מנות פטרי סטרילי, מיכל עם קרח, מחורר כף, לנתיחה stereomicroscope.
- מניחים את העכבר בהריון 11.5 בחדר נקי של2 המתת חסד כדי להקריב אותו. סגור את המכסה של התא כדי למנוע את העכבר לברוח.
- לאחר העכבר מאובטח בתא המתת החסד, להפעיל את CO2. ודא כי לווסת את קצב הזרימה של CO2 לכל IACUC המלצות (כלומר, 10-30% הזחה לדקה). לאחר העכבר מורדמים לחלוטין, לבצע פריקה צוואר הרחם כדי להבטיח מוות.
- לרסס את העכבר עם 70% אתנול. הרם את העור מעל הבטן באמצעות מלקחיים, לעשות חתך קטן באמצעות זוג מספריים ולהאריך את החתך החוצה. הגדל את החתך עד לסרעפת וחשוף את קרן הרחם המכילה את העוברים (איור 2).
- משוך את מחרוזת העוברים (קרן הרחם + עוברים) על ידי אוחז את הרחם ולחתוך אותו בחינם. מניחים את שרשרת העוברים בקירור קר 1x PBS.
- לנתח את העוברים הבודדים מקרן הרחם על ידי קילוף שריר הרחם, שק החלמון, ואת השפיר על אחד (איור 3A-F) תחת stereomicroscope. העבר את העוברים הנקוחים בכפית מחורר לצלחת פטרי המכילה PBS 1 x מעוקר על הקרח. הקפידו לשמור על העוברים קרים.
3. בידוד לבבות מ-e 11.5 עוברים
הערה: לפני תחילת, הקפד לקבל את הציוד הבאים ריאגנטים: מלקחיים רגיל, מלקחיים עדינים, 1x מעוקר PBS, 10 ס מ צלחת פטרי סטרילי, 6 ס"מ צלחת פטרי סטרילי, מיכל עם קרח, מחורר כפית, לנתיחה stereomicroscope.
- הגדר צלחת פטרי חדשה עם הקרח קר מעוקר 1x PBS תחת stereomicroscope. להעביר עובר משלב 2.5 לתוך צלחת פטרי כדי לנתח את הלב.
- להסיר את ראש העובר באמצעות מלקחיים. ראשית, לסחוט את הראש בין מלקחיים ביד אחת ולאחר מכן להסיר את הראש על ידי מגרד אותו משם עם היד השנייה באמצעות מלקחיים סגורים (איור 4א-ג).
- לאחר הסרת הראש, כוון את העובר עם הצד הגחוני שלו למעלה על ידי החזקת העובר עם מלקחיים על בטנו ביד אחת (איור 4ד).
- עם זאת, לפתוח את קיר החזה של העובר על ידי הראשון עושה חתך קטן בחזה מעט מעל הסרעפת באמצעות מלקחיים עדינים. אז, להגדיל את החתך בזהירות רבה על ידי החדרת מלקחיים סגורים לקרוע את הקיר בחזה על ידי פתיחת מלקחיים. הקפידו לא לדחוף עמוק מדי, מה שעלול לגרום נזק ללב. בעזרת מלקחיים, לשמור על קיר החזה פתוח לחשוף את הלב ואת הריאות בחלל החזה (איור 4E).
- באמצעות מלקחיים עדינים, מזיז בעדינות את הלב (90 °) וחושף את עורק העורקים/הווריד. הוצא את הלב/הריאות מתוך לכידת העורקים/הווריד בבסיס הלב (איור 4F-H).
הערה: להיות עדין תוך משיכת הלב/הריאות כדי למנוע קריעה של SV, אשר ממוקם בצד השני של הלב. - לשטוף את הלב/הריאות עם הקרים 1x PBS להסרת כדוריות הדם.
- חזור על שלבים 3.1-3.6 כדי להסיר את הלב/הריאות של העוברים הנותרים. הקפידו לשמור על קרח מבודד לב/הריאות.
4. בידוד SVs וחדרים מ-e 11.5 לבבות מעובריים של העכבר
- מניחים את צלחת פטרי עם לב/הריאות משלב 3.7 מתחת stereomicroscope לבודד את SVs ואת החדרים כולו. לקלף את האונות המצורפת של הריאות אחד-אחד מן השורש שלהם באמצעות מלקחיים עדינים.
- כוון את הלב על הצד הצדדי שלה ולהסיר את הרקמה הסמוכה המקיף את ההזמנה SV מבלי לקרוע את SV. הסר את השמאל ואת הימין מהלב על ידי החזקת בבסיסו ומגרדים אותו באמצעות מלקחיים עדינים (איור 5ב). הסר את הרקמה הסמוכה סביב SV באמצעות טכניקה דומה (איור 5ג).
הערה: זכור כי האטריום הימני מחובר ל-SV, כדי להיזהר רק להסיר את האטריום. - כדי לבודד את ה-SV, ראשית המזרח הלב עם הצד הצדדי שלו פונה כלפי מעלה (כי SV הוא בצד החלק השני) ולשמור על הלב עדיין בתנוחה זו על ידי החזקת בעדינות את הלב על החדרים שלה עם מלקחיים.
הערה: ה-SV הוא איבר של לב עובריים הנמצא בין האטריה בצידו הפנימי של הלב. - הסר את ה-SV על ידי קילוף בזהירות את הלב שבו הוא מצורף או על ידי החזקת SV בבסיס ההחזקה שלה עם מלקחיים עדינים מגרד אותו עם מלקחיים סגורים (איור 5ד, E).
- העבר את SV מבודדים לתוך צלחת חדשה 6 ס מ פטרי עם קירור קר 1x PBS על הקרח באמצעות פיפטה העברה סטרילית לתייג את צלחת פטרי כמו SV.
- כדי לבודד את החדרים כולו, להסיר את מערכת הזרימה (עורק העורקים ואת גזע הריאות) מהלב לאחר הסרת SV (איור 5F, G).
- העבר את החדרים כולו לתוך צלחת חדשה 6 ס מ פטרי המכיל מעוקר 1x PBS על הקרח באמצעות פיפטה העברה סטרילית לתייג את צלחת פטרי כמו החדרים. לשמור על SV מבודדת החדרים על הקרח.
- חזור על שלבים 4.1-4.7 כדי לבודד SVs והחדרים משאר הלבבות.
5. הגדרת לוחות תרבות רקמה עם מוסיף וציפוי מטריקס מסחטות
הערה: לפני תחילת, הקפד לקבל את הציוד הבאים ריאגנטים: הפתרון המסחרי מטריצה מסחרי (ECM; למשל, מטריצות), 8.0 μM פוליאתילן terאפרון (PET) מוסיף תרבות, 24 לוחות טוב, 37 ° c, 5% CO בחממה2 .
- תנו לפתרון ה-ECM להפשיר את הקרח. שמור את הפתרון ECM על הקרח כדי למנוע מיצוק.
- מניחים את התרבות הממברנה PET מוסיף (גודל הנקבוביות = 8.0 μm, אזור סינון = 0.3 ס"מ2, מסנן קוטר = 6.5 מ"מ) לתוך הבארות של תרבות שאינה רקמה שטופלו 24 צלחות. תווית את הצלחות כמו SV או החדרים עבור SV או אנקרחיוג אנגיוגנזה assays בהתאמה.
הערה: הגדר את התוספות בצלחות נפרדות עבור ה-SV והחדרים בעת ביצוע שתי התרבויות בו זמנית. הקפד להגדיר מספיק בארות עבור כל הדגימות ניסיוני ובקרות. - לאחר פתרון ECM מופדים, מיד לדלל ECM 1:2 בינונית בסיס מראש (כלומר, EBM-2 בסיס הבסיס, ראה טבלת חומרים) לנפח מספיק (100 μl/הוסף x מספר התוספות).
הערה: למשל, אם יש שישה מוסיף, אז הנפח הכולל יהיה 100 μL x 6 = 600 μL. הוסף 200 μL של ECM לתוך 400 μL של המדיום הבזלי. - המעיל מוסיף עם 100 μL של ECM טרי מדולל על ידי הוספת אותו ישירות על גבי קרום. מודקת את הצלחת ב 37 ° c עבור לפחות 30 דקות כדי לאפשר ECM לגבש.
הערה: יש לבצע זאת תחת המכסה התרבותי של רקמת הזרימה כדי למנוע זיהום.
6. SVs ו תרבות החללי המלא
הערה: לפני תחילת, הקפד לקבל את הציוד הבאים ריאגנטים: 70% אתנול, העברת הצינורות, stereomicroscope, מלקחיים, כיסוי התרבות של רקמת זרימה למינארי, מיקרוכלי-דם מיקרו מוסף תאהתוספת (טבלת חומרים), בסיס מדיום, 1x סטרילי PBS). איור 6 מראה את זרימת העבודה של התרבות SV וחדר החדר.
- להפשיר את התוכן של ערכת תוספת על קרח. הכינו את המדיום השלם על ידי הוספת כל התוכן של ערכת התוספת לתוך 500 mL של בסיס הבסיס תחת מוסמך כיסוי התרבות הגוף רקמת הזרימה. מערבבים היטב את המדיום ומפיצים ל50 mL.
- לחטא את הבסיס של אזור העבודה stereomicroscope והסביבה עם 70% אתנול.
- השג את לוחיות התרבות של הרקמה משלב 5.4. בעזרת פיפטה העברה, בזהירות להעביר את explants משלב 4.7 על גבי קרום ההכנסה. תחת stereomicroscope ובעזרת מלקחיים נקיים, מקמו את האקסוצמחים במרכז התוספות כדי לוודא שהם לא תקועים בפינת התוספות או מחוברים לקירות הצדדיים.
- לאחר explants ממוקמים וממורכז על מוסיף, בזהירות להסיר כל PBS נוסף מן התוספות ולסגור את העפעפיים של הצלחות.
- תחת המכסה התרבותי של רקמת הזרימה למינארי, להוסיף 100 μL של המדיום השלם prewarmed על גבי מוסיף ו 200 μL לתוך הבארות כדי התרבות explants על ממשק נוזלי האוויר כגון משטח הבסיס של הכנס הוא במגע עם המדיום , אך המשטח העליון נחשף לאוויר.
הערה: הקפד לכוונן את עוצמת הקול כדי להשיג ממשק נוזלי אוויר אם באמצעות מוסיף בגודל שונה/טוב צלחות. - הוסף 300 μL של PBS לתוך הבארות שאינן בשימוש של 24 צלחות ולכסות עם המכסה. מודקת את הצלחת ב 37 ° c, 5% שיתוף חממה2 , ולצמוח את התרבויות 5 ימים.
- בימים הבאים, להתבונן באופן שגרתי בתרבויות תחת מיקרוסקופ אור הפוך כדי להעריך את מעמדם של תרבויות ההסבר. ודא כי the explants התערוכה מכות הכוללת את כל האקסוצמחים מחוברים לתחתית הקרום מוטבע עם ECM. שימו לב לכל הרחבות צף.
הערה: הכיווץ התקופתי של האקכורים מעיד על כך שהם חיים. הרחבות צף אמורות להיות מושמטות מהניתוח. - לאחר הערכת מעמד התרבות, הכניסו את לוח התרבות בחזרה לחממה והמשיכו לגדל את התרבות עד חמישה ימים.
7. טיפול בתרבויות עם השליטה החיובית
הערה: לפני תחילת, הקפד לקבל את הציוד הבאים ריאגנטים: כיסוי התרבות של רקמת זרימה למינארי, 1x PBS, בסיס בינוני + 1% סרום העוברי (FBS), בינוני בסיס +-מדיום-מיכשור וציוד, וטיפים.
- הכינו את המדיום הבזאלי + 1% FBS ואת המדיום הבזאלי + הבסיס.
- כדי להכין את המדיום הבזאלי + 1% FBS, קבע תחילה את מספר בארות הבקרה הדרושות. למשל, אם יש שלוש בארות שליטה, אז 300 μL/טוב x 3 = 900 μL הוא הנפח הכולל הדרוש. הוסף 9 μL של FBS לתוך 891 μL של המדיום הבזליים כדי להפוך את המדיום הבסיס +1% FBS.
- כדי להכין את המדיום הבזאלי + מדיום-A, קבע תחילה את המספר הכולל של בארות הזקוקים ל-מדיום. אם יש שלוש בארות, אז 300 μL/טוב x 3 = 900 μL הוא אמצעי האחסון הכולל ו50 ng/טוב x 3 = 150-A. הוסף 150 ng של מדיום-A לתוך 900 μL של בסיס הבסיס כדי להפוך את מדיום בסיס + הבסיס.
הערה: הכנס פתרון זה באמצעי אחסון גדול יותר מאשר מחושב כדי להבטיח מספר מספיק של הרשאות קטנות עבור כל ניסוי.
- ביום 2, הוציאו את המדיה משני התאים (התוספות והבארות). לשטוף את התרבויות עם 300 μL של 1x PBS על ידי הוספת 100 μL ל מוסיף ו 200 μL לתוך הבארות. מערבולת בחוזקה את הצלחות כמה פעמים ומסירים את ה-PBS.
- הוסף 300 μL של בינוני בסיס + 1% FBS (100 μL לתוך התוספת ו 200 μL לתוך הבארות) כדי להרעיב את התרבויות עבור 24 שעות.
- ביום 3, לאחר הרעב, להוסיף 300 μL של בינונית בסיס +1% FBS (100 μL לתוך הכנס ו 200 μL לתוך הבארות) לתוך בארות הבקרה בינונית בסיס + ומעלה-A (50 ng/גם) לתוך הטיפול בארות, בהתאמה.
- לאחר הטיפול, המשיכו לגדל את התרבויות בחממה.
8. קיבוע ומכתים חיסוני
הערה: לפני תחילת, הקפד לקבל את הציוד הבאים ריאגנטים: 4% פאראפורמלדהיד (כדור הראש), 1x PBS, הראשי והמשני נוגדנים, שייקר, 0.5% nonionic החומרים ב-PBS (PBT).
- ביום השישי של culturing, להסיר את המדיום ולשטוף את התרבויות עם 1 x PBS בטמפרטורת החדר (RT).
- תקן את התרבויות על ידי הוספת 200 μL של 4% הפתרון הכל1 לתוך הבארות ו 100 μL לתוך התוספות. לתקן תרבויות ב 4 ° צ' במשך 20 דקות בזמן הנדנדה.
- לאחר הקיבעון 20 דקות, להסיר את החצי הראשון מן התרבויות בתוך מכסה ולשטוף את התרבויות עם 1x PBS ידי הוספת 200 μL לתוך הבארות 100 μL לתוך התוספות.
- חזור על שוטף 3 x, 10 דקות כל אחד, בזמן הנדנדה. לאחר מכן המשך לבצע כתמים חיסוני.
הערה: כל צעדי השטיפה מבוצעים על שחקן ספסל ב-RT.
- לדלל נוגדנים עיקריים (אנטי-VE-קדהרין, anti-ERG 1/2/3) בפתרון חסימה (5% החמור סרום, 0.5% PBT). הוסף 300 μL של פתרון הנוגדן העיקרי (200 μL ב בארות התחתונה ו 100 μL לתוך התוספות). התרבות הדגירה של נוגדנים בתוך הלילה ב 4 ° צ' בעת הנדנדה.
הערה: משתמשים באנטי-וו-קדהרין כדי לתייג את קרום התא האנדותל ו-anti-ERG 1/2/3 משמש להוספת תווית לגרעין התא האנדותל כדי להמחיש את הנבטים של תאי האנדותל. - למחרת, לשטוף ולנענע את לוחות התרבות 10x ב 0.5% PBT, שינוי PBT כל 10 דקות.
- לדלל את הנוגדנים המשניים (חמור נגד חולדה אלקסה Fluor 488 ו חמור אנטי ארנב אלקסה Fluor 555) בפתרון חסימה. הוסף 300 μL של הנוגדן המשני כמו בשלב 8.2 ו דגירה התרבויות לילה ב 4 ° צ' בעת נדנדה. ביום שלמחרת, רוחצים את הנוגדנים המשניים 10x ב PBT, שינוי PBT כל 10 דקות.
הערה: לשטוף מינימום של 10x אבל יותר שוטף הם טובים יותר. לאחר השלמת השיטיפות, ניתן לאחסן את התרבויות ב-1x PBS עד להרכבה על שקופיות.
9. הרכבה של תרבויות על שקופיות, הדמיה וניתוח
הערה: לפני תחילת, הקפד לקבל את הציוד הבאים ריאגנטים: מלקחיים עדינים, שקופיות, הרכבה בינונית עם 4 ′, 6-diamidino-2-פניינילידול (dapi), כיסוי, ומיקרוסקופ קונפוקלית וקד. לאחר כתמים נוגדן משני, לטעון את התרבויות על שקופיות לדימות באמצעות השלבים הבאים.
- לקלף את הקרום בזהירות מן הכנס באמצעות מלקחיים עדינים ולהעביר אותו על השקופיות על ידי הצבת הממברנה בצד למטה והצבת תרבויות ההסבר כלפי מעלה. הצב את דגימות השכפול באותן שקופיות ותייג את השקופיות כפקד או על-ידי הערך הרגיל. הוסף כמה טיפות של בינוני גובר עם DAPI ישירות על הקרום ולכסות את השקופיות עם תעודות מכסות.
הערה: הקפד להימנע בועות אוויר תוך הצבת שמיכות. - אטום את קצות השקופיות עם לק בהיר ולתת יבש.
הערה: ניתן לאחסן שקופיות ב-20 ° צ' לאחסון לטווח ארוך. - תמונה שקופיות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד.
- ביצוע ניתוח כדי למדוד את אורך הצמיחה של אנגיוגנטי. ככמת אנגיוגנטית אורך הצמיחה על ידי מדידת המרחק של תאי האנדותל (Ve-קדהרין +/ERG 1/2/3 +) המורחבת מתוך הגבול הפנימי של ERG 1/2/3 + תאים בתרבויות החדר ומהמרכז של ה-SV explants בתרבויות SV.
- כדי לבצע כימות באמצעות פיג'י/ImageJ, הורד תחילה את תוכנת פיג'י.
- פתיחת קובצי תמונות בפיג: עבור לקובץ | פתח | תיקיה | שם קובץ | . פתח אתזה
- עבור לניתוח | הגדרת מדידות | בחר היקף.
- בחרו בכלי קו ישר מהחלון הראשי.
- צייר קו לאורך הנבט כפי שהוצע בשלב 9.4.
- עבור לניתוח | . מידה מדידה
הערה: מדידות אורך מוצגות בחלון החדש. - לבצע כימות בתמונות המייצגות לפחות שלושה שדות שנבחרו באופן אקראי. ממוצע מדידות אורך הנבט ודווח עליהן כמשמעות של ± סטיית תקן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אחת התכונות הבולט ביותר של אנגיוגנזה של SV ב vivo היא שהיא עוקבת אחר מסלול מסוים וכרוכה בביטול התא ובידול אירועים המתרחשים בזמנים ומיקומים1. כמו תאים SV הראשונית לגדול על חדר הלב, הם מפסיקים לייצר סמנים ורידים כגון הפיכה-TFII (איור 7). לאחר מכן, נבטי כלילית לקחת שני נתיבי הגירה, על פני השטח של הלב או עמוק בתוך שריר הלב. ספינות פני השטח בסופו של דבר להפוך ורידים בעוד הפולש כלי להפוך עורקים נימים1,6,7. הבחנה זו נשמרת כאשר הלב גדל והעורק הכלילי מתרחב.
כדי להקל על גילוי התחתון המולקולרי של התפתחות כלילית, המציאו מודל מבחנה של לבלוב SV שיכול להיות מנוצל עבור אובדן הפונקציה וניסויים להרוויח. רקמת SV של לבבות עובריים העכבר הם גזור, ממוקם על החלק העליון של ECM מדולל (אשר זמין מסחרית, לראות את הטבלה חומרים), ומתוחזק באוויר-נוזלי ממשק בינוני הצמיחה של תא אנדותל. שריר הלב של SV ממשיך להכות במהלך תקופת התרבות. לאחר יומיים בתרבות, התאים האפיריתיים שבקו הרקמה לעזוב את ההסבר ולנדוד אל המטריצה. לאחר 5 ימים, התאים האנדותל של SV לנבוט ולהגר אל רקמת האפילחייג (איור 8A, שחור ראשי חץ). תהליך זה מסכם באופן קולקטיבי היבטים של התפתחות כלילית.
נבטי SV מתורבת גם לעבור בידול ורידים. כמו הלב העובריים, הבעת ההפיכה-TFII הביטוי מופחת כמו כלי לנדוד הרחק SV (איור 8ב, לעומת איור 7). כלי שליטה כגון עורקים הטבור או שק החלמון ורידים יכולים לייצר כלים לבלוב. עם זאת, הם פחות מספר וקצרים יותר ואינם משנים את זהות העורקים או הורידים שלהם (לא מוצג). לכן, תכנות מחודש ורידי הוא ספציפי לבלוב SV ולא תכונה כללית של אנגיוגנזה או תגובה לרכיבי ECM. נתונים אלה גם מצביעים על כך שסוגי התאים הכלולים בתוך ה-SV עצמו נחוצים ומספיקים כדי לגרום לביטול הבידול.
זה ידוע היטב כי גורם הגדילה של כלי הדם a (וכף-A) הוא השראה חזקה של אנגיוגנזה7,13,14,15,16,17,18. מחקרים קודמים הראו כי שריר הלב-A-A מעוררת אנגיוגנזה אנדוקקראפ לצמוח כלי קיבול כלילי7. בנוסף, תאים כליליים אנדותל הוכחו לבטא את קולטן והוא הופק על ידי כלילית, וכלי שריר העורקים הנגזר בשריר הלב עשוי לצמוח בתגובה ל-vivo f ב-2. כדי להראות כי שלנו מודל מתורבת של אנגיוגנזה כלילית בנאמנות מגיב ל-והוא, אנו ממריצים את התרבויות SV ו אנדו עם וואפ-A. כצפוי, התוצאות שלנו הראו כי הן SV והן אנדו מגיבים במידה רבה ל-והוא. תרבויות מגורה עם מופע של וואפ-A גדל צמיחה של נבטי אנגיוגנטית הן בצפיפות ובאורך (איור 9א, ג). תרבויות SV מגורה על ידי הצגת הגידול כמעט פי 3 באורך נבט לעומת השליטה (איור 9ב). תוצאות אלה מרמזות כי נבטי אנדותל מ SV ו אנדו להגיב רמזים דומים הידועים בvivo.
יחד עם זאת, הנתונים שלנו מצביעים על כך שבתרבויות מחוץ לתחום החקר המוח חולקים אירועים דומים ומולקולריים שמתרחשים במהלך התפתחות vivo כלילית, כולל בידול ורידים וצמיחה חזקה בתגובה לגירוי מדומה. לכן, הנתונים שלנו מצביעים על כך שמודלים אלה של תרבות החוקרים שימושיים ללימוד אנגיוגנזה כלילי בתוך מבחנה.
איור 1: זיהוי תקע וגינאלי. (א) תקע וגינאלי (נקודהלבנה). (ב) תצוגה מוגדלת של מסגרת באזור כולל תקע הנרתיק (המצוין על ידי החץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: גישה למחרוזת העובר ברחם של עכבר בהריון. עכבר בהריון מורבית ממוקם עם המשטח הגחוני שלה מעלה וריסס עם 70% אתנול לעור רטוב לחיתוך. העור משכה באזור האגן באמצעות מלקחיים וחתך קטן נעשה. . החתך מוארך מבחינה מורחבת חתך נוסף נעשה בהמתנה לסרעפת. ברחם, מחרוזת של עוברים גלויה (המצוינת על-ידי ראשי חץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח והסרה של עוברים מן הרחם. (א) תמונה המציגה את הרחם המכיל מחרוזת של עוברים. הקרום בצד השני של העובר (ממול בצד שבו השליה נמצאת) הוא קלוף. (ב) העובר שק החלמון הופך גלוי לאחר קילוף קרום הרחם. (ג, ד) העובר המצורף לשליה עם חבל הטבור נראה לאחר קילוף שק החלמון. השפיר מקולף. אם עדיין נוכח (E) תמונה המציגה עובר המצורף לשליה על ידי חבל הטבור. (ו) תמונה המציגה את ניתוק העובר מן השליה על ידי משיכת חבל הטבור (umb. פתיל) באמצעות מלקחיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הסרת הלב/הריאות לקטוף מעוברים. (א, ב) הראש מוסר מן העובר על ידי לכידת בצוואר ומגרדים אותו. (ג) תמונה המציגה את הסרת הראש מהגוף. (ד) המיקום הנכון של העובר עבור ניתוח לב. העובר ממוקם עם הצד הגחוני עד למעלה כדי לקבל גישה קלה לחלל החזה להסרת הלב. לאחר העובר ממוקם כמוצג D, חלל החזה נפתח עם מלקחיים. (ה) תמונה המציגה את חלל החזה הפתוח עם הלב החשוף על צידו הגייתי. (ו) כדי להסיר את הלב מבלי להזיק ל-SV, הלב מתהפך והוא הופך לגלוי. (G) תמונה המציגה את המיקום בבסיס הלב/הריאות שבו העורקים הראש/הווריד הוא נלכד עם מלקחיים ואת הלב/הריאות לקטוף מוצא בהמתנה. (ח) התמונה מראה את e 11.5 הלב/הריאות להסיר את העובר. V. הלב = לב גחוני; ד. לב = לב מפרק; ד. העורקים = העורקים האחרים; LA = אטריום שמאל; רע = פרוזדור ימני; LV = חדר שמאלי; קרוואן = החדר הימני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: בידוד SV ו החדרים מלבבות עובריים. (A) תמונה המציגה את התצוגה המקדימה של הלב/הריאות מבודדים לקטוף את e 11.5 העובר. מיקום ה-SV בלב מצוין. (ב) תמונה של הלב לאחר ניצנים הריאה הוסרו. (ג) atria ורקמות סמוכות סביב ה-SV יוסרו, חשיפת העורקים. מיקום ה-SV מתויג. (ד) תמונה המציגה הסרה של ה-SV. באמצעות מלקחיים, SV הוא אחז בבסיסו והוא מגורד מהלב. (ה) SV מוסר מהלב מוצג יחד עם הרקמה הנותרת של הלב. העורקים והעורק הריאתי (PT), המכונים באופן קולקטיבי את מערכת הזרימה (OFT), הופכים לגלויים בלב לאחר הסרת ה-SV. ה-SV ישמש לתרבות חוץ גופית, כמתואר באיור 6 (הפאנל השמאלי). (ו) מיקום ה-OFT שיש לגזור מסומן בקו לבן מקווקו. (G) העורקים/PT (מערכת יוצאת) מוסר מן החדרים על ידי ניתוח במיקום המוצג פאנל F. החדרים הנותרים ללא OFT משמשים לתרבויות החדר כפי שמוצג באיור 6 (הלוח הימני). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: סכמטית מראה את זרימת העבודה של התרבות SV וחדר החדר. שמאלה: נוהל עבור תרבות SV. ראשית, ה-SV מוסר מ-e 11.5 לבבות ומושם על הוספת תרבות. הוסף מכיל קרום נקבובי בתחתית (8 יקרומטר נקבובית) והוא מצופה עם גורם הצמיחה מופחת ecm. התוספות ממוקמות לתוך הבארות של צלחת באורך 24 שעות. המדיום מתווסף הן בתחתית החדר העליון מבלי לכסות את ההסבר. התרבות גדלה למשך 5 ימים. לאחר 5 ימים, הקרום יוסר מהכנסת והוא מותקן על השקופיות לצורך דימות וניתוח. מימין: . הליך לתרבות החדר החדרים ללא SV, atria, ו-OFT מוסרים מ-e 11.5 לבבות והם מתורבתים כמתואר לעיל עבור SV. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: הפיכה-TFII הביטוי הוא איבד את נבטי SV ב vivo. (א) השקפה מצופה על e 11.5 לבבות. התמונה הקונקלית של סמן אנדותל (אדום) כי תוויות venosus סינוס (SV), נבטי כלילית (cs, קו מנוקד), ו אנדוקרדיום (לאנדו) רירית הלב לומן. (ב) יצרנית הורידים הפיכה-TFII (ירוק), גורם שעתוק וריד (trx), המבוטא ב-SV הוא איבד בהדרגה כמו נבטים לעזוב את SV ולגדול על החדר. מימין: הגדלה גבוהה יותר של הנבט הכלילי המוצג באזור התיבה של הלוח A. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: במודלים חוץ גופית של זהות ורידים ותכנות מראש. (א) ברייטפילד תמונה של רקמת SV תרבותית. נבטים וסקולריים (ראשי חץ) גדלים החוצה מן ההסבר המקורי (קו מנוקד שחור) על מצע ECM. (ב) אימונולווראונציה של תרבויות SV המסומנות בנוגדנים הסימנו את משטח התא האנדותל (VE-קדהרין), גרעיני תא אנדותל (erg 1/2/3), וריד והגרעין האפיאראטי (הפיכה-TFII). גרעינים הם חיוביים עבור שניהם ERG 1/2/3 ו-הפיכה-TFII ב-SV, אבל ERG 1/2/3 רק נבטים לעבור על ECM. סרגל בקנה מידה = 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: SV ו אנדוקרדיום מגיבים לבית מבחנה. (א) מוקד תדמית של שליטה בת 5 ימים ו-"התרבות הזאת" של החברה. תאי האנדותל מוכתמים ב-VE-קדהרין (ירוק), גרעיני תא אנדותל עם מוכתם ERG 1/2/3 (אדום) נוגדנים, וגרעיני תאים עם DAPI (כחול). (ב) אנגיוגנטית הצמיחה של תאים אנדותל הוא כימות על ידי מדידת אורך של הארכת נבט (המרחק המועבר על ידי erg 1/2/3 + התאים האנדותל מתוך ההסבר, המצוין על ידי קווים מוצק לבן בלוחות התחתונות של (א). (ג) דימוי מוקד של תרבות בת 5 ימים של שליטה ו-"החדרים המוטפלים". תאי האנדותל מוכתמים בנוגדנים בעלי-קדהרין (ירוק) ובגרעיני תאי האנדותל מוכתמים ב-ERG 1/2/3 (כחול). נקודות הן מדידות בודדות וקווי שגיאה ממוצע ± SD. סרגל קנה מידה = 200 יקרומטר (A, C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חלק מהצעדים הקריטיים ביותר לגידול בהצלחה באוניות כלילית מתוך הרקמות SV ו-אנדו הם: 1) זיהוי נכון ובידוד רקמת SV עבור תרבות SV; 2) שימוש בחללי החדרים מעוברים בין הגילאים e11-11.5 לתרבות אנדו מדויקת; 3) שמירה על תנאים סטריליים לאורך תקופת הניתוח ושמירה על הרקמות קרות בכל עת; ו 4) שמירה על explants מחוברים קרום ECM מצופה כדי למנוע רקמות צף במדיום.
ראשית, בידוד של רקמת SV יכול להיות מאתגר. חשוב להבין כי SV שוכנת בצד השני של הלב בין שמאל וימין אטריה חבוי בתוך lobules הריאה. לכן, קשה להפריד ולבודד. במקום זאת, יש לחלץ את כל הלב/הריאות כולו תחילה. SV מבודד מכן מן לקטוף ידי בזהירות הסרת אוניות ריאה ולנקות את הרקמות הסמוכות בעזרת מלקחיים עדינים. יתר על כן, אחד חייב להיות זהיר מאוד בעת ניקוי הרקמות הסמוכות לא לאבד את SV.
שנית, עבור אנגיוגנזה אנדוקרבוdial מדויק, חשוב החדרים התרבות מעוברים לא ישן יותר e 11.5. ב-12.5 ו עוברים מבוגרים, הקורוריות מ-SV לצמוח לחלק משמעותי של החדרים. לפיכך, כלי הדם הכליליים הגדלים מחללי החדרים הישנים יכולים להיות מורכבים מכלי הקיבול הכליליים SV-ו-אנדו1,2,10,19,20. מסיבה זו, כדי לאשר במדויק את צמיחת כלי הקיבול כלילית מן האנדו, זה קריטי לחללי התרבות (פחות SV ו-מערכת יוצאת) מ-e 11.5 עוברים20. בנוסף, ה-SV הוא גדול יחסית והוא קל יותר לבודד ב-e 11.5.
שלישית, מכיוון שהפרוטוקול כולל כמות משמעותית של עבודה מחוץ למכסה המנוע של הרקמה, חשוב לשמור על סביבת עבודה סטרילית. חשוב לעקר את כלי החיתוך (מלקחיים, מספריים וכו ') ואת לוחיות התרבות של הרקמה ולהימנע ממגע עם אזורים לא סטריליים בכל עת. חשוב לרסס את אזור העבודה ואת היקף החיתוך עם 70% אתנול. כדי למנוע זיהום, חשוב לבצע את תהליך הניתוח במהירות ולמזער את העבודה מחוץ למכסה המנוע של הרקמה.
הרביעית, כדי להשיג תרבויות החוקר בריא, חשוב כי explants להישאר מחוברים בסיס הקרום בכל עת. הרחבות צף במדיום יש להימנע כדי לגדול בהצלחה את התרבויות לחקור. כדי למנוע ריחוף, זה קריטי לשמור על ממשק נוזלי אוויר שבו משטח הבסיס של התוספת הוא במגע עם המדיום, אבל המשטח העליון נחשף לאוויר. ממשק כזה מתקבל כאשר ההסבר מכוסה מספיק על ידי המדיום, אך אינו שקוע במלואו. חשוב לנטר את עוצמת הקול של המדיום מדי יום, כאמצעי האחסון ניתן לאבד את האידוי. כדי למנוע זאת, לוח התרבות יכול להיות מחולל לחות על ידי הוספת PBS לתוך בארות שאינן בשימוש של לוחיות התרבות.
במקומות אחרים20מתוארים תרבויות דומות להסבר של SV ושל אנדו. בשיטות אלה, האקסוצמחים היו מתורבתים ישירות לתוך הבארות של לוחיות התרבות רקמה, אשר מגביל הדמיה ברזולוציה גבוהה מיקוד. התמונות שנלכדו בהגדרה זו הן באיכות ירודה יחסית לעומת השיטה המוצעת כאן, הגבלת ניתוחים מיקרוסקופיים מפורטים. כדי לעקוף זאת, אנו משתמשים בתוספים תרבותיים שמהם ניתן לקלף את הקרומים המכילים את התרבות ולרכוב על מגלשות הזכוכית להדמיה. זה מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה קונפוקלית וקד שבו פרטים סלולריים כגון דפוסי ביטוי מורפולוגיה ניתן לראות. בנוסף, culturing ישירות על הלוחות דורש פרוטוקול מכתים נפרד עבור DAPI או כתמים אחרים פאן-גרעיני סמן. פרוטוקול זה אינו דורש שלבי מכתים נפרדים מכיוון שניתן לטעון את השקופיות באמצעות אמצעי טעינה המכיל DAPI. יתר על כן, הרכבה על שקופיות מאפשר אחסון לטווח ארוך ללא פלורסנט מתפוגג, בעוד התרבויות המאוחסנות בבארות עם בינוני נוזלי יגרום לעמעום מהיר אינם מאפשרים אחסון לטווח ארוך והדמיה.
המודלים לתרבות החוץ-גופית המתוארים כאן הם אידיאליים לחקירת מנגנונים סלולאריים ומולקולריים של אנגיוגנזה כלילית באופן התפוקה והגישה הגבוהה. זה במערכת החוץ-גופית יכול לשמש למסך עבור תרופות פוטנציאליות או מטרות מולקולריות כדי להעריך את השפעתם על אנגיוגנזה כלילית. בנוסף, מערכת זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד את הרווח והפסד של הפונקציה של גנים שונים לתפקוד האוטונומי שלהם באנגיוגנזה כלילית. הבחנו כי נבטי כלילית מ-SV בעקבות ההגירה האפילנית בתרבויות מבחנה שלנו, מציע אינטראקציה חשובה בין תאי הכליליים כלילית ותאים אפיארקל. ידוע היטב כי האפילדיום הוא מקור עשיר של גורמי גדילה לאנגיוגנזה כלילית מ-SV. למשל, גורמי צמיחה אפיארdial-נגזר כגון ואלאבאלה הוכחו בעבר כדי להסדיר את האנגיוגנזה הנגזר של SV2,19. אנו יכולים להשתמש במערכת זו של התרבות SV כדי לחקור עוד יותר את האינטראקציה בין התאים האפיכליים והכלילית ולזהות מסלולים מולקולריים של הרומן הנגזר של אנגיוגנזה כלילית. בנוסף, הנתונים שלנו בvivo מראים כי היפוקסיה אוטם שריר עשוי להיות מעורב באנגיוגנזה אנדוקרבחיוג19. שלנו במערכת התרבות מבחנה מציעה מודל מעולה ללמוד את התפקיד של היפוקסיה ב אנגיוגנזה אנדוקרחיוג על ידי התרבות בארוי או normoxic תנאים. אלה הם ניסויים קשים לנהל vivo כי זה דורש עכבר בהריון להיות ממוקם בחדר ארוי נשלט. מתוך הניסיון שלנו, זה מאוד מאתגר לקבל תוצאות עקביות ואמין מתוך ניסויים vivo. לסיכום, מודל החוץ שלנו של אנגיוגנזה כלילית מספק מערכת אמינה לחקור מגוון רחב של שאלות הנוגעות לביולוגיה התאית והמולקולרית של אנגיוגנזה כלילית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים
Acknowledgments
המחברים מודים לחברי מעבדת שארמה על מתן סביבת מחקר תומכת. אנו אוהבים להאריך תודה מיוחדת לדיאן (די) ר. הופמן ששומר ודואג למושבת העכברים שלנו. אנחנו גם רוצים להודות לג פיליפ הSmaldino וקרולין ואן על הגהה יסודית של כתב היד והענקת הערות מועילות. עבודה זו הייתה נתמכת על ידי קרנות מהמשרד הראשי של האוניברסיטה הממלכתית ומחלקת הביולוגיה של B. S, אינדיאנה האקדמיה למדעים מחקר בכיר מענקים כספים ל-B. S, ו-NIH (RO1-HL128503) ואת הקרן ניו יורק גזע תא קרנות כדי K.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
References
- Red-Horse, K., et al. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).
- Volz, K. S., et al. Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle. Elife. 4, (2015).
- Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).
- Chang, A. H., et al. DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis. Genes and Development. , (2017).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).
- Das, S., Red-Horse, K. Cellular plasticity in cardiovascular development and disease. Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).
- Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways. Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).
- Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).
- Ruhrberg, C., et al. Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis. Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).
- Kikuchi, R., et al. An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease. Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).
- Folkman, J., et al. Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).
- Ferrara, N. The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis. Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).
- Ferrara, N., Bunting, S. Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).
- Sharma, B., et al. Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts. Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).
- Rhee, S., et al. Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease. Nature Communications. 9 (1), 368 (2018).
