Summary
관상 동맥 혈관신생의 시험관내 모델은 관상 동맥 혈관신생의 세포 및 분자 기전의 발견을 위해 이용될 수 있다. 부비동 및 심내막 조직의 체외 배원 배양은 VEGF-A에 반응하여 견고한 성장을 나타내고 생체 내에서와 같이 COUP-TFII 발현의 유사한 패턴을 표시한다.
Abstract
여기서, 우리는 관상 동맥 혈관신생을 연구하기 위한 시험관 내 배양 분석방법을 기술한다. 관상 동맥 혈관은 심장 근육을 공급하고 임상적으로 중요합니다. 이 혈관에 있는 결점은 환자에 있는 심근 경색 그리고 심부전으로 이끌어 낼 수 있는 동맥 경화증과 같은 가혹한 건강 리스크를 나타냅니다. 따라서 관상 동맥 질환은 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 그것의 임상 중요성에도 불구 하 고, 상대적으로 작은 진전 손상 된 관상 동맥을 재생 하는 방법에 만들어졌다. 그럼에도 불구하고, 최근 관상동맥 혈관 발달의 세포 기원 및 분화 경로를 이해하는 데 진전이 이루어지고 있다. 연구원이 형광성으로 선조 세포에 라벨을 붙이고, 그들의 운명을 따르고, 생체 내에서 자손을 시각화 할 수있는 도구와 기술의 출현은 관상 동맥 혈관 발달을 이해하는 데 중요한 역할을했습니다. 생체 내 연구는 가치가 있지만 실험 설계의 속도, 접근성 및 유연성 측면에서 한계가 있습니다. 양자택일로, 관상 동맥 혈관 신생의 정확한 시험관 내 모형은 이 한계를 우회하고 연구원이 속도와 융통성 있는 중요한 생물학 질문을 심문하는 것을 허용할 수 있습니다. 적절한 시험관 내 모델 시스템의 부족은 관상 동맥 혈관 성장의 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 진행을 방해 할 수있다. 여기서, 우리는 많은 관상 동맥이 발생하는 부비동(SV) 및 심내막(Endo)으로부터 관상동맥 혈관을 성장시키는 체외 배양 시스템을 설명한다. 우리는 또한 문화가 정확하게 생체 내 메커니즘의 일부를 재현 것을 확인했다. 예를 들어, 우리는 SV다운조절 COUP-TFII 발현으로부터의 배양물에서 혈관신생 콩싹이 생체내에서 관찰되는 것과 유사하다는 것을 보여준다. 또한 생체 내에서 잘 알려진 혈관 신생 인자 인 VEGF-A가 SV 및 엔도 문화 모두에서 혈관 신생을 강력하게 자극한다는 것을 보여줍니다. 종합적으로, 우리는 관상 동맥 혈관 신생을 공부하기 위하여 시험관 내 배양 모형을 고안했습니다.
Introduction
심혼의 혈관은 일반적으로 관상 동맥 혈관에게 불립니다. 이 혈관은 동맥, 정맥 및 모세 혈관으로 구성됩니다. 개발 하는 동안, 높은 분기 모 세 혈관 먼저 설립, 관상 동맥과 정 맥으로 리모델링1,2,3,4,5. 이들 초기 모세혈관은 내피카슘, 부비동(SV) 및 내막부(Endo) 조직1,6,7,8에서발견되는 내피전구 세포로부터 구축된다. SV는 배아 심장의 유입 기관이며 엔도는 심장 루멘의 내벽입니다. SV 및 엔도에서 발견되는 내피 전구 세포는 관상 동맥 혈관구조의 대부분을 구축하는 반면, 프로피카슘은 그것의 상대적으로 작은 부분에기여한다 2. 관상 동맥 혈관의 모세관 네트워크가 기존의 전구체 세포에서 심장에서 성장하는 과정을 관상 동맥 혈관 신생이라고합니다. 관상 동맥 질환은 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나이며이 질병에 대한 효과적인 치료법이 부족합니다. 관상 동맥 혈관 신생의 상세한 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 것은 손상된 관상 동맥을 복구하고 재생하는 새롭고 효과적인 치료법을 설계하는 데 유용 할 수 있습니다.
최근에는 관상 동맥 선박이 어떻게 개발되는지에 대한 이해가 급증하면서 새로운 도구와 기술의 개발을 통해 부분적으로 달성되었습니다. 특히, 생체내 계보 라벨링 및 첨단 영상 기술은 관상동맥 혈관의 세포 기원 및 분화 경로를 밝히는 데 매우 유용하여9,10,11,12. 이러한 생체 내 도구의 장점에도 불구하고 속도, 유연성 및 접근성 측면에서 는 한계가 있습니다. 따라서, 견고한 시험관 내 모델 시스템은 생체 내 시스템을 보완하여 관상 동맥 혈관신생의 세포 및 분자 메커니즘을 높은 처리량 방식으로 해명할 수 있다.
여기서, 우리는 관상 동맥 혈관신생의 시험관내 모델을 기술한다. 우리는 두 개의 전구 조직, SV 및 엔도에서 관상 동맥 혈관을 성장하는 시험관 내 배양 시스템을 개발했습니다. 이 모델을 통해, 우리는 시험관 내 조직 배양 배양이 성장 배지에 의해 자극될 때 관상 동맥 혈관 새싹을 성장한다는 것을 보여준다. 추가적으로, 배양 배양은 혈관 내피 성장 인자 A(VEGF-A)에 의해 자극될 때 대조군과 비교하여 급속히 성장하며, 매우 강력한 혈관신생 단백질이다. 더욱이, 우리는 SV 배양으로부터의 혈관신생 싹이 생체내SV 혈관신생과 유사한 기전인 정맥탈분화(COUP-TFII 발현의 손실)를 겪는다는 것을 발견하. 이러한 데이터는 시험관 내 배원 배양 시스템이 생체 내에서 발생하는 혈관신생 사건을 충실하게 회복한다는 것을 시사한다. 집합적으로, 여기에 기술되는 혈관신생의 시험관내 모델은 높은 처리량 및 접근 가능한 방식으로 관상 동맥 혈관신생의 세포 및 분자 기전을 조사하는 데 이상적입니다.
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Protocol
이 프로토콜에 있는 모든 동물의 사용은 볼 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 지침을 따랐습니다.
1. 시간 적정 임신을위한 마우스 브리더 를 구축하고 질 플러그를 감지
- 야생형 수컷 과 암컷 마우스로 마우스 사육 케이지를 설치한다. 사육 마우스의 나이가 6-8 주 사이인지 확인하십시오. 한 쌍 (1 남성과 1 암컷) 또는 번식을위한 트리오 (1 남성과 2 여성)로 설정합니다.
- 다음 날 아침 질 플러그를 확인하십시오. 각진 금속 프로브를 사용하여 질 개구부에 삽입하여 깊은 플러그를 감지합니다. 양수 질 플러그의 아침을 배아일 0.5(e0.5)로 지정합니다.
참고: 질 플러그는 표면적일 수 있습니다(쉽게 볼 수 있음, 그림 1참조) 또는 깊지 않은(쉽게 볼 수 없는). 깊은 플러그의 존재는 프로브의 전체 삽입을 차단하는 반면 플러그의 부재는 저항없이 전체 삽입을 허용합니다. - 배아가 수확될 e11.5에 도달할 때까지 임신 시간을 유지합니다. 배아를 수확하기 전에 임신을 확인하려면 e7.5와 e11.5 사이의 암컷 마우스의 체중을 기록하십시오.
참고 : 어머니의 체중의 매일 증가는 성공적인 임신을 나타내는 반면, 체중의 변화는 실패 한 임신을 나타냅니다.
2. 임신 한 마우스에서 배아 수확
참고 : 시작하기 전에 CO2 안락사 챔버, 70 % 에탄올, 종이 타월, 일반 집게, 미세 집게, 가위, 1x 멸균 인산 염기 완충 식염수 (PBS), 10cm 멸균 페트리 접시, 얼음이있는 용기, 천공 숟가락, 해부.
- 깨끗한CO2 안락사 챔버에 e11.5 임신 마우스를 놓고 그것을 희생하십시오. 마우스가 빠져나가는 것을 방지하기 위해 챔버의 뚜껑을 닫습니다.
- 마우스가 안락사 챔버에서 고정된 후 CO2를켭니다. IACUC 권장 사항당CO2의 유량을 조절해야 합니다(즉, 분당 10-30% 변위). 마우스가 완전히 안락사 된 후, 죽음을 보장하기 위해 자궁 경부 탈구를 수행합니다.
- 70% 에탄올로 마우스에 스프레이합니다. 집게를 사용하여 배 위에 피부를 들어 올리고, 가위를 사용하여 작은 절개를하고 절개를 측면으로 확장하십시오. 절개를 전방으로 확대하여 다이어프램까지 확대하고 배아를 함유하는 자궁경적을 노출한다(도2).
- 자궁을 잡고 무료로 절단하여 배아 (자궁 경적 + 배아)의 문자열을 당깁니다. 배아의 끈을 얼음차가운 멸균 1x PBS에 놓습니다.
- 자궁 경적으로부터 개별 배아를 해부하여 자궁근, 노른자 낭 및 양막을 하나씩 벗겨냅니다(그림 3A-F)를입체 현미경으로 합니다. 얼음에 멸균 1x PBS를 포함하는 페트리 접시에 천공 숟가락을 사용하여 청소 배아를 전송합니다. 배아를 차갑게 유지하십시오.
3. e11.5 배아에서 하트 분리
참고 : 시작하기 전에 일반 집게, 미세 집게, 1x 멸균 PBS, 10cm 멸균 페트리 접시, 6cm 멸균 페트리 접시, 얼음이있는 용기, 천공 숟가락, 해부 입체 현미경 : 다음 장비 및 시약을 가지고 있는지 확인하십시오.
- 스테레오현미경으로 얼음으로 차가운 멸균 1x PBS로 새로운 페트리 접시를 설정합니다. 2.5단계에서 태아를 페트리 접시로 옮겨 심장을 해부한다.
- 집게를 사용하여 배아의 머리를 제거합니다. 먼저 한 손으로 포셉 사이에 머리를 짜낸 다음 닫힌 집게를 사용하여 다른 손으로 머리를 긁어 냅니다(그림 4A-C).
- 머리를 제거한 후, 배아를 한 손으로 배꼽에 포인치로 잡고 복부 쪽으로 배아를 배양한다(도4D).
- 한편, 배아의 흉벽을 먼저 열어 미세한 집게를 이용하여 다이어프램 위 가슴에 작은 절개를 한다. 그런 다음 닫힌 집게를 삽입하고 집게를 열어 가슴 벽을 찢어 서 절개를 매우 신중하게 확대합니다. 심장을 손상시킬 수 있는 너무 깊게 밀어붙이지 않도록 하십시오. 집게의 도움으로 흉부 구멍에서 심장과 폐를 노출시키기 위해 가슴 벽을 넓게 열어 두십시오(그림 4E).
- 미세 한 집게를 사용 하 여 부드럽게 앞쪽 (90°) 심장을 이동 하 고 등쪽 대강/정 경을 노출. 심장 기저부에서 등쪽 대흉/정맥을 포착하여 심장/폐를 앞쪽으로 당깁니다(그림4F-H).
참고: 심장의 등쪽쪽에 위치한 SV의 찢어짐을 피하기 위해 심장/폐를 당기면서 부드럽게 하십시오. - 혈액 세포를 제거하기 위해 차가운 1x PBS로 심장 / 폐를 헹구고.
- 3.1-3.6 단계를 반복하여 나머지 배아에서 심장/폐를 제거합니다. 얼음에 고립 된 심장 / 폐를 유지해야합니다.
4. e11.5 배아 마우스 하트에서 SV와 심실을 분리
- 3.7단계에서 심장/폐로 페트리 접시를 스테레오현미경 으로 배치하여 SV와 전체 심실을 분리합니다. 미세 한 집게를 사용 하 여 그들의 루트에서 폐의 부착 된 엽을 하나씩 벗겨.
- 등쪽의 심장을 동양화하고 SV를 찢지 않고 SV를 전방으로 둘러싸는 심방과 인접한 조직을 제거합니다. 왼쪽 및 오른쪽 심방을 심장에서 제거하고 베이스를 잡고 미세 한 집게를 사용하여 긁어 냅니다(그림 5B). 유사한 기술을 사용하여 SV를 둘러싼 인접한 조직을 제거한다(도5C).
참고: 오른쪽 아트리움이 SV에 부착되어 있으므로 아트리움만 제거하도록 주의하십시오. - SV를 분리하기 위해 먼저 등쪽 측면이 위를 향하도록 심장을 방향을 정하고 (SV가 등쪽 쪽에 있기 때문에) 집게로 심실에서 심장을 부드럽게 잡고이 위치에 심장을 유지하십시오.
참고 : SV는 심장의 등쪽의 심방 사이에있는 배아 심장의 유입 기관입니다. - SV가 부착된 심장에서 조심스럽게 벗겨내거나 부착된 밑에 SV를 미세한 집게로 잡고 닫힌 집게로 긁어내어 SV를 제거합니다(그림5D,E).
- 멸균 된 전사 파이펫을 사용하여 얼음 차가운 멸균 1x PBS로 분리 된 SV를 새로운 6cm 페트리 접시로 옮기고 페트리 접시를 SV로 레이블을 지정합니다.
- 전체 심실을 분리하려면 SV를 제거 한 후 심장에서 유출 관 (대동맥 및 폐 트렁크)을 제거하십시오(그림 5F,G).
- 멸균 전달 파이펫을 사용하여 얼음에 멸균 1x PBS를 포함하는 새로운 6cm 페트리 접시에 전체 심실을 옮기고 페트리 접시를 심실로 라벨링합니다. 얼음에 고립 된 SV와 심실을 유지합니다.
- 4.1-4.7 단계를 반복하여 나머지 심장에서 SV와 심실을 분리합니다.
5. 삽입 및 세포 외 매트릭스 코팅으로 조직 배양 플레이트 설정
참고 : 시작하기 전에, 다음과 같은 장비 및 시약을 가지고 있는지 확인 : 상업 적 세포 외 매트릭스 용액 (예를 들어, 마트릴), 8.0 μM 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 배양 삽입, 24 웰 플레이트, 37 ° C, 5 %CO2 인큐베이터.
- ECM 용액을 얼음에 해동시키십시오. 굳어지지지 않도록 ECM 용액을 얼음 위에 두십시오.
- PET 멤브레인 배양 인서트(공극 크기 = 8.0 μm, 여과 면적 = 0.3 cm2,필터 직경 = 6.5 mm)를 처리된 비조직 배양물 24개의 웰플레이트에 놓는다. SV 또는 내분부 혈관신생 분석에 대한 SV 또는 심실로 플레이트를 각각 라벨.
참고: 두 배양을 동시에 수행할 때 SV와 심실을 위한 별도의 플레이트에 인서트를 설정합니다. 모든 실험 샘플 및 컨트롤에 충분한 웰을 설정해야 합니다. - ECM 용액이 해동된 후, 미리 냉각된 기저 매질(즉, EBM-2 기저 매물, 재료 표참조)에서 ECM 1:2를 충분한 부피(100 μL/삽입 x 삽입 수)로 즉시 희석합니다.
참고: 예를 들어, 6개의 인서트가 있는 경우 총 부피는 100 μL x 6 = 600 μL이 됩니다. - 갓 희석된 ECM 100 μL로 인서트를 멤브레인 위에 직접 첨가하여 코팅합니다. ECM이 고화될 수 있도록 플레이트를 37°C에서 30분 이상 배양합니다.
참고 : 이것은 오염을 피하기 위해 층류 조직 배양 후드에서 수행해야합니다.
6. SV 및 전체 심실 문화
참고 : 시작하기 전에, 다음과 같은 장비와 시약을 가지고 있는지 확인 : 70 % 에탄올, 전송 파이펫, 입체 현미경, 집게, 층류 조직 배양 후드, 미세 혈관 내피 세포 보충 키트(재료의 표),기저 매체, 1x 멸균 PBS). 도 6은 SV 및 심실 배양물의 워크플로우를 나타낸다.
- 얼음에 보충 키트의 내용을 해동. 인증된 층류 조직 배양 후드 하에 500 mL의 기초 배지에 보충 키트의 모든 내용을 추가하여 완전한 배지를 준비한다. 매체를 잘 섞고 50 mL aliquots로 분배하십시오.
- 70% 에탄올로 입체 현미경 및 주변 작업 영역의 베이스를 살균합니다.
- 5.4단계에서 조직 배양판을 얻었다. 전사 파이펫의 도움으로, 조심스럽게 삽입 막의 상단에 단계 4.7에서 이식을 전송합니다. 입체 현미경과 깨끗한 집게의 도움으로, 그들은 인서트의 모서리에 붙어 또는 측면 벽에 부착되지 않도록 삽입의 중심에 이식을 배치합니다.
- 이식을 배치하고 인서트를 중심으로 한 후 인서트를 조심스럽게 제거하고 플레이트의 뚜껑을 닫습니다.
- 층류 조직 배양 후드 하에서, 삽입물의 기저 표면이 매체와 접촉하도록 공기-액체 계면에서 이식하는 배양에 웰에 미리 온화된 완전한 배지의 100 μL및 200 μL을 추가 그러나 상단 표면은 공기에 노출됩니다.
참고: 다른 크기의 인서트를 사용하는 경우 공기-액체 인터페이스를 얻기 위해 볼륨을 조정해야 합니다. - 300 μL의 PBS를 24개의 웰 플레이트의 사용하지 않은 우물에 넣고 뚜껑으로 덮습니다. 플레이트를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 배양하고, 5일 동안 배양을 성장시다.
- 다음 날에, 정기적으로 배란 배양의 상태를 평가하기 위해 반전 된 빛 현미경의 밑에 배양을 관찰합니다. 이식이 수축 박동을 나타내고 모든 이식이 ECM에 내장 된 멤브레인의 바닥에 부착되어 있는지 확인하십시오. 부동 이식에 유의하십시오.
참고: 이식의 주기적인 수축은 이식이 살아 있음을 나타냅니다. 부동 이식은 분석에서 생략되어야 합니다. - 배양 상태를 평가한 후, 배양판을 인큐베이터에 다시 넣고 최대 5일 동안 배양을 계속 성장시다.
7. VEGF-A를 가진 배양의 처리 (긍정적인 통제)
참고 : 시작하기 전에, 다음과 같은 장비와 시약을 가지고 있는지 확인 : 층류 조직 배양 후드, 1x PBS, 기저 매체 + 1 % 태아 소 혈청 (FBS), 기저 매체 + VEGF-A, 파이펫, 파이펫 팁.
- 기저 배지 + 1% FBS 및 기저 배지 + VEGF-A를 준비한다.
- 기저 배지 + 1% FBS를 준비하려면 먼저 필요한 제어 웰의 수를 결정합니다. 예를 들어, 3개의 제어 웰이 있는 경우 300 μL/well x 3 = 900 μL이 필요한 총 부피입니다. 기저 배지 + 1% FBS를 만들기 위해 891 μL의 기저 배지에 FBS 9 μL을 추가합니다.
- 기저 배지 + VEGF-A를 준비하려면, 먼저 VEGF-A 배지가 필요한 웰의 총 수를 결정한다. 3개의 웰이 있는 경우, 300 μL/well x 3 = 900 μL은 총 부피이고 50 ng/well x 3 = 150 ng VEGF-A입니다. 기초 배지 + VEGF-A를 만들기 위해 900 μL의 기초 배지에 VEGF-A 150 ng를 첨가합니다.
참고: 각 실험에 대해 충분한 수의 작은 aliquot를 보장하기 위해 계산된 것보다 더 큰 부피로 이 솔루션을 조립합니다.
- 2일째에는 두 챔버(인서트와 웰)에서 미디어를 제거합니다. 인서트가 100 μL이고 웰에 200 μL을 추가하여 300 μL의 1x PBS로 배양을 세척합니다. 플레이트를 몇 번 단단히 소용돌이시키고 PBS를 제거합니다.
- 기저 배지 300 μL + 1% FBS (삽입에 100 μL, 우물에 200 μL)를 추가하여 24 시간 동안 배양을 굶어 넣습니다.
- 기아 후 3일째, 기저 배지 300 μL + 1% FBS(삽입부에 100 μL, 우물에 200 μL)를 추가하여 대조군 우물과 기초 배지 + VEGF-A(50 ng/well)를 각각 치료 용정에 넣습니다.
- 치료 후, 인큐베이터에서 배양을 계속 성장시다.
8. 고정 및 면역 염색
참고 : 시작하기 전에, 다음과 같은 장비 및 시약을 가지고 있는지 확인하십시오 : 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA), 1 x PBS, 1 차 및 이차 항체, 셰이커, PBS (PBT)에서 0.5 % 난외 계면 활성제.
- 배양 6일째에, 배지를 제거하고 실온(RT)에서 1x PBS로 배양한다.
- 4% PFA 용액 200 μL을 웰에 추가하고 100 μL을 인서츠에 추가하여 배양을 고정합니다. 흔들면서 20 분 동안 4 °C에서 배양을 수정하십시오.
- 20 분 고정 후, 연기 후드의 배양물에서 PFA를 제거하고 200 μL을 웰에 추가하고 100 μL을 삽입에 추가하여 1x PBS로 배양을 씻습니다.
- 흔들면서 각각 3회, 10분씩 반복해서 바하십시오. 그런 다음 면역 염색을 수행하십시오.
참고: 모든 세척 단계는 RT의 벤치탑에서 수행됩니다.
- 차단 용액에서 1 차 항체 (항 VE-Cadherin, 항 ERG 1/2/3)를 희석합니다 (5 % 당나귀 혈청, 0.5 % PBT). 1차 항체 용액 300 μL을 추가합니다(하단 우물에 200 μL, 인서츠에 100 μL). 흔들면서 4°C에서 하룻밤 동안 1차 항체에서 배양배양한다.
참고: 항-VE-카데린 내피 세포막에 라벨을 붙이는 데 사용되며, 내피 세포의 혈관신생 콩나물을 시각화하기 위해 내피 세포 핵에 라벨을 붙이는 데 사용됩니다. - 다음날, 0.5% PBT로 배양판을 10배 세척하고 흔들어 10분마다 PBT를 변경한다.
- 차단 용액에서 이차 항체(당나귀 항래성 알렉사 플루어 488 및 당나귀 항토끼 알렉사 플루르 555)를 희석한다. 8.2단계에서와 같이 이차 항체의 300 μL을 추가하고 흔들면서 4°C에서 밤새 배양하였다. 다음날, PBT에서 이차 항체를 10배 세척하고, 10분마다 PBT를 변화시다.
참고 : 최소 10 배의 세척을하지만 더 많은 세척이 더 좋습니다. 세스가 완료되면 배양은 슬라이드에 장착될 때까지 1x PBS로 저장할 수 있습니다.
9. 슬라이드, 이미징 및 분석에 문화 를 장착
참고 : 시작하기 전에, 다음과 같은 장비와 시약을 가지고 있는지 확인: 미세 집게, 슬라이드, 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), 커버 립, 및 공초점 현미경장착 매체. 이차 항체 염색 후, 다음 단계를 사용하여 이미징을 위해 배양을 슬라이드에 장착합니다.
- 미세 한 집게를 사용 하 여 삽입에서 조심스럽게 막을 벗겨 하 고 아래로 막 측면을 배치 하 고 배양 배양 위쪽으로 배치 하 여 슬라이드에 전송. 복제 샘플을 동일한 슬라이드에 배치하고 슬라이드를 컨트롤 또는 VEGF-A로 레이블을 지정합니다. DAPI를 사용하여 몇 방울의 장착 매체를 멤브레인에 직접 떨어뜨리고 커버 슬립으로 슬라이드를 덮습니다.
참고: 커버슬립을 배치하는 동안 기포를 피하십시오. - 명확한 매니큐어로 슬라이드의 가장자리를 밀봉하고 건조시키십시오.
참고: 슬라이드는 장기 보관을 위해 -20 °C에 보관할 수 있습니다. - 공초점 현미경을 사용하여 이미지 슬라이드.
- 분석을 수행하여 혈관신생 성장의 길이를 측정합니다. 내피 세포의 거리를 측정하여 혈관 신생 자성장 길이를 정량화 (Ve-Cadherin +/ERG 1/2/3+) 심실 배양에서 ERG의 내부 경계에서 확장 및 SV 배양에서 SV 이식의 중심에서.
- 피지 / ImageJ를 사용하여 정량화를 수행하려면 먼저 FIJI 소프트웨어를 다운로드하십시오.
- FIJI에서 이미지 파일 열기: 파일 | 오픈 | 폴더 | 파일 이름 | 을 엽니다.
- 분석으로 이동 | 측정 설정 | 둘레 를 선택합니다.
- 주 창에서 직선 도구를 선택합니다.
- 9.4단계에서 제안된 대로 새싹의 길이에 걸쳐 선을 그립니다.
- 분석으로 이동 | 측정.
참고: 길이 측정이 새 창에 표시됩니다. - 무작위로 선택된 시야를 3개 이상 나타내는 이미지에서 정량화를 수행합니다. 새싹 길이 를 평균화± 표준 편차로 보고한다.
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Representative Results
생체 내에서 SV 혈관신생의 가장 눈에 띄는 특징 중 하나는 특정 경로를 따르고 고정관상 정적인 시간 및 위치1에서발생하는 세포 탈분화 및 재분화 이벤트를 수반한다는 것이다. 초기 SV 세포가 심실로 성장함에 따라 COUP-TFII(그림 7)와같은 정맥 마커 생성을 중단합니다. 그 후, 관상 동맥 새싹은 심근 의 표면 또는 심근 깊은 두 개의 이동 경로를 합니다. 표면 혈관은 결국 혈관을 침입하는 동안 정맥이된다 동맥과 모세혈관이된다 1,6,7. 이 구별은 심혼이 증가하고 관상 동맥 이 확장될 때 보존됩니다.
관상 동맥 발달의 분자 기초의 발견을 촉진하기 위하여, 우리는 기능 상실 및 기능 의 이득 실험에 이용될 수 있는 SV 발아의 체외 모형을 고안했습니다. 배아 마우스 심장으로부터의 SV 조직은 해부되고, 희석된 ECM의 상부에 배치되고(이는 시판되고, 물질표참조), 내피 세포 성장 배지에서 공기-액체 계면에서 유지된다. SV 심근은 문화 기간 내내 이길 것을 계속합니다. 배양에서 2 일 후에, 조직을 일렬로 세워주는 상피 세포는 이식을 떠나 매트릭스상으로 이동한다. 5 일 후, SV 내피 세포가 싹을 내고 후두 조직으로 이동합니다(그림 8A,검은 화살촉). 전체적으로, 이 프로세스는 관상 동맥 발달의 혈관 신생 양상을 회상합니다.
배양 된 SV 콩나물은 또한 정맥 탈화를 겪습니다. 배아 심장에서와 같이, COUP-TFII 발현은 혈관이 SV로부터 멀어짐에 따라 감소된다(도8B, 도 7과비교). 탯줄 또는 노른자 낭 동맥 및 정맥과 같은 통제 혈관은 발아 혈관을 생성할 수 있습니다. 그러나, 그들은 수에 적고 길이가 짧으며 동맥 또는 정맥 정체성을 변경하지 않습니다 (도시되지 않음). 따라서, 정맥 재프로그래밍은 SV 발아에 특이적이며 혈관신생또는 ECM 성분에 대한 반응의 일반적인 특징이 아니다. 이러한 데이터는 또한 SV 자체에 포함된 세포 유형이 탈분화를 유도하기에 필요하고 충분하다는 것을 나타낸다.
혈관 내피 성장 인자 A(VEGF-A)는 혈관신생7,13,14,15,16,17,18의강력한 유도제인 것으로 잘 알려져 있다. 이전 연구는 심근 VEGF-A가 관상 동맥 혈관을 성장하는 내분 성 혈관 신생을 자극하는 것으로 나타났습니다7. 또한, 관상 동맥 내피 세포는 VEGF-A 수용체를 발현하는 것으로 나타났으며, SV 유래 관상동맥 혈관은 생체내 VEGF-A에 반응하여 성장할 수 있다2. 관상 동맥 혈관 신생의 우리의 체외 모델이 VEGF-A에 충실하게 반응한다는 것을 보여주기 위해, 우리는 VEGF-A로 SV 및 엔도 배양을 자극했습니다. 예상대로, 우리의 결과는 SV와 엔도 모두 VEGF-A에 매우 반응하는 것으로 나타났다. VEGF-A로 자극된 배양물은 밀도 및 길이 모두에서 혈관신생 콩나물의 성장을 증가시켰습니다(도9A,C). VEGF-A에 의해 자극된 SV 배양물은 대조군과 비교하여 새싹 길이가 거의 3배 증가하는 것을보여준다(도 9B). 이러한 결과는 SV와 엔도에서 내피 콩나물이 생체 내에서 알려진 유사한 단서에 반응한다는 것을 시사한다.
종합하면, 우리의 데이터는 이러한 시험관 내 배영이 VEGF-A 자극에 대한 응답으로 정맥 탈분화 및 견고한 성장을 포함하여 생체 내 관상 동맥 발달 중에 발생하는 유사한 세포 및 분자 이벤트를 공유한다는 것을 시사한다. 따라서, 우리의 데이터는 이러한 배양 배양 모델이 시험관내에서 관상동맥 혈관신생을 연구하는데 유용하다는 것을 시사한다.
그림 1: 질 플러그 식별. (A)질 플러그 (흰색 반점). (B)질 플러그를 포함한 박스화된 영역의 확대보기(화살표로 표시). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 임신한 마우스의 자궁에서 배아 문자열에 접근. 안락사 된 임신 마우스는 복부 표면을 위로 배치하고 해부를 위해 젖은 피부에 70 % 에탄올로 분무됩니다. 피부는 집게를 사용하여 골반 지구에 위로 당겨지고 작은 절개가 만들어집니다. 절개는 측면으로 확장됩니다. 추가 절개는 격막까지 전방에 만들어집니다. 자궁에서 배아의 문자열이 보입니다 (화살촉으로 표시). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 자궁에서 배아의 해부 및 제거. (A)배아의 끈을 포함하는 자궁을 보여주는 이미지. 배아의 등쪽 (태반이있는 쪽의 반대)의 막이 벗겨져 있습니다. (B)노른자 낭의 배아가 자궁막을 벗겨낸 후 보입니다. (C, D) 탯줄로 태반에 부착된 배아는 노른자 낭을 벗겨낸 후에 볼 수 있다. 양막은 여전히 존재하는 경우 벗겨. (E)탯줄에 의해 태반에 부착된 배아를 나타내는 이미지. (F)탯줄(Umb)을 당겨 태반으로부터 배아의 분리를 보여주는 이미지. 코드) 집게를 사용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 배아에서 뽑아낸 심장/폐의 제거. (A, B) 머리는 목을 붙잡고 그것을 긁어 내어 태아에서 제거됩니다. (C)본문에서 머리를 제거한 것을 보여주는 이미지. (D)심장 해부에 대한 배아의 올바른 위치. 태아는 심장의 제거를 위한 흉강 구멍에 쉽게 접근할 수 있도록 복부 측으로 위로 위치합니다. 배아가 D에 표시된 대로 배치되면, 가슴 구멍은 집게로 열립니다. (E)복부 측에 노출된 심장을 가진 열린 흉부 구멍을 보여주는 이미지. (F)SV를 손상시키지 않고 심장을 제거하려면, 심장이 앞쪽으로 뒤집혀 등대대가 보이게 됩니다. (G)등쪽 대강장/정맥이 집게로 포착되고 심장/폐가 앞쪽으로 당겨지는 심장/폐의 기저부에서의 위치를 보여주는 이미지. (H)이미지는 배아에서 제거된 e11.5 심장/폐 를 나타낸다. V. 심장 = 복부 심장; d. 심장 = 등쪽 심장; d. 대물 = 등쪽 대반; LA = 왼쪽 아트리움; RA = 오른쪽 심방; LV = 좌심실; RV = 우심실. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 배아 심장으로부터 SV및 심실을 분리한다. (a)e11.5 배아로부터 뽑아낸 분리된 심장/폐의 등쪽 뷰를 보여주는 이미지. 심장에 있는 SV의 위치가 표시됩니다. (B)폐 싹이 제거 된 후 심장의 이미지. (C)SV를 둘러싼 Atria 및 인접 조직이 제거되어 대불을 드러냅니다. SV의 위치에 레이블이 지정되어 있습니다. (D)SV 제거를 보여주는 이미지입니다. 집게를 사용하여 SV는 베이스에 붙잡고 심장에서 긁힙됩니다. (E)심혼에서 제거된 SV는 심혼의 나머지 조직과 함께 도시된다. 대동맥과 폐 트렁크 (PT), 통칭 유출 지역 (OFT)라고, SV가 제거 된 후 심장에서 볼 수 있게. SV는 도 6(왼쪽 패널)에 기재된 바와 같이 시험관 내 배양에 사용될 것이다. (F)해부될 OFT의 위치는 파선 흰색 선으로 표시됩니다. (G)대동맥/PT(유출관)는 패널 F에 표시된 위치에서 해부에 의해 심실에서 제거된다. OFT가 없는 나머지 심실은 그림 6(오른쪽 패널)에 나타난 바와 같이 심실 배양에 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: SV 및 심실 배양물의 워크플로우를 보여주는 회로도. 왼쪽: SV 문화어를 위한 절차. 먼저, SV는 e11.5 하트에서 제거되고 배양 삽입에 놓입니다. 인서트 하단(8 μm 기공)에 다공성 멤브레인을 함유하고 있으며 ECM 감소된 성장 인자로 코팅된다. 인서트를 24웰 플레이트의 웰에 넣습니다. 배지는 배식물을 덮지 않고 바닥 및 상부 챔버에 모두 첨가된다. 문화는 5 일 동안 재배됩니다. 5 일 후, 멤브레인은 삽입에서 제거되고 이미징 및 분석을 위해 슬라이드에 장착됩니다. 오른쪽: 심실 배양 절차. SV, 심ria 및 OFT가 없는 심실은 e11.5 하트로부터 제거되고 SV에 대해 전술한 바와 같이 배양된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: COUP-TFII 발현은 생체 내에서 SV 콩나물에서 손실된다. (A)e11.5 하트의 등도보기. 부비동(SV), 관상 동맥 콩나물(cs, 점선), 심내막(endo)을 표지하는 내피 마커(빨간색)의 공초점 이미지. (B)정맥 제조업체 COUP-TFII(녹색), SV에서 발현되는 정맥 전사 인자(trx)는 새싹이 SV를 떠나 심실로 성장함에 따라 점진적으로 손실된다. 오른쪽: 패널 A. 스케일 바 = 100 μm의 박스형 영역에 표시된 관상 동맥 새싹의 더 높은 배율은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 정맥 정체성 및 재프로그래밍의 시험관 내 모델. (A)배양 된 SV 조직의 밝은 필드 이미지. 혈관 콩나물(화살촉)은 ECM 기판 위에 원래 의 이식(검은색 점선)으로부터 자랍니다. (B)내피 세포 표면을 표시하는 항체로 표지된 SV 배양의 면역형광(VE-Cadherin), 내피 세포 핵(ERG 1/2/3), 정맥 및 상피 핵(COUP-TFII). 핵은 SV에서 ERG 1/2/3 및 COUP-TFII 모두에 대해 긍정적이지만, ERG 1/2/3은 ECM을 통해 이동하는 새싹에서만 가능합니다. 배율 표시줄 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 9: SV 및 심내막은 시험관내에서 VEGF-A에 반응한다. (a)5일 된 대조군 및 VEGF-A 처리 된 SV 배식물 배양물의 공초점 이미지. 내피 세포는 VE-카데린 (녹색), ERG 1/2/3 (적색) 항체로 염색 된 내피 세포 핵, DAPI (파란색)를 가진 세포 핵으로 면역 염색됩니다. (B)내피 세포의 혈관 신생 성장은 새싹 연장의 길이를 측정하여 정량화된다 (ERG에 의해 이동 된 거리 1/2/3+ 내피 세포에서 내피 세포, 의 하단 패널에 흰색 실선으로 표시(A). (C)대조군 및 VEGF-A 처리된 심실의 5일 된 배양물의 공초점 이미지. 내피 세포는 VE-카데린(green)으로 면역염색되고 내피 세포 핵은 ERG 1/2/3(청색) 항체로 염색된다. 도트는 개별 측정및 오차 막대는 평균 ± SD. 스케일 바 = 200 μm(A,C)이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
SV 및 엔도 전구 조직으로부터 관상 동맥 혈관을 성공적으로 성장시키는 가장 중요한 단계 중 일부는 다음과 같습니다: 1) SV 배양을 위한 SV 조직을 올바르게 식별하고 격리하는 단계; 2) 정확한 엔도 배양을 위해 e11-11.5의 나이 사이의 배아로부터의 심실을 사용하는 단계; 3) 해부 기간 내내 멸균 상태를 유지하고 조직을 항상 차갑게 유지; 및 4) 배지에 부동하는 조직을 피하기 위해 ECM 코팅 막에 부착된 이식을 유지한다.
첫째, SV 조직의 격리는 어려울 수 있습니다. SV는 폐 소엽 안에 숨겨진 왼쪽과 오른쪽 심방 사이의 심장의 등쪽 쪽에 놓여 있다는 것을 깨닫는 것이 중요합니다. 따라서 분리 및 분리가 어렵습니다. 대신, 전체 심장 /폐 뽑아 먼저 추출해야합니다. SV는 조심스럽게 폐 소엽을 제거하고 미세 집게의 도움으로 인접한 조직을 청소하여 뽑기에서 분리됩니다. 또한 SV를 잃지 않도록 인접한 조직을 청소하는 동안 매우 주의해야합니다.
둘째, 정확한 내분부 혈관 신생을 위해, e11.5보다 나이가 많은 배아에서 심실을 배양하는 것이 중요합니다. e12.5 이상 배아에서, SV에서 관상동맥은 심실의 상당한 비율로 증가합니다. 따라서, 오래된 심실로부터 성장하는 관상동맥 혈관은 SV-및 엔도 유래 관상동맥 혈관둘다로 구성될 수 있다1, 2,10,19,20. 이러한 이유로, 엔도로부터관상동맥혈관생감을 정확하게 분석하기 위해, e11.5배아20으로부터의배양심실(SV 및 유출관 제외)에 중요하다. 또한 SV는 상대적으로 크고 e11.5에서 쉽게 격리할 수 있습니다.
셋째, 프로토콜은 조직 배양 후드 외부에서 상당한 양의 작업을 수반하기 때문에 멸균 작업 환경을 유지하는 것이 중요합니다. 해부 도구 (집게, 가위 등)와 조직 배양 판을 살균하고 항상 살균되지 않은 부위와의 접촉을 피하는 것이 중요합니다. 70 % 에탄올로 작업 영역 및 해부 범위를 분무하는 것이 중요합니다. 오염을 피하기 위해, 신속하게 해부 절차를 수행하고 조직 배양 후드 외부 작업을 최소화하는 것이 중요하다.
넷째, 건강한 이식 배양을 얻으려면, 이식은 항상 막의 기저에 부착 된 상태로 유지하는 것이 중요하다. 배지에 부동 이식은 성공적으로 이식 배양을 성장하지 않도록해야합니다. 부동을 방지하려면 인서트의 기저 표면이 매질과 접촉하지만 상단 표면이 공기에 노출되는 공기-액체 인터페이스를 유지하는 것이 중요합니다. 이러한 인터페이스는 이식이 매질에 의해 충분히 커버되지만 완전히 침수되지 않을 때 얻어진다. 증발로 인해 부피가 손실될 수 있으므로 매일 매체의 부피를 모니터링하는 것이 중요합니다. 이를 방지하기 위해, 배양 플레이트는 배양 플레이트의 사용되지 않는 웰에 PBS를 첨가하여 가습될 수 있다.
SV 및 엔도의 유사한 배양 배양은 다른곳에서 20에기재되어 있다. 이러한 방법에서, 이식은 고해상도 공초점 이미징을 제한하는 조직 배양 판의 우물로 직접 배양되었다. 이 설정에서 캡처한 이미지는 여기에 제안된 방법에 비해 상대적으로 품질이 좋지 못하여 상세한 현미경 분석이 제한됩니다. 이를 우회하기 위해 배양을 포함하는 멤브레인을 박리하고 이미징을 위해 유리 슬라이드에 장착할 수 있는 배양 인서트를 활용했습니다. 이를 통해 표현 패턴 및 형태와 같은 셀룰러 세부 사항을 볼 수 있는 고해상도 공초점 이미징이 가능합니다. 또한 플레이트에서 직접 배양하려면 DAPI 또는 기타 범핵 마커 염색을 위한 별도의 염색 프로토콜이 필요합니다. 이 프로토콜은 슬라이드를 DAPI를 포함하는 마운팅 매체와 함께 장착할 수 있기 때문에 별도의 염색 단계가 필요하지 않습니다. 또한 슬라이드에 장착하면 형광 페이드 없이 장기 보관이 가능하지만 액체 배지가 있는 우물에 저장된 배양은 빠르게 퇴색하고 장기 보관 및 이미징을 수행할 수 없습니다.
여기에서 기술된 시험관내 배양 모델은 높은 처리량 및 접근 가능한 방식으로 관상 동맥 혈관신생의 세포 및 분자 기전을 심문하는 데 이상적입니다. 이 시험관 내 시스템은 관상 동맥 혈관 신생에 대한 그들의 효과를 평가하기 위해 잠재적 인 약물 또는 분자 표적을 스크리너드하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 이 시스템은 또한 관상 동맥 혈관 신생에서 그들의 자율적인 기능에 대한 다양한 유전자의 기능 의 이득 및 기능 상실을 연구하는 데 사용될 수 있다. 우리는 SV에서 관상 동맥 새싹이 관상 동맥 내피 세포와 후두 세포 사이 중요한 상호 작용을 건의하는 우리의 시험관 내 배양에 있는 에피문 이동을 따랐다는 것을 관찰했습니다. 상피막이 SV로부터관상 동맥 혈관신생을 위한 풍부한 성장 인자인것으로 잘 알려져 있다. 예를 들어, VEGF-C 및 ELABELA와 같은 에피카디얼 유래 성장 인자는 이전에 SV 유래 관상 동맥 혈관신생2,19를조절하는 것으로 나타났다. 우리는 상피와 관상 동맥 내피 세포 사이 상호 작용을 추가로 조사하고 관상 동맥 혈관신생의 새로운 심부 유래 분자 경로를 확인하기 위하여 이 SV 문화 시스템을 사용할 수 있습니다. 추가적으로, 우리의 생체 내 데이터는 심근 저산소증이 내분성 혈관신생19에서관련시킬 수 있다는 것을 건의합니다. 우리의 시험관 내 배양 시스템은 저산소 또는 노르목 성 조건에서 배양하여 내분 부 혈관 신생에서 저산소증의 역할을 연구하는 훌륭한 모델을 제공합니다. 이들은 임신한 마우스가 통제된 저산소 챔버에 배치될 것을 요구하기 때문에 생체 내에서 수행하기 어려운 실험이다. 우리 자신의 경험에서, 생체 내 실험에서 일관되고 신뢰할 수있는 결과를 얻는 것은 매우 어렵습니다. 요약하면, 관상 동맥 혈관 신생의 우리의 체외 모델은 관상 동맥 혈관 신생의 세포 및 분자 생물학에 관한 질문의 넓은 범위를 심문하는 신뢰할 수있는 시스템을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 지원 연구 환경을 제공 샤르마 연구소의 구성원에게 감사드립니다. 우리는 우리의 마우스 식민지를 유지하고 돌보는 다이앤 (디) R. 호프만에게 특별한 감사를 전하고 싶습니다. 우리는 또한 철저하게 원고를 교정하고 유용한 의견을 제공 필립 J. 스말디노 박사와 캐롤린 반 감사드립니다. 이 작품은 볼 스테이트 대학 프로보스트 사무실과 생물학학과에서 B.S에, 과학 수석 연구 보조금 기금 B.S에 인디애나 아카데미, NIH (RO1-HL128503) 및 뉴욕 줄기 세포 재단 기금K.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
References
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