Summary
In vitro modeller av koronar angiogenes kan utnyttjas för upptäckten av cellulära och molekylära mekanismer av koronar angiogenes. In vitro explant kulturer av sinus venosus och endokarium vävnader visar robust tillväxt som svar på VEGF-A och visa ett liknande mönster av COUP-TFII uttryck som in vivo.
Abstract
Här beskriver vi en in vitro kultur analys för att studera koronar angiogenes. Födans kärl mata hjärtmuskeln och är av klinisk betydelse. Defekter i dessa fartyg utgör allvarliga hälsorisker såsom åderförkalkning, vilket kan leda till hjärtinfarkt och hjärtsvikt hos patienter. Följaktligen är kranskärlssjukdom en av de vanligaste dödsorsakerna i världen. Trots sin kliniska betydelse, relativt lite framsteg har gjorts om hur man regenerera skadade kranskärl. Icke desto mindre har de senaste framstegen gjorts när det gäller att förstå de cellulära ursprung och differentieringsvägarna för utvecklingen av koronarfartyg. Tillkomsten av verktyg och teknik som gör det möjligt för forskare att fluorescerande märka stamceller, följa deras öde, och visualisera stamceller in vivo har varit avgörande för att förstå koronar fartyg utveckling. In vivo-studier är värdefulla, men har begränsningar när det gäller hastighet, tillgänglighet och flexibilitet i experimentell design. Alternativt kan exakta in vitro-modeller av koronar angiogenes kringgå dessa begränsningar och göra det möjligt för forskare att förhöra viktiga biologiska frågor med snabbhet och flexibilitet. Bristen på lämpliga in vitro-modellsystem kan ha hindrat utvecklingen av att förstå de cellulära och molekylära mekanismerna för kranskärlstillväxt. Här beskriver vi ett in vitro-odlingssystem för att odla kranskärl från sinus venosus (SV) och endokarium (Endo), de två stamtoniska vävnader som många av koronarkärlen uppstår. Vi bekräftade också att kulturerna korrekt sammanfattar några av de kända in vivo-mekanismerna. Till exempel visar vi att angiogengroddar i kultur från SV downregulate COUP-TFII uttryck liknar vad som observeras in vivo. Dessutom visar vi att VEGF-A, en välkänd angiogenic faktor in vivo, stimulerar robust angiogenes från både SV- och Endo-kulturerna. Tillsammans har vi utarbetat en korrekt in vitro kultur modell för att studera koronar angiogenes.
Introduction
Blodkärl i hjärtat kallas vanligen kranskärl. Dessa fartyg består av artärer, åder och kapillärer. Under utvecklingen, mycket grenade kapillärer upprättas först, som sedan omforma till kranskärl och vener1,2,3,4,5. Dessa inledande kapillärer är byggda av endotelstamceller som finns i proepikardium, sinus venosus (SV) och endokarium (Endo) vävnader1,6,7,8. SV är inflödesorganet i embryonala hjärta och Endo är hjärtats innerslemhinna. Endotelstamceller som finns i SV och Endo bygger majoriteten av koronarvaskulatur, medan proepikardium bidrar till en relativt liten del av det2. Den process genom vilken kapillärnätverket av kranskärl växer i hjärtat från sina befintliga prekursorceller kallas koronar angiogenes. Kranskärlssjukdom är en av de vanligaste dödsorsakerna i världen och ändå saknas en effektiv behandling för denna sjukdom. Förstå detaljerade cellulära och molekylära mekanismer av koronar angiogenes kan vara användbart för att utforma nya och effektiva terapier för att reparera och regenerera skadade kranskärl.
På senare tid har en ökning av vår förståelse av hur koronarfartyg utvecklas delvis uppnåtts genom utveckling av nya verktyg och tekniker. I synnerhet har in vivo härstamningsmärkning och avancerad bildteknik varit mycket användbar för att upptäcka cellulära ursprung och differentieringsvägar för kranskärl9,10,11,12. Trots fördelarna med dessa in vivo-verktyg finns det begränsningar när det gäller snabbhet, flexibilitet och tillgänglighet. Därför kan robusta in vitro-modellsystem komplettera in vivo-system för att belysa de cellulära och molekylära mekanismerna för koronar angiogenes på ett höggenomströmningssätt.
Här beskriver vi en in vitro-modell av koronar angiogenes. Vi har utvecklat ett in vitro-odlingsodlingssystem för att odla födanskärl från två stamtorvävnader, SV och Endo. Med denna modell visar vi att in vitro-vävnaden explant kulturer växa koronar kärl groddar när stimuleras av tillväxtmedium. Dessutom växer explanta kulturer snabbt jämfört med kontroll när stimuleras av vaskulär endotel tillväxtfaktor A (VEGF-A), en mycket potent angiogenic protein. Dessutom fann vi att angiogengroddar från SV-kulturen genomgår venös dedifferentiering (förlust av COUP-TFII uttryck), en mekanism som liknar SV angiogenes in vivo1. Dessa uppgifter tyder på att in vitro explant kultursystemet troget återinför angiogenic händelser som invivo. Kollektivt, in vitro modeller av angiogenes som beskrivs här är idealiska för sondering cellulära och molekylära mekanismer för koronar angiogenes på ett hög genomströmning och tillgängligt sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användning av alla djur i detta protokoll följde Ball State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) riktlinjer.
1. Upprätta nde av musuppfödare och upptäcka vaginala pluggar för tidstidsförda graviditeter
- Ställ in en musavelsbur med vilda djur- och honmöss. Se till att uppfödningsmössens ålder är mellan 6-8 veckor. Ställ upp antingen ett par (1 hane och 1 hona) eller som en trio (1 hane och 2 hona) för avel.
- Kontrollera om det finns en vaginal plugg följande morgon. Använd en vinklad metall sond för att upptäcka en djup plugg genom att sätta in den i vaginalöppningen. Ange morgonen av en positiv vaginal plugg vara embryonal dag 0,5 (e0,5).
OBS: En vaginal plugg kan vara antingen ytlig (som är väl synlig, se figur 1) eller djup (som inte är lätt synlig). Närvaron av en djup plugg kommer att blockera full insättning av sonden medan frånvaron av en plugg kommer att möjliggöra full insättning utan motstånd. - Upprätthålla tidsförd graviditet tills embryona når E11.5 då de kommer att skördas. För att bekräfta graviditet före skörd av embryon, registrera vikten av kvinnliga möss mellan e7.5 och e11.5.
OBS: Daglig ökning av moderns vikt kommer att indikera en lyckad graviditet, medan ingen förändring i vikt kommer att indikera en misslyckad graviditet.
2. Skörd embryon från dräktiga möss
OBS: Innan du börjar, se till att ha följande utrustning och reagenser: en CO2 dödshjälp kammare, 70% etanol, pappershanddukar, vanliga pinps, fina pincett, sax, 1x sterilfosfat-buffrad koksaltlösning (PBS), 10 cm sterila Petri rätter, behållare med is, perforerad sked, dissekering stereomikroskop.
- Placera en e11,5 gravid mus i en ren CO2 dödshjälp kammare för att offra den. Stäng locket på kammaren för att förhindra att musen läcker ut.
- När musen är säkrad i dödshjälpskammaren, slå på CO2. Se till att reglera flödet av CO2 per IACUC-rekommendationer (dvs. 10-30% förskjutning per minut). När musen är helt avlivas, utföra massundersökning förskjutning för att säkerställa döden.
- Spraya musen med 70% etanol. Lyft huden över magen med hjälp av pincett, gör ett litet snitt med en sax och förlänga snittet i sidled. Förstora snittet anteriorly upp till membranet och exponera livmoderhorn som innehåller embryon (figur 2).
- Dra ut strängen av embryon (livmoderhorn + embryon) genom att gripa livmodern och skära den fri. Placera embryosträngen i iskalla sterila 1x PBS.
- Dissekera ut de enskilda embryona från livmoderhornet genom att skala av livmoderns muskel, äggulasäck och amnion en efter en(figur 3A-F) under ett stereomikroskop. Överför de rengjorda embryona med en perforerad sked till en Petriskål som innehåller steril 1x PBS på is. Se till att hålla embryona kalla.
3. Isolera hjärtan från e11.5 Embryon
OBS: Innan du börjar, se till att ha följande utrustning och reagenser: vanliga pincett, fina pincett, 1x steril PBS, 10 cm steril Petri skål, 6 cm steril Petri skålen, behållare med is, perforerad sked, dissekering stereomikroskop.
- Sätt upp en ny Petri-skål med iskall steril 1x PBS under ett stereomikroskop. Överför ett embryo från steg 2.5 till Petriskålen för att dissekera ut hjärtat.
- Ta bort embryots huvud med hjälp av pincett. Tryck först huvudet mellan pincetten med ena handen och ta sedan bort huvudet genom att skrapa bort det med den andra handen med hjälp av slutna pincett (figur 4A-C).
- Efter att ha tagit bort huvudet, orientera embryot med sin ventrala sida upp genom att hålla embryot med pincett vid magen med ena handen (Figur 4D).
- Med den andra handen, öppna bröstet väggen av embryot genom att först göra ett litet snitt i bröstet något ovanför membranet med fina pincett. Förstora sedan snittet mycket noggrant genom att sätta in slutna pincett och riva bröstväggen genom att öppna pincetten. Se till att inte dragkraft för djupt, vilket kan skada hjärtat. Med hjälp av pincett, håll bröstväggen vidöppen för att exponera hjärta och lungor i brösthålan (Figur 4E).
- Använd fina pincett, flytta försiktigt hjärtat främre (90°) och exponera ryggatorn/venen. Dra ut hjärtat/lungorna främre genom att fånga ryggatorn/venen vid hjärtats botten (figur 4F-H).
OBS: Var försiktig när du drar ut hjärtat /lungorna för att undvika att slita av SV, som ligger på den ryggasidan av hjärtat. - Skölj hjärtat/lungorna med kall 1x PBS för att ta bort blodkroppar.
- Upprepa steg 3.1-3.6 för att avlägsna hjärtat/lungorna från de återstående embryona. Se till att hålla det isolerade hjärtat/lungorna på is.
4. Isolera svs och ventriklar från e11.5 Embryonala Mus hjärtan
- Placera Petri skålen med hjärta / lungor från steg 3,7 under ett stereomikroskop för att isolera SVs och hela ventriklar. Skala av de bifogade lober av lungorna en efter en från roten med fina pincett.
- Rikta hjärtat på sin dorsala sida och ta bort atria och den intilliggande vävnaden som omger SV-satsen samtidigt utan att riva SV. Ta bort vänster och höger atria från hjärtat genom att hålla vid basen och skrapa bort den med fina pincett(figur 5B). Ta bort den intilliggande vävnaden som omger SV med en liknande teknik(bild 5C).
OBS: Tänk på att rätt atrium är fäst vid SV, så var noga med att bara ta bort atriumet. - För att isolera SV, först orientera hjärtat med sin dorsala sida uppåt (eftersom SV är på dorsala sidan) och hålla hjärtat stilla i detta läge genom att försiktigt hålla hjärtat vid dess ventriklar med pincett.
OBS: SV är ett inflödeorgan av ett embryonalt hjärta som ligger mellan atria på den dorsala sidan av hjärtat. - Ta bort SV genom att försiktigt skala bort det hjärta där det är fäst eller genom att hålla SV vid basen av dess fastsättning med fina pincett och skrapa bort den med slutna pincett(figur 5D,E).
- Överför den isolerade SV:en till en ny 6 cm Petri-skål med iskalla sterila 1x PBS på is med en steril överföringspipett och märk Petriskålen som SV.
- För att isolera hela ventriklarna, ta bort utflödeskanalen (aorta och lungstammen) från hjärtat efter det att SV har avlägsnats (figur 5F,G).
- Överför hela ventriklarna till en ny 6 cm Petri skål som innehåller sterila 1x PBS på is med hjälp av en steril överföringspipett och märk Petriskålen som ventriklar. Håll den isolerade SV och ventriklarna på isen.
- Upprepa steg 4.1-4.7 för att isolera svs och ventriklar från de återstående hjärtana.
5. Ställa in vävnadsodlingsplattor med skär och extracellulär matrisbeläggning
OBS: Innan du börjar, se till att ha följande utrustning och reagenser: kommersiell extracellulär matrislösning (ECM, t.ex.
- Låt ECM-lösningen tina på is. Håll ECM-lösningen på is för att undvika stelning.
- Placera PET membranodlingskär (porstorlek = 8,0 μm, filtreringsområde = 0,3 cm2, filterdiameter = 6,5 mm) i brunnarna hos icke-vävnadsodlingsom behandlas 24 brunnsplattor. Märk plattorna som SV- eller ventriklar för SV-erna respektive de endokariella angiogenesa analyser.
OBS: Ställ in skären i separata plattor för SV och ventriklarna när båda kulturerna utför samtidigt. Se till att ställa in tillräckligt med brunnar för alla experimentella prover och kontroller. - När ECM-lösningen har tinats, omedelbart späd ECM 1:2 i förkylt basmedium (dvs. EBM-2-basmedium, se materialtabell) till en tillräcklig volym (100 μL/insert x antal skär).
OBS: Om det till exempel finns sex skär kommer den totala volymen att vara 100 μL x 6 = 600 μL. Tillsätt 200 μL ECM i 400 μL basmedium. - Täck skären med 100 μL nyutspädd ECM genom att lägga till den direkt ovanpå membranet. Inkubera plattan vid 37 °C i minst 30 min så att ECM kan stelna.
OBS: Detta måste utföras under en laminär flöde vävnad sliten vävnad shuv för att undvika kontaminering.
6. SVs och hela ventriklarkulturer
OBS: Innan du börjar, se till att ha följande utrustning och reagenser: 70% etanol, överföra pipett, stereomikroskop, pincett, laminärflöde vävnad säteri kultur huva, mikrovaskulär endotelcell tillägg kit(Tabell över material), basalmedium, 1x steril PBS). Figur 6 visar arbetsflödet för SV- och ventrikelkultur.
- Tina upp innehållet i tillägget kit på is. Förbered hela mediet genom att lägga till allt innehåll i tillägget kit i 500 ml basalmedium under en certifierad laminärflöde vävnad säteri kultur huva. Blanda mediet väl och fördela till 50 ml aliquots.
- Sterilisera basen av stereomikroskopet och det omgivande arbetsområdet med 70% etanol.
- Få vävnadsodlingsplattorna från steg 5.4. Med hjälp av en överföringspipett överför du noggrant explantorna från steg 4.7 ovanpå skärmembranet. Under ett stereomikroskop och med hjälp av rena pincett, placera explantorna i mitten av skären för att säkerställa att de inte fastnar i hörnet av skären eller fäst vid sidoväggarna.
- När explantorna är placerade och centrerade på skären, ta försiktigt bort eventuella extra PBS från skären och stäng locken på plattorna.
- Under en laminär flödesvävnadsodlingshuva, tillsätt 100 μL av det förvärmda hela mediet ovanpå skären och 200 μL i brunnarna för att odla explantorna vid luftvätskegränssnittet så att insatsens basala yta kommer i kontakt med mediet , men den övre ytan utsätts för luften.
OBS: Se till att justera volymen för att få ett luftflytande gränssnitt om du använder olika storlek skär / brunn plattor. - Tillsätt 300 μL PBS i de oanvända brunnarna på de 24 brunnsplattorna och täck med locket. Inkubera plattan i en 37 °C, 5% CO 2-inkubator, och odla kulturerna i 5 dagar.
- Under de följande dagarna, rutinmässigt observera kulturer under ett inverterat ljusmikroskop för att bedöma status för explant kulturer. Se till att explants uppvisar contractile misshandel och att alla explants är knutna till botten av membranet inbäddade med ECM. Ta del av eventuella flytande explants.
OBS: Den periodiska sammandragningen av explants indikerar att de lever. Flytande explantor bör utelämnas från analysen. - Efter att ha bedömt kulturstatus, sätta kulturen plattan tillbaka i inkubatorn och fortsätta att växa kulturen i upp till 5 dagar.
7. Behandling av kulturer med VEGF-A (positiv kontroll)
OBS: Innan du börjar, se till att ha följande utrustning och reagenser: laminärflöde vävnad sönt huva, 1x PBS, basal medium + 1% fetala nötkreatur serum (FBS), basalmedium + VEGF-A, pipetter och pipettspetsar.
- Förbered basalmedium + 1% FBS och basalmedium + VEGF-A.
- För att förbereda basalmedium + 1% FBS, först bestämma antalet kontrollbrunnar som behövs. Till exempel, om det finns tre kontrollbrunnar, då 300 μL/well x 3 = 900 μL är den totala volymen som behövs. Tillsätt 9 μL FBS i 891 μL basalmedium för att göra basalmedium + 1% FBS.
- För att förbereda basalmedium + VEGF-A, först bestämma det totala antalet brunnar som behöver VEGF-A medium. Om det finns tre brunnar är 300 μL/well x 3 = 900 μL den totala volymen och 50 ng/well x 3 = 150 ng VEGF-A. Tillsätt 150 ng VEGF-A i 900 μL basmedium för att göra basalmedium + VEGF-A.
Montera den här lösningen på en större volym än beräknat för att försäkra ett tillräckligt antal mindre alikvoter för varje experiment.
- På dag 2, ta bort media från båda kamrarna (skären och brunnarna). Tvätta kulturer med 300 μL 1x PBS genom att lägga till 100 μL i skären och 200 μL i brunnarna. Snurra plattorna ordentligt några gånger och ta bort PBS.
- Tillsätt 300 μL basmedium + 1% FBS (100 μL i insatsen och 200 μL i brunnarna) för att svälta kulturerna i 24 timmar.
- På dag 3, efter svält, tillsätt 300 μL basmedium + 1% FBS (100 μL i insatsen och 200 μL i brunnarna) i kontrollbrunnarna och basalmediet + VEGF-A (50 ng/well) i behandlingsbrunnarna.
- Efter behandling, fortsätta att växa kulturerna i inkubatorn.
8. Fixering och immunfärgning
OBS: Innan du börjar, se till att ha följande utrustning och reagenser: 4% paraformaldehyd (PFA), 1x PBS, primära och sekundära antikroppar, en shaker, 0,5% nonionic ytaktiva ämne i PBS (PBT).
- På den sjätte dagen av odling, ta bort mediet och tvätta kulturer med 1x PBS i rumstemperatur (RT).
- Fixera kulturerna genom att lägga till 200 μL med 4 % PFA-lösning i brunnarna och 100 μL i skären. Fixa kulturer i 4 °C i 20 min medan du gungar.
- Efter 20 min fixering, ta bort PFA från kulturerna i en rökhuva och tvätta kulturerna med 1x PBS genom att lägga till 200 μL i brunnarna och 100 μL i skären.
- Upprepa tvättar 3x, 10 min vardera, medan gunga. Fortsätt sedan att utföra immunfärgning.
OBS: Alla tvättsteg utförs på en bänkskiva på RT.
- Späda primära antikroppar (anti-VE-Cadherin, anti-ERG 1/2/3) i blockeringslösning (5% åsnaserum, 0,5% PBT). Tillsätt 300 μL primär antikroppslösning (200 μL i bottenbrunnarna och 100 μL i skären). Inkubera kulturer i primära antikroppar över natten vid 4 °C medan gunga.
OBS: Anti-VE-Cadherin används för att märka endotelcellmembranet och anti-ERG 1/2/3 används för att märka endotelcellskärnan för att visualisera de angiogena groddar av endotelceller. - Nästa dag, tvätta och klippa kulturplattorna 10x i 0,5% PBT, ändra PBT var 10 min.
- Späd de sekundära antikropparna (åsnan anti-råtta Alexa Fluor 488 och åsna anti-kanin Alexa Fluor 555) i blockeringslösning. Tillsätt 300 μL av den sekundära antikroppen som i steg 8.2 och inkubera kulturerna över natten vid 4 °C medan du gungar. Nästa dag, tvätta de sekundära antikropparna 10x i PBT, ändra PBT var 10 min.
OBS: Tvätta minst 10x men fler tvättar är bättre. När tvättar är klara kan kulturerna lagras med 1x PBS tills de är monterade på diabilder.
9. Monteringkulturer på diabilder, bildbehandling och analys
OBS: Innan du börjar, se till att ha följande utrustning och reagenser: fina pincett, diabilder, monteringsmedium med 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), täcke och confocal mikroskop. Efter sekundär antikroppsfärgning monterar du kulturerna på bilder för avbildning med hjälp av följande steg.
- Skala av membranet försiktigt från insatsen med fina pincett och överför det till diabilderna genom att sätta membranet sidan ner och placera explant kulturer uppåt. Placera replikatexemplen i samma bilder och märk bilderna som kontroll eller VEGF-A. Tillsätt några droppar monteringsmedium med DAPI direkt på membranet och täck glidbanorna med täcksneddrag.
OBS: Se till att undvika luftbubblor medan du placerar täcken. - Täta av kanterna på rutschkanorna med klart nagellack och låt torka.
OBS: Diabilder kan förvaras i -20 °C för långtidsförvaring. - Bildbilder med hjälp av ett confokalmikroskop.
- Utför analys för att mäta längden på angiogenic utväxt. Kvantifiera angiogenic utväxtlängd genom att mäta avståndet mellan endotelcellerna (Ve-Cadherin+/ERG 1/2/3+) som utsträckts från erg 1/2/3+-cellernas insida i ventrikelkulturerna och från sv-explantsens centrum i SV-kulturerna.
- För att utföra kvantifiering med FIJI / ImageJ, först ladda ner FIJI programvara.
- Öppna bildfiler i FIJI: gå till Arkiv | Öppet | Mapp | Filnamn | Öppna.
- Gå till Analysera | Ange mått | Välj Omkrets.
- Markera verktyget Rak linje från huvudfönstret.
- Rita en linje över längden på en groddar som föreslås i steg 9.4.
- Gå till Analysera | Mät.
Längdmätningar visas i det nya fönstret. - Utför kvantifiering i bilder som representerar minst tre slumpmässigt valda vyfält. Genomsnitt grolängdsmätningarna och rapportera dem som medelvärde ± standardavvikelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En av de mest slående funktionerna i SV angiogenes in vivo är att det följer en specifik väg och innebär celldedifferentiering och redifferentiering händelser som inträffar vid stereotypa tider och positioner1. När de första SV-cellerna växer på hjärtventrikeln slutar de producera venösa markörer som COUP-TFII (figur 7). Därefter, koronar groddar ta två migration vägar, antingen över ytan av hjärtat eller djupt inne i hjärtmuskeln. Ytkärl blir så småningom vener medan invaderande kärl blir artärer och kapillärer1,6,7. Denna distinktion bevaras när hjärtat växer och koronarvaskulaturen expanderar.
För att underlätta upptäckten av den molekylära underbyggnad av koronar utveckling, har vi utarbetat en in vitro-modell av SV groning som kan användas för förlust av funktion och gain-of-function experiment. SV-vävnad från embryonala mushjärtan dissekeras, placeras på toppen av utspädd ECM (som är kommersiellt tillgänglig, se Materialtabell)och underhålls vid luftvätskegränssnittet i endotelcellstillväxtmediet. SV-hjärtmuskeln fortsätter att slå under hela kulturperioden. Efter 2 dagar i kultur, epicardial celler som kantar vävnaden lämna explant och migrera ut på matrisen. Efter 5 dagar grosalcellerna spirar sv-cellerna ut och migrerar till den episka vävnaden (figur 8A, svarta pilspetsar). Kollektivt, denna process rekapitulerar angiogenic aspekter av koronar utveckling.
Odlade SV-groddar genomgår också venös dedifferentiation. Liksom i det embryonala hjärtat reduceras KUPP-TFII-uttrycket när fartygen migrerar från SV (figur 8B, jämfört med figur 7). Kontroll kärl såsom umbilical eller äggula säckartärer och vener kan producera groning fartyg. De är dock färre i antal och kortare i längd och ändrar inte sin arterielleller venous identitet (visas inte). Venös omprogrammering är således specifik för SV-groning och inte ett allmänt inslag i angiogenes eller ett svar på ECM-komponenter. Dessa data visar också att celltyperna i själva satsen är nödvändiga och tillräckliga för att framkalla differentiering.
Det är väl känt att vaskulär endoteltillväxtfaktor A (VEGF-A) är en potent inducerare av angiogenes7,13,14,15,16,17,18. Tidigare studier har visat att hjärtinfarkt VEGF-A stimulerar endokariella angiogenes att odla födans fartyg7. Dessutom har koronar endotelceller visat sig uttrycka VEGF-A-receptorn, och SV-härledda födans kärl i hjärtmuskeln kan växa som svar på VEGF-A in vivo2. För att visa att vår in vitro-modell av koronar angiogenes reagerar troget på VEGF-A, stimulerade vi SV och Endo kulturer med VEGF-A. Som väntat visade våra resultat att både SV och Endo är mycket lyhörda för VEGF-A. Kulturer stimuleras med VEGF-A visar ökad tillväxt av angiogena groddar både i densitet och längd(figur 9A,C). SV kulturer stimuleras av VEGF-A visar en nästan 3-faldig ökning av grolängd jämfört med kontrollen (figur 9B). Dessa resultat tyder på att endotelgroddar från SV och Endo svarar på liknande signaler som är kända in vivo.
Sammantaget, våra data tyder på att dessa in vitro explant kulturer delar liknande cellulära och molekylära händelser som inträffar under in vivo koronar utveckling, inklusive venös dedifferentiering och robust tillväxt som svar på VEGF-A stimulering. Därför tyder våra data på att dessa explant kulturmodeller är användbara för att studera koronar angiogenes in vitro.
Figur 1: Identifiering av vaginalplugg. (A)En vaginal plugg (vit fläck). (B)Förstorad vy över boxat område inklusive vaginalpluggen (indikerad med pil). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Tillgång till embryosträngen i livmodern på en gravid mus. En avlivad gravid mus är placerad med sin ventrala yta upp och sprutas med 70% etanol till våt hud för dissekering. Huden dras upp vid bäckenregionen med hjälp av pincett och ett litet snitt görs. Snittet förlängs i sidled. Ett extra snitt görs anteriorly upp till membranet. I livmodern syns en sträng av embryon (indikeras av pilspetsar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Dissekering och avlägsnande av embryon från livmodern. (A)Bild som visar livmodern som innehåller en sträng av embryon. Membranet på embryots dorsala sida (mittemot den sida där moderkakan är belägen) skalas av. (B) Embryot i äggulasäcken blir synligt efter att ha skalat av livmodermembranet. (C, D) Embryo tärs på moderkakan med navelsträngen är synligt efter att ha skalat av äggulan säcken. Amnion skalas av om det fortfarande finns. (E)Bild som visar ett embryo som är fäst vid moderkakan vid navelsträngen. (F)Bild som visar lossnan av embryot från moderkakan genom att dra i navelsträngen (Umb. Sladd) med pincett. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Avlägsnande av hjärt-/lungpluck från embryon. (A,B) Huvudet avlägsnas från embryot genom att fånga i nacken och skrapa bort det. (C)Bild som visar avlägsnandet av huvudet från kroppen. D) Korrekt placering av embryot för hjärtdissekering. Embryot är placerat med den ventrala sidan upp för att ha enkel tillgång till brösthålan för avlägsnande av hjärtat. När embryot är placerat enligt D öppnas brösthålan med pincett. (E)Bild som visar den öppna brösthålan med hjärtat exponerat på dess ventrala sida. (F) För att ta bort hjärtat utan att skada SV, hjärtat vänds främre, och dorsala aorta blir synlig. (G)Bild som visar positionen vid basen av hjärtat/lungorna där ryggatornsatan/venen fångas med pincett och hjärt/lungpluck dras ut anteriorly. (H) Bilden visar e11.5 hjärta /lungor plocka bort från embryot. V. hjärta = ventralt hjärta; d. hjärta = dorsala hjärta; d. aorta = dorsala aorta; LA = vänster atrium; RA = höger atrium; LV = vänster kammare; RV = höger kammare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: Isolera sv och ventriklar från embryonala hjärtan. (A)Bild som visar ryggbilden av det isolerade hjärtat/lungorna plockar från e11.5-embryot. Placering en sats i hjärtat anges. (B)Bild av hjärtat efter att lungknopparna har avlägsnats. (C)Atria och intilliggande vävnader som omger SV tas bort, vilket avslöjar stora havet. Platsen för SA är märkt. (D) Bild som visar borttagning av SV. Med hjälp av pincett grips SV vid basen och skrapas bort från hjärtat. (E)SV bort från hjärtat visas tillsammans med den återstående vävnaden i hjärtat. Aorta och lungstammen (PT), som kollektivt kallas utflödeskanalen (OFT), blir synliga i hjärtat efter sv tas bort. S:t kommer att användas för in vitro-kultur, enligt beskrivningen i figur 6 (vänster panel). (F)Positionen för DEN AVT som ska dissekeras markeras med en streckad vit linje. (G)Aorta/PT (utflödesområde) avlägsnas från ventriklarna genom dissekering på det läge som visas i panel F. De återstående ventriklarna utan OFT används för ventrikelkulturer enligt figur 6 (höger panel). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 6: Schematisk visning av arbetsflödet för SV- och ventrikelkultur. Vänster: Förfarande för SV-kultur. Först tas SV bort från e11.5 hjärtan och placeras på ett kulturskär. Skäret innehåller porösmembran längst ner (8 μm por) och är belagd med tillväxtfaktor reducerad ECM. Skär placeras i brunnarna på en 24 brunnsplatta. Medium tillsätts både i botten och övre kammaren utan att täcka explanten. Kulturen odlas i 5 dagar. Efter 5 dagar avlägsnas membranet från insatsen och monteras på bilderna för avbildning och analys. Höger: Förfarande för ventrikelkultur. Ventriklarutan SV, atria och OFT avlägsnas från e11.5 hjärtan och odlas enligt beskrivningen ovan för SV. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 7: COUP-TFII-uttrycket går förlorat i SV-groddar in vivo. A) Dorsala syn på e11.5 hjärtan. Konfokal bild av endotelmarkör (röd) som etikettersinus venosus (SV), kranskärlsgroddar (cs, prickade linjen) och endokari (endo) foder hjärtat lumen. (B)Den venösa tillverkaren COUP-TFII (grön), en ventranskriptionsfaktor (trx), uttryckt i Sv,s. försvinner gradvis när groddar lämnar SV:n och växer på ventrikeln. Höger: Högre förstoring av kransen gro d'sprout visas i den förpackade regionen panel A. Skala bar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: In vitro-modeller av venös identitet och omprogrammering. (A)Brightfield bild av odlade SV vävnad. Vaskulär groddar (pilspetsar) växer ut från den ursprungliga explant (svart prickad linje) över ECM substratet. (B)Immunofluorescens av SV-kulturer märkta med antikroppar som markerar endotelcellytan (VE-Cadherin), endotelcellkärnor (ERG 1/2/3) och ven- och epicardialkärnor (COUP-TFII). Kärnorna är positiva för både ERG 1/2/3 och COUP-TFII vid SV, men ERG 1/2/3 endast i groddar som migrerar över ECM. Skala bar = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 9: SV och endokarium svarar på VEGF-A in vitro. (A)Konfokal bild av den 5 dagar gamla kontrollen och VEGF-A-behandlad SV-explantkultur. Endotelceller är immunfärgade med VE-cadherin (grön), endotelcellskärnor färgade med ERG 1/2/3 (röda) antikroppar och cellkärnor med DAPI (blå). (B)Angiogenic utväxt av endotelceller kvantifieras genom att mäta längden på groförlängning (avståndet migreras av ERG 1/2/3+ endotelceller från explantan, indikeras av vita fasta linjer i de nedre panelerna(A). (C)Konfokal bild av en 5-dagars gammal kultur av en kontroll och VEGF-A behandlade ventriklar. Endotelceller är immunfärgade med VE-cadherin (grön) och endotelcellskärnor färgas med ERG 1/2/3 (blå) antikroppar. Punkter är individuella mätningar och felstänger är medelmåttiga ± SD. Skala stång = 200 μm (A,C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Några av de mest kritiska stegen för att framgångsrikt odla kranskärl från SV- och Endo-stamtonet är: 1) Korrekt identifiera och isolera SV-vävnaden för SV-kultur; 2) Användning av ventriklar från embryon i åldern e11−11.5 för exakt Endo-kultur; 3) upprätthålla sterila förhållanden under hela dissekeringsperioden och hålla vävnaderna kalla hela tiden; och 4) hålla explantorna fästa vid ECM-belagda membranet för att undvika att vävnaden flyter i mediet.
För det första kan isolering av SV-vävnad vara utmanande. Det är viktigt att inse att SV ligger på den dorsala sidan av hjärtat mellan vänster och höger atria gömd i lunglobules. Därför är det svårt att separera och isolera. Istället måste hela hjärt -/lungorna plocka extraheras först. SV:n isoleras sedan från pluckgenom att försiktigt ta bort lunglobulerna och städa upp de intilliggande vävnaderna med hjälp av fina pincett. Dessutom måste man vara mycket försiktig när man städar upp de intilliggande vävnaderna för att inte förlora SV.
För det andra, för exakt endokardial angiogenes, är det viktigt att odla ventriklar från embryon inte äldre än e11.5. I e12.5 och äldre embryon växer koronarier från SV till en betydande andel av ventriklarna. Därför kan koronarkärlen som växer från äldre ventriklar bestå av både SV- och Endo-härledda födanskärl 1,2,10,19,20. Av denna anledning, för att exakt analysera kranskärlentillväxt från Endo, är det viktigt att kulturen ventriklar (minus SV och utflöde tarmkanalen) från e11,5 embryon20. Dessutom är SV:s större och är lättare att isolera på e11.5.
För det tredje, eftersom protokollet innebär en betydande mängd arbete utanför vävnadskulturhuven, är det viktigt att upprätthålla en steril arbetsmiljö. Det är viktigt att sterilisera dissekeringsverktygen (pincett, sax, etc.) och vävnadsodlingsplattorna och undvika kontakt med osterila områden hela tiden. Det är viktigt att spraya arbetsområdet och dissekeringsomfattning med 70% etanol. För att undvika kontaminering är det viktigt att utföra dissekeringsproceduren snabbt och minimera arbetet utanför vävnadskulturhuven.
För det fjärde, för att få friska explant kulturer, är det viktigt att explants kvar knutna till basen av membranet hela tiden. Flytande explants i mediet måste undvikas för att framgångsrikt odla explantkulturer. För att undvika flytande är det viktigt att upprätthålla ett luftflytande gränssnitt där insatsens basala yta är i kontakt med mediet, men den övre ytan utsätts för luften. Ett sådant gränssnitt erhålls när explanten är tillräckligt täckt av mediet men inte är helt nedsänkt. Det är viktigt att övervaka volymen på mediet dagligen, eftersom volymen kan gå förlorad till avdunstning. För att förhindra detta kan odlingsplattan fuktas genom att lägga till PBS i de oanvända brunnarna på kulturplattorna.
Liknande explant kulturer av SV och Endo beskrivs på andra håll20. I dessa metoder odlades explantsdirekt in i brunnarna av vävnadkulturplattor, vilket begränsar högupplöst confocal imaging. De bilder som tas i denna inställning är relativt dålig kvalitet jämfört med den metod som föreslås här, begränsa detaljerade mikroskopiska analyser. För att kringgå detta utnyttjade vi kulturinsatser från vilka membranen som innehåller kulturen kan skalas av och monteras på glasrutschbanorna för avbildning. Detta möjliggör högupplöst confocal imaging där cellulära detaljer såsom uttryckmönster och morfologi kan ses. Dessutom, odling direkt på plattor kräver en separat färgning protokoll för DAPI eller andra pan-nukleära markör färgning. Det här protokollet kräver inga separata färgningssteg eftersom bilderna kan monteras med monteringsmedium som innehåller DAPI. Dessutom möjliggör montering på diabilder långtidslagring utan fluorescerande blekning, medan kulturer som lagras i brunnar med flytande medium kommer att resultera i snabb blekning och inte är mottagliga för långsiktig lagring och avbildning.
De in vitro-kulturmodeller som beskrivs här är idealiska för att förhöra cellulära och molekylära mekanismer för koronar angiogenes på ett höggenomströmning och tillgängligt sätt. Detta in vitro-system kan användas för att screena för potentiella läkemedel eller molekylära mål för att bedöma deras effekt på koronar angiogenes. Dessutom kan detta system också användas för att studera gain-of-function och förlust-of-function av olika gener för deras autonoma funktion i koronar angiogenes. Vi observerade att koronar groddar från SV följde den episka migrationen i våra in vitro-kulturer, vilket tyder på en viktig interaktion mellan koronarendotelceller och epicardialceller. Det är väl känt att epikardium är en rik källa till tillväxtfaktorer för koronar angiogenes från SV. Till exempel har epicardial-härledda tillväxtfaktorer som VEGF-C och ELABELA tidigare visat sig reglera SV-härledda koronar angiogenes2,19. Vi kan använda detta SV-odlingssystem för att ytterligare undersöka samspelet mellan epikardium och koronarendotelceller och identifiera nya epicardial-härledda molekylära vägar av koronar angiogenes. Dessutom, våra in vivo data tyder på att myocardial hypoxi kan vara inblandade i endokardial angiogenesis19. Vårt in vitro-odlingssystem erbjuder en utmärkt modell för att studera hypoxias roll i endokarurangiogenes genom att inkubera kulturer i hypoxiska eller normoxiska förhållanden. Dessa är svåra experiment att genomföra in vivo eftersom det kräver en gravid mus som ska placeras i en kontrollerad hypoxisk kammare. Från vår egen erfarenhet är det mycket utmanande att få konsekventa och tillförlitliga resultat från in vivo-experiment. Sammanfattningsvis ger vår in vitro-modell av koronar angiogenes ett tillförlitligt system för att förhöra ett brett spektrum av frågor som rör cellulär och molekylärbiologi av koronar angiogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna tackar medlemmarna i Sharma laboratorium för att ge en stödjande forskningsmiljö. Vi vill framföra särskilt tack till Diane (Dee) R. Hoffman som underhåller och bryr sig om vår muskoloni. Vi vill också tacka Drs. Philip J. Smaldino och Carolyn Vann för grundligt korrekturläsning manuskriptet och ge användbara kommentarer. Detta arbete stöddes av medel från Ball State University Provost Office och Institutionen för biologi till BS, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant medel till BS, och NIH (RO1-HL128503) och The New York Stem Cell Foundation medel till KR
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
References
- Red-Horse, K., et al. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).
- Volz, K. S., et al. Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle. Elife. 4, (2015).
- Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).
- Chang, A. H., et al. DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis. Genes and Development. , (2017).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).
- Das, S., Red-Horse, K. Cellular plasticity in cardiovascular development and disease. Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).
- Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways. Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).
- Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).
- Ruhrberg, C., et al. Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis. Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).
- Kikuchi, R., et al. An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease. Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).
- Folkman, J., et al. Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).
- Ferrara, N. The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis. Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).
- Ferrara, N., Bunting, S. Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).
- Sharma, B., et al. Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts. Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).
- Rhee, S., et al. Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease. Nature Communications. 9 (1), 368 (2018).
