Summary
I modelli in vitro di angiogenesi coronarica possono essere utilizzati per la scoperta dei meccanismi cellulari e molecolari dell'angiogenesi coronarica. Le colture in vitro espiante di venosus e tessuti endocardio mostrano una solida crescita in risposta al VEGF-A e mostrano un modello simile di espressione COUP-TFII come in vivo.
Abstract
Qui, descriviamo un saggio in vitro per studiare l'angiogenesi coronarica. I vasi coronarici alimentano il muscolo cardiaco e sono di importanza clinica. I difetti in questi vasi rappresentano gravi rischi per la salute come l'aterosclerosi, che può portare a infarti miocardici e insufficienze cardiache nei pazienti. Di conseguenza, la malattia coronarica è una delle principali cause di morte in tutto il mondo. Nonostante la sua importanza clinica, relativamente pochi progressi sono stati fatti su come rigenerare le arterie coronarie danneggiate. Tuttavia, sono stati fatti recenti progressi nella comprensione dell'origine cellulare e dei percorsi di differenziazione dello sviluppo dei vasi coronarici. L'avvento di strumenti e tecnologie che consentono ai ricercatori di etichettare fluorescentmente le cellule progenitrici, seguire il loro destino e visualizzare le progenie in vivo sono state fondamentali per comprendere lo sviluppo di vasi coronarici. Gli studi in vivo sono preziosi, ma hanno limitazioni in termini di velocità, accessibilità e flessibilità nella progettazione sperimentale. In alternativa, accurati modelli in vitro di angiogenesi coronarica possono aggirare questi limiti e consentire ai ricercatori di interrogare importanti questioni biologiche con velocità e flessibilità. La mancanza di adeguati sistemi di modelli in vitro può aver ostacolato i progressi nella comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari della crescita dei vasi coronarici. Qui, descriviamo un sistema di coltura in vitro per far crescere vasi coronarici dal veleno del seno (SV) e dall'endocardio (Endo), i due tessuti progenitori da cui nascono molti dei vasi coronarici. Abbiamo anche confermato che le culture riassumono accuratamente alcuni dei meccanismi in vivo noti. Per esempio, mostriamo che i germogli angiogenici in coltura da SV downregulate espressione COUP-TFII simile a quello che si osserva in vivo. Inoltre, mostriamo che il VEGF-A, noto fattore angiogenico in vivo, stimola in modo robusto l'angiogenesi sia delle culture SV che Endo. Collettivamente, abbiamo ideato un modello accurato di coltura in vitro per studiare l'angiogenesi coronarica.
Introduction
I vasi sanguigni del cuore sono comunemente chiamati vasi coronarici. Questi vasi sono costituiti da arterie, vene e capillari. Durante lo sviluppo, i capillari altamente ramificati vengono stabiliti prima, che poi rimodellano in arterie coronarie e vene1,2,3,4,5. Questi capillari iniziali sono costruiti da cellule progenitrici endoteliali presenti nel proepicardio, nel veleno del seno (SV) e nei tessuti dell'endocardio (Endo)1,6,7,8. SV è l'organo di afflusso del cuore embrionale ed Endo è il rivestimento interno del lume del cuore. Le cellule del progenitore endoteliale presenti nella SV e nell'Endo costruiscono la maggior parte della vascolatura coronarica, mentre il proepidico contribuisce ad una porzione relativamente piccola di esso2. Il processo mediante il quale la rete capillare di vasi coronarici cresce nel cuore dalle sue cellule precursori preesistenti è chiamata angiogenesi coronarica. La malattia coronarica è una delle principali cause di morte in tutto il mondo e tuttavia manca un trattamento efficace per questa malattia. Comprendere i meccanismi cellulari e molecolari dettagliati dell'angiogenesi coronarica può essere utile nella progettazione di terapie nuove ed efficaci per riparare e rigenerare le arterie coronarie danneggiate.
Recentemente, un aumento nella nostra comprensione di come si sviluppano i vasi coronarici è stato in parte raggiunto attraverso lo sviluppo di nuovi strumenti e tecnologie. In particolare, l'etichettatura del lignaggio in vivo e le tecnologie di imaging avanzate sono state molto utili per scoprire l'origine cellulare e i percorsi di differenziazione dei vasi coronarici9,10,11,12. Nonostante i vantaggi di questi strumenti in vivo, ci sono limitazioni in termini di velocità, flessibilità e accessibilità. Pertanto, robusti sistemi di modelli in vitro possono integrare i sistemi in vivo per chiarire i meccanismi cellulari e molecolari dell'angiogenesi coronarica in modo ad alta produttività.
Qui, descriviamo un modello in vitro di angiogenesi coronarica. Abbiamo sviluppato un sistema di coltura in vitro per far crescere vasi coronarici da due tessuti progenitori, SV ed Endo. Con questo modello, mostriamo che le colture di espianto di tessuto in vitro crescono germogli di vasi coronarici quando stimolati dal mezzo di crescita. Inoltre, le colture di espiante crescono rapidamente rispetto al controllo quando stimolate dal fattore di crescita endoteliale vascolare A (VEGF-A), una proteina angiogenica altamente potente. Inoltre, abbiamo scoperto che i germogli angiogenici della cultura SV subiscono una dedifferenziazione venosa (perdita di espressione COUP-TFII), un meccanismo simile all'angiogenesi SV in vivo1. Questi dati suggeriscono che il sistema culturale dell'espianto in vitro ripristina fedelmente gli eventi angiogenici che si verificano in vivo. Collettivamente, i modelli in vitro di angiogenesi che sono descritti qui sono ideali per sondare meccanismi cellulari e molecolari di angiogenesi coronarica in modo ad alta produttività e accessibile.
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Protocol
L'uso di tutti gli animali in questo protocollo ha seguito le linee guida del Ball State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Stabilire allevatori di topi e rilevare spine vaginali per gravidanze a tempo
- Impostare una gabbia per l'allevamento di topi selvatici di tipo maschile e femminile. Assicurarsi che l'età dei topi da riproduzione sia compresa tra 6-8 settimane. Impostare una coppia (1 maschio e 1 femmina) o come trio (1 maschio e 2 femmina) per l'allevamento.
- Verificare la presenza di una spina vaginale la mattina seguente. Utilizzare una sonda metallica angolata per rilevare una spina profonda inserendola nell'apertura vaginale. Designare la mattina di un tappo vaginale positivo per essere giorno embrionale 0.5 (e0.5).
NOTA: Una spina vaginale può essere superficiale (che è facilmente visibile, vedere Figura 1) o profonda (che non è facilmente visibile). La presenza di una spina profonda bloccherà l'inserimento completo della sonda, mentre l'assenza di una spina consentirà l'inserimento completo senza resistenza. - Mantenere la gravidanza a tempo fino a quando gli embrioni raggiungono e11.5 in cui saranno raccolti. Per confermare la gravidanza prima della raccolta degli embrioni, registrare il peso dei topi femminili tra e7.5 e e11.5.
NOTA: L'aumento giornaliero del peso della madre indicherà una gravidanza di successo, mentre nessun cambiamento di peso indicherà una gravidanza fallita.
2. Raccolta di embrioni da topi in gravidanza
NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi di avere le seguenti attrezzature e reagenti: una camera di eutanasia CO2, 70% di etanolo, asciugamani di carta, pinze regolari, pinze fini, forbici, 1x sterile fosfato-bufferato salina (PBS), 10 cm sterile sterile piatti Petri, contenitore con ghiaccio, cucchiaio perforato, dissezione stereomicroscopio.
- Mettere un topo incinta e11.5 in una camera di eutanasia di CO2 pulita per sacrificarlo. Chiudere il coperchio della camera per evitare che il mouse esui.
- Dopo aver fissato il mouse nella camera di eutanasia, attivare CO2. Assicurarsi di regolare la portata di CO2 per le raccomandazioni IACUC (cioè 10-30% di spostamento al minuto). Dopo che il topo è completamente eutanasia, eseguire lussazione cervicale per garantire la morte.
- Spruzzare il mouse con 70% di etanolo. Sollevare la pelle sul ventre utilizzando pinze, fare una piccola incisione utilizzando un paio di forbici ed estendere l'incisione lateralmente. Ingrandire l'incisione anteriormente fino al diaframma ed esporre il corno uterino contenente gli embrioni (Figura 2).
- Estrarre la stringa di embrioni (corno uterino - embrioni) afferrando l'utero e tagliandolo libero. Mettere la stringa di embrioni in 1x PBS sterile a freddo ghiaccio.
- Dissezionare i singoli embrioni dal corno d'utero staccando il muscolo uterino, il sacco del tuorlo e l'amnione uno per uno(Figura 3A-F) sotto uno stereomicroscopio. Trasferire gli embrioni puliti con un cucchiaio perforato in un piatto Petri contenente sterile 1x PBS sul ghiaccio. Assicurarsi di mantenere gli embrioni freddi.
3. Isolare i cuori da e11.5 Embrioni
NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi di avere le seguenti attrezzature e reagenti: pinze regolari, pinze sottili, 1x sterile PBS, 10 cm sterile piatto Petri, 6 cm sterile Petri parabola, contenitore con ghiaccio, cucchiaio perforato, dissezione stereomicroscopio.
- Impostare un nuovo piatto Petri con sterile ghiacciato 1x PBS sotto uno stereomicroscopio. Trasferire un embrione dalla fase 2.5 nel piatto Petri per sezionare il cuore.
- Rimuovere la testa dell'embrione con le pinze. In primo luogo, spremere la testa tra le pinze con una mano e quindi rimuovere la testa raschiando via con l'altra mano utilizzando pinze chiuse (Figura 4A-C).
- Dopo aver rimosso la testa, orientare l'embrione con il lato ventrale tenendo l'embrione con le pinze alla pancia con una mano (Figura 4D).
- Con l'altra mano, aprire la parete toracica dell'embrione prima facendo una piccola incisione nel torace leggermente sopra il diaframma utilizzando pinze sottili. Quindi, ingrandire l'incisione con molta attenzione inserendo pinze chiuse e strappando la parete toracica aprendo le pinze. Assicurarsi di non spingere troppo in profondità, che può danneggiare il cuore. Con l'aiuto delle pinze, tenere la parete toracica spalancata per esporre il cuore e i polmoni nella cavità toracica (Figura 4E).
- Usando le pinze sottili, muovi delicatamente il cuore anteriormente (90o) ed esponi l'aorta/veina dorsale. Estrarre il cuore/ polmoni anteriormente catturando l'aorta/vena dorsale alla base del cuore (Figura 4F-H).
NOTA: Sii gentile mentre estrai il cuore /i polmoni per evitare lo strappo della SV, che si trova sul lato dorsale del cuore. - Sciacquare il cuore/polmone con 1x PBS freddo per rimuovere le cellule del sangue.
- Ripetere i passaggi da 3.1 a 3.6 per rimuovere il cuore/i polmoni dagli embrioni rimanenti. Assicurarsi di tenere il cuore/polmoni isolati sul ghiaccio.
4. Isolamento di SAv e Ventricoli da e11.5 Cuori murini embrionali
- Posizionare il piatto Petri con cuore/polmoni dal punto 3.7 sotto uno stereomicroscopio per isolare i SV e i ventricoli interi. Sbucciare i lobi attaccati dei polmoni uno ad uno dalla loro radice utilizzando pinze fini.
- Orientare il cuore sul lato dorsale e rimuovere gli atri e il tessuto adiacente che circonda la SV anteriormente senza strappare la SV. Rimuovere gli atri sinistro e destro dal cuore tenendo alla sua base e raschiandolo via con pinze sottili (Figura 5B). Rimuovere il tessuto adiacente che circonda l'SV con una tecnica simile (Figura 5C).
NOTA: Tenere presente che l'atrio giusto è collegato all'Atrio, quindi fate attenzione a rimuovere solo l'atrio. - Per isolare l'SV, prima orientare il cuore con il suo lato dorsale rivolto verso l'alto (perché la SV è sul lato dorsale) e mantenere il cuore ancora in questa posizione tenendo delicatamente il cuore ai suoi ventricoli con pinze.
NOTA: L'SV è un organo in flusso di un cuore embrionale che si trova tra gli atri sul lato dorsale del cuore. - Rimuovere la SV staccandolo con cura dal cuore dove è attaccato o tenendo la SV alla base del suo attacco con pinze sottili e raschiandola con pinze chiuse (Figura 5D,E).
- Trasferire la SV isolata in una nuova parabola Petri di 6 cm con sterile ghiacciato 1x PBS sul ghiaccio utilizzando una pipetta di trasferimento sterile ed etichettare il piatto Petri come SV.
- Per isolare tutti i ventricoli, rimuovere il tratto di deflusso (aorta e tronco polmonare) dal cuore dopo la rimozione della SV (Figura 5F,G).
- Trasferire l'intero ventricolo in un nuovo piatto Petri di 6 cm contenente sterile 1x PBS sul ghiaccio utilizzando una pipetta di trasferimento sterile ed etichettare il piatto Petri come ventricoli. Tenere l'Isolato SV e ventricoli sul ghiaccio.
- Ripetere i passaggi da 4.1 a 4.7 per isolare gli SV e i ventricoli dai cuori rimanenti.
5. Impostazione di piastre di coltura dei tessuti con inserti e rivestimento a matrice extracellulare
NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi di disporre delle seguenti attrezzature e reagenti: soluzione a matrice extracellulare commerciale (ECM; ad esempio, Matrigel), 8,0 inserti di coltura in polietilene terephthalate (PET), 24 piastre di pozzo, 37 gradi centigradi, 5% di incubatore di CO2.
- Lasciare scongelare la soluzione ECM sul ghiaccio. Mantenere la soluzione ECM sul ghiaccio per evitare la solidificazione.
- Collocare gli inserti della coltura della membrana PET (dimensione del poro - 8,0 m, area di filtrazione - 0,3 cm2, diametro del filtro , 6,5 mm) nei pozzi della coltura non tissutale trattati 24 piastre di pozzo. Etichettare le piastre come SV o ventricoli per la SV o i saggi di angiogenesi endocardiale, rispettivamente.
NOTA: Impostare gli inserti in piastre separate per l'SV e i ventricoli quando si eseguono entrambe le colture contemporaneamente. Assicurarsi di impostare abbastanza pozzi per tutti i campioni e controlli sperimentali. - Dopo lo scongelamento della soluzione ECM, diluire immediatamente ECM 1:2 in un supporto basale preraffreddato (ad esempio, supporto basale EBM-2, vedere Tabella dei materiali) a un volume sufficiente (100 L/inserire x numero di inserti).
NOTA: Ad esempio, se ci sono sei inserti, il volume totale sarà 100 x 6 x 600 L. Aggiungere 200 L di ECM in 400 - L di supporto basale. - Rivestire gli inserti con 100 gradi di ECM appena diluito aggiungendolo direttamente sopra la membrana. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per almeno 30 min per consentire all'ECM di solidificare.
NOTA: Questa operazione deve essere eseguita in una cappa di coltura del tessuto a flusso laminare per evitare la contaminazione.
6. SV e Culture Ventrili Intere
NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi di avere le seguenti attrezzature e reagenti: 70% etanolo, transfer pipette, stereomicroscopio, pinze, cappa di coltura del tessuto flusso laminare, kit di supplemento di cellule endoteliali microvascolari (Tabella dei materiali), mezzo basale, 1xe steril e PBS). La figura 6 mostra il flusso di lavoro della cultura SV e ventricola.
- Scongelare il contenuto del kit di supplemento sul ghiaccio. Preparare il mezzo completo aggiungendo tutti i contenuti del kit di supplemento in 500 mL di mezzo basale sotto un cofano di coltura del tessuto a flusso laminare certificato. Mescolare bene il mezzo e distribuirlo in aliquote da 50 mL.
- Sterilizzare la base dello stereomicroscopio e dell'area di lavoro circostante con il 70% di etanolo.
- Ottenere le piastre di coltura dei tessuti dal punto 5.4. Con l'aiuto di una pipetta di trasferimento, trasferire attentamente gli espianti dal passaggio 4.7 sulla parte superiore della membrana di inserimento. Sotto uno stereomicroscopio e con l'aiuto di pinze pulite, posizionare i semiplants al centro degli inserti per assicurarsi che non siano bloccati nell'angolo degli inserti o attaccati alle pareti laterali.
- Dopo aver posizionato e centrato gli inserti agli espiatori, rimuovere con attenzione eventuali PBS aggiuntivi dagli inserti e chiudere i coperchi delle piastre.
- Sotto un cofano di coltura del tessuto di flusso laminare, aggiungere 100 L del mezzo completo preriscaldato sopra gli inserti e 200 L nei pozzi per lacoltura degli espianti all'interfaccia aria-liquido in modo che la superficie basale dell'inserto sia a contatto con il mezzo , ma la superficie superiore è esposta all'aria.
NOTA: Assicurarsi di regolare il volume per ottenere un'interfaccia aria-liquido se si utilizzano inserti di dimensioni diverse/ piastre di pozzo. - Aggiungere 300 l di PBS nei pozze inutilizzati delle 24 lastre del pozzo e coprire con il coperchio. Incubare la piastra in un incubatore di CO2 a 37 gradi e coltivare le culture per 5 giorni.
- Nei giorni successivi, osservare regolarmente le colture al microscopio luminoso invertito per valutare lo stato delle colture espiante. Assicurarsi che gli espianti esibiscano il pestaggio contrattile e che tutti gli espianti siano attaccati alla parte inferiore della membrana incorporata con ECM. Prendere nota di eventuali espianti galleggianti.
NOTA: la contrazione periodica degli espianti indica che sono vivi. Gli espianti galleggianti devono essere omessi dall'analisi. - Dopo aver valutato lo stato culturale, rimettere la piastra di coltura nell'incubatrice e continuare a far crescere la coltura per un massimo di 5 giorni.
7. Trattamento delle colture con VEGF-A (controllo positivo)
NOTA: prima di iniziare, assicurarsi di disporre delle seguenti attrezzature e reagenti: cappa di coltura del tessuto del flusso laminare, 1x PBS, supporto basale , 1% siero bovino fetale (FBS), supporto basale - VEGF-A, pipette e punte pipette.
- Preparare il supporto basale dell'1% FBS e il supporto basale - VEGF-A.
- Per preparare il supporto basale - 1% FBS, determinare innanzitutto il numero di pozzi di controllo necessari. Ad esempio, se ci sono tre pozze di controllo, allora 300 L/well x 3 x 900 L è il volume totale necessario. Aggiungete 9 L di FBS a 891 l di mezzo basale per rendere il mezzo basale : 1% FBS.
- Per preparare il supporto basale - VEGF-A, determinare innanzitutto il numero totale di pozzi che necessitano di un supporto VEGF-A. Se ci sono tre pozze, allora 300 l/well x 3 x 900 l è il volume totale e 50 ng/well x 3 x 150 ng VEGF-A. Aggiungete 150 ng di VEGF-A in 900 l di mezzo basale per rendere il mezzo basale : VEGF-A.
NOTA: assemblare questa soluzione a un volume maggiore di quello calcolato per assicurare un numero sufficiente di aliquote più piccole per ogni esperimento.
- Il giorno 2, rimuovere il supporto da entrambe le camere (gli inserti e i pozzi). Lavare le colture con 300 - L di 1x PBS aggiungendo 100 - L agli inserti e 200 L nei pozze. Girare saldamente le piastre un paio di volte e rimuovere il PBS.
- Aggiungete 300 l di mezzo basale : 1% DiF (100 gradi nell'inserto e 200 l nei pozze) per affamare le colture per 24 h.
- Il giorno 3, dopo la fame, aggiungere 300 l di mezzo basale : 1% DiF (100 -L nell'inserto e 200 L nei pozze di controllo) rispettivamente nei pozze di controllo e nel mezzo basale - VEGF-A (50 ng/well) nei pozze di trattamento.
- Dopo il trattamento, continuare a far crescere le colture nell'incubatrice.
8. Fissaggio e immunostaining
NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi di avere le seguenti attrezzature e reagenti: 4% paraformaldeide (PFA), 1x PBS, anticorpi primari e secondari, uno shaker, 0.5% nonionic surfactant in PBS (PBT).
- Il sesto giorno di coltura, rimuovere il mezzo e lavare le colture con 1x PBS a temperatura ambiente (RT).
- Fissare le colture aggiungendo 200 l di 4% soluzione PFA nei pozze e 100 L negli inserti. Fissare le colture a 4 gradi centigradi per 20 min mentre dondola.
- Dopo 20 min di fissazione, togliere la PFA dalle colture in una cappa di fumi e lavare le colture con 1x PBS aggiungendo 200 l nei pozzi e 100 L negli inserti.
- Ripetere i lava3x, 10 min ciascuno, mentre dondolo. Quindi procedere all'immunostaining.
NOTA: tutti i passaggi di lavaggio vengono eseguiti su un banco a RT.
- Diluire gli anticorpi primari (anti-VE-Cadherin, anti-ERG 1/2/3) in soluzione di blocco (5% siero d'asino, 0,5% PBT). Aggiungete 300 l di soluzione anticorpale primaria (200 L nei pozze inferiori e 100 L negli inserti). Incubano colture negli anticorpi primari durante la notte a 4 gradi centigradi mentre dondolano.
NOTA: Anti-VE-Cadherin viene utilizzato per etichettare la membrana cellulare endoteliale e anti-ERG 1/2/3 viene utilizzato per etichettare il nucleo delle cellule endoteliali al fine di visualizzare i germogli angiogenici delle cellule endoteliali. - Il giorno successivo, lavare e scuotere le piastre di coltura 10x in 0.5% PBT, cambiando PBT ogni 10 min.
- Diluire gli anticorpi secondari (anti-ratto anti-ratto Alexa Fluor 488 e anti-coniglio anti-asino Alexa Fluor 555) in soluzione di blocco. Aggiungere 300 l dell'anticorpo secondario come al punto 8.2 e incubare le colture durante la notte a 4 gradi centigradi mentre dondola. Il giorno successivo, lavare gli anticorpi secondari 10x in PBT, cambiando PBT ogni 10 min.
NOTA: Lavare un minimo di 10x ma più lavaggi sono migliori. Una volta completati i lavamenti, le colture possono essere conservate con 1x PBS fino a quando non vengono montate su scivoli.
9. Montaggio delle colture su diapositive, imaging e analisi
NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi di avere le seguenti attrezzature e reagenti: pinze sottili, scivoli, supporto di montaggio con 4-6-diamidino-2-fenilondole (DAPI), coprilabbra e microscopio confocale. Dopo la colorazione dell'anticorpo secondario, montare le colture sui vetrini per l'imaging utilizzando i seguenti passaggi.
- Sbucciare attentamente la membrana dall'inserto con pinze sottili e trasferirla sui vetrini mettendo il lato della membrana verso il basso e posizionando le colture espiante verso l'alto. Inserire i campioni di replica nelle stesse diapositive ed etichettare le diapositive come controllo o VEGF-A. Aggiungere alcune gocce di supporto di montaggio con DAPI direttamente sulla membrana e coprire i vetrini con gli scivoli di copertura.
NOTA: Assicurarsi di evitare le bolle d'aria durante il posizionamento dei coperchi. - Sigillare i bordi dei vetrini con smalto trasparente e lasciare asciugare.
NOTA: Le diapositive possono essere conservate in -20 gradi centigradi per l'archiviazione a lungo termine. - Diapositive di immagini con un microscopio confocale.
- Eseguire analisi per misurare la lunghezza della escrescenza angiogenica. Quantificare la lunghezza della crescita angiogenica misurando la distanza delle cellule endoteliali (Ve-Cadherin,ERG 1/2/3) estesa dal limite interno delle cellule ERG 1/2/3 nelle colture ventricole e dal centro degli espiatori SV nelle colture SV.
- Per eseguire la quantificazione utilizzando FIJI/ImageJ, scaricare prima il software FIJI.
- Aprire i file di immagine in FIJI: andare su File Proprietà Open . Proprietà Folder . Proprietà Filename . Aperto.
- Vai a Analizzare Impostare le misure Selezionare Perimetro.
- Selezionare lo strumento Linea retta dalla finestra principale.
- Disegnare una linea sulla lunghezza di un germoglio come suggerito nel passaggio 9.4.
- Vai a Analizzare Misurare.
NOTA: le misure della lunghezza vengono visualizzate nella nuova finestra. - Eseguire la quantificazione nelle immagini che rappresentano almeno tre campi di visualizzazione selezionati casualmente. Calcolare la media delle misurazioni della lunghezza del germoglio e riportarle come media e deviazione standard.
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Representative Results
Una delle caratteristiche più sorprendenti dell'angiogenesi SV in vivo è che segue un percorso specifico e coinvolge eventi di dedifferenziazione cellulare e ridifferenziazione che si verificano in tempi e posizioni stereotipati1. Man mano che le cellule SV iniziali crescono sul ventricolo cardiaco, smettono di produrre marcatori venosi come COUP-TFII (Figura 7). Successivamente, i germogli coronarici prendono due percorsi di migrazione, sia sulla superficie del cuore o in profondità all'interno del miocardio. I vasi di superficie alla fine diventano vene mentre i vasi di invaso diventano arterie e capillari1,6,7. Questa distinzione è preservata man mano che il cuore cresce e la vascolatura coronarica si espande.
Per facilitare la scoperta delle basi molecolari dello sviluppo coronarica, abbiamo ideato un modello in vitro di germoglio SV che può essere utilizzato per esperimenti di perdita di funzione e guadagno di funzione. I tessuti SV dei cuori muri embrionali vengono sezionati, posizionati sulla parte superiore dell'ECM diluito (disponibile in commercio, vedi Tabella dei materiali) e mantenuti nell'interfaccia aria-liquido nel mezzo di crescita delle cellule endoteliali. Il miocardio SV continua a battere per tutto il periodo culturale. Dopo 2 giorni di coltura, le cellule epicardiche che allineano il tessuto lasciano l'espianto e migrano sulla matrice. Dopo 5 giorni, le cellule endoteliali SV germogliano fuori e migrano sul tessuto epicardico (Figura 8A, punte di freccia nera). Collettivamente, questo processo riassume gli aspetti angiogenici dello sviluppo coronarica.
Anche i germogli Sprout colti subiscono una venosa dedifferenziazione. Come nel cuore embrionale, l'espressione COUP-TFII si riduce man mano che i vasi migrano dalla SV (Figura 8B, rispetto alla figura 7). I vasi di controllo come le arterie sac e le vene ombelicali o tuolk possono produrre vasi germoglianti. Tuttavia, sono meno numerosi e più lunghi e non cambiano la loro identità arteriosa o venosa (non mostrata). Pertanto, la riprogrammazione venosa è specifica per la spuntatura di SV e non una caratteristica generale dell'angiogenesi o una risposta ai componenti ECM. Questi dati indicano anche che i tipi di cellule contenuti all'interno della SV stessa sono necessari e sufficienti per indurre la dedifferenziazione.
È ben noto che il fattore di crescita endoteliale vascolare A (VEGF-A) è un potente induttore di angiogenesi7,13,14,15,16,17,18. Studi precedenti hanno dimostrato che il VEGF-A miocardico stimola l'angiogenesi endocardiale a far crescere i vasi coronarici7. Inoltre, le cellule endoteliali coronariche hanno dimostrato di esprimere il recettore VEGF-A, e vasi coronarici derivati da SV nel miocardio potrebbero crescere in risposta al VEGF-A in vivo2. Per dimostrare che il nostro modello in vitro di angiogenesi coronarica risponde fedelmente a VEGF-A, abbiamo stimolato le culture SV ed Endo con VEGF-A. Come previsto, i nostri risultati hanno mostrato che sia SV che Endo sono altamente reattivi al VEGF-A. Le colture stimolate con VEGF-A mostrano una maggiore crescita di germogli angiogenici sia in densità che in lunghezza (Figura 9A,C). Le colture SV stimolate da VEGF-A mostrano un aumento quasi 3 volte della lunghezza del germoglio rispetto al controllo (Figura 9B). Questi risultati suggeriscono che i germogli endoteliali da SV ed Endo rispondono a segnali simili che sono noti in vivo.
Nel loro insieme, i nostri dati suggeriscono che queste colture di espiantanti in vitro condividono eventi cellulari e molecolari simili che si verificano durante lo sviluppo coronarica in vivo, tra cui la dedifferenziazione venosa e la robusta crescita in risposta alla stimolazione VEGF-A. Pertanto, i nostri dati suggeriscono che questi modelli di coltura delle espiantazioni sono utili per studiare l'angiogenesi coronarica in vitro.
Figura 1: Identificazione della spina vaginale. (A) Una spina vaginale (macchia bianca). (B) Vista ingrandita della regione inscatolata, compreso il tappo vaginale (indicato dalla freccia). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Accesso alla stringa embrionale nell'utero di un topo incinta. Un topo incinta eutanasia è posizionato con la sua superficie ventrale e spruzzato con 70% di etanolo a pelle bagnata per la dissezione. La pelle viene tirata verso l'alto nella regione pelvica usando pinze e viene fatta una piccola incisione. L'incisione si estende lateralmente. Un'ulteriore incisione viene effettuata anteriormente fino al diaframma. Nell'utero è visibile una stringa di embrioni (indicata da punte di freccia). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: dissezione e rimozione degli embrioni dall'utero. (A) Immagine che mostra l'utero contenente una serie di embrioni. La membrana sul lato dorsale dell'embrione (di fronte al lato in cui si trova la placenta) viene staccata. (B) L'embrione nel sacco del tuorlo diventa visibile dopo aver staccato la membrana dell'utero. (C,D) L'embrione attaccato alla placenta con il cordone ombelicale è visibile dopo aver staccato il sacco del tuorlo. Amnion è staccato se ancora presente. (E) Immagine che mostra un embrione attaccato alla placenta dal cordone ombelicale. (F) Immagine che mostra il distacco dell'embrione dalla placenta tirando sul cordone ombelicale (Umb. Cord) con pinze. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Rimozione del cuore/polmoni' che strappano dagli embrioni. (A,B) La testa viene rimossa dall'embrione catturando al collo e raschiandolo via. (C) Immagine che mostra la rimozione della testa dal corpo. (D) Il corretto posizionamento dell'embrione per la dissezione cardiaca. L'embrione è posizionato con il lato ventrale verso l'alto per avere un facile accesso alla cavità toracica per la rimozione del cuore. Una volta posizionato l'embrione come mostrato nella D, la cavità toracica viene aperta con le pinze. (E) Immagine che mostra la cavità toracica aperta con il cuore esposto sul lato ventrale. (F) Per rimuovere il cuore senza danneggiare la SV, il cuore viene capovolto anteriormente e l'aorta dorsale diventa visibile. (G) Immagine che mostra la posizione alla base del cuore/polmoni dove l'aorta/vena dorsale viene catturata con pinze e il pizzico cuore/polmoniè tirato fuori anteriormente. (H) L'immagine mostra il cuore/polmoni e11.5 estratto dall'embrione. V. cuore - cuore ventrale; d. cuore - cuore dorsale; d. aorta - dorsale aorta; LA - atrio sinistro; RA - atrio destro; LV - ventricolo sinistro; RV - ventricolo destro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Isolamento di SV e ventricoli dai cuori embrionali. (A) Immagine che mostra la vista dorsale del cuore/polmoni isolato che strappa l'embrione e11.5. È indicata la posizione dell'SV nel cuore. (B) Immagine del cuore dopo che le gemme polmonari sono state rimosse. (C) Gli atri e i tessuti adiacenti che circondano la SV vengono rimossi, rivelando l'aorta. La posizione della SV è etichettata. (D) Immagine che mostra la rimozione della SV. Utilizzando pinze, la SV è afferrato alla sua base e viene raschiato dal cuore. (E) SV rimosso dal cuore è mostrato insieme al tessuto rimanente del cuore. L'aorta e il tronco polmonare (PT), collettivamente chiamati tratto di deflusso (OFT), diventano visibili nel cuore dopo la rimozione della SV. L'SV verrà utilizzato per la coltura in vitro, come descritto nella Figura 6 (riquadro sinistro). (F) La posizione dell'OFT da sezionare è contrassegnata da una linea bianca tratteggiata. (G) Aorta/PT (tratto di deflusso) viene rimosso dai ventricoli per dissezione nella posizione indicata nel pannello F. I ventricoli rimanenti senza l'OFT vengono utilizzati per le colture ventricole, come illustrato nella Figura 6 (pannello destro). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Schema che mostra il flusso di lavoro della cultura SV e ventricolo. Sinistra: Procedura per la cultura SV. In primo luogo, l'SV viene rimosso dai cuori e11.5 e posto su un inserto di coltura. L'inserto contiene membrana porosa sul fondo (8 m poro) ed è rivestito con fattore di crescita ridotto ECM. Gli inserti vengono collocati nei pozze di un pozzo 24. Il mezzo viene aggiunto sia nella camera inferiore che superiore senza coprire l'espianto. La cultura è coltivata per 5 giorni. Dopo 5 giorni, la membrana viene rimossa dall'inserto e montata sui vetrini per l'imaging e l'analisi. A destra: Procedura per la coltura del ventricolo. Ventricles senza SV, atri a, e OFT vengono rimossi dai cuori e11.5 e sono colti come descritto sopra per il SV. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Espressione COUP-TFII viene persa nei germogli SV in vivo. (A) Vista dorsale dei cuori e11.5. Immagine confocale del marcatore endoteliale (rosso) che etichetta il venso del seno (SV), i germogli coronarici (cs, la linea tratteggiata) e l'endocardio (endo) che rivestono il lume del cuore. (B) Il vennoso produttore COUP-TFII (verde), un fattore di trascrizione della vena (trx), espresso nella SV, espresso progressivamente quando i germogli lasciano l'SV e crescono sul venttricle. A destra: Ingrandimento più elevato del germoglio coronario mostrato nella regione in scatola del pannello A. Barra della scala - 100 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Modelli in vitro di identità venosa e riprogrammazione. (A) Immagine luminosa del tessuto SV coltivato. I germogli vascolari (punte di freccia) si prosciustrano dall'espianto originale (linea tratteggiata nera) sopra il substrato ECM. (B) Immunofluorescenza delle colture SV etichettate con anticorpi che segnano la superficie cellulare endoteliale (VE-Cadherin), nuclei cellulari endoteliali (ERG 1/2/3) e nuclei venali ed epicardici (COUP-TFII). Nuclei sono positivi sia per ERG 1/2/3 che per COUP-TFII presso la SV, ma ERG 1/2/3 solo nei germogli che migrano sopra l'ECM. Barra di scala : 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: SV ed endocardio rispondono al VEGF-A in vitro. (A) Immagine confocale del controllo di 5 giorni e della coltura di espianto SV trattati di 5 giorni. Le cellule endoteliali sono immunostainse con VE-cadherin (verde), nuclei cellulari endoteliali macchiati con anticorpi ERG 1/2 (rosso) e nuclei cellulari con DAPI (blu). (B) La disoccupazione angiogenica delle cellule endoteliali è quantificata misurando la lunghezza dell'estensione del germoglio (la distanza migrata dalle cellule endoteliali ERG 1/2/3 dall'eximpianto, indicata da linee continue bianche nei pannelli inferiori di (A). (C) Immagine confocale di una cultura di 5 giorni di controllo e ventricoli trattati con VEGF-A. Le cellule endoteliali sono immunostainse con VE-cadherin (verde) e i nuclei delle cellule endoteliali sono macchiati con anticorpi ERG 1/2/3 (blu). I punti sono misure individuali e le barre di errore sono meschinamente : Barra della scala SD - 200 m (A,C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Alcuni dei passaggi più critici per la crescita con successo dei vasi coronarici dai tessuti progenitivi SV ed Endo sono: 1) Identificare e isolare correttamente il tessuto SV per la coltura SV; 2) l'uso di ventricoli da embrioni di età compresa tra e11 e 11,5 per una cultura accurata degli Endo; 3) mantenere le condizioni sterili per tutto il periodo di dissezione e mantenere i tessuti freddi in ogni momento; e 4) mantenendo le espiatori attaccate alla membrana rivestita ECM per evitare che il tessuto galleggiasse nel mezzo.
In primo luogo, l'isolamento del tessuto SV può essere difficile. È importante rendersi conto che la SV si trova sul lato dorsale del cuore tra gli atri sinistro e destro nascosti all'interno dei lobuli polmonari. Pertanto, è difficile separare e isolare. Invece, tutto il cuore / polmoni cogliere deve essere estratto prima. L'SV viene quindi isolato dal pizzico rimuovendo con attenzione i lobuli polmonari e pulendo i tessuti adiacenti con l'aiuto di pinze fini. Inoltre, si deve essere molto attenti durante la pulizia dei tessuti adiacenti per non perdere la SV.
In secondo luogo, per l'angiogenesi endocardiale accurata, è importante coltura ventricoli da embrioni non più vecchi di e11.5. Negli embrioni e12.5 e più vecchi, le coronarie della SV crescono in una percentuale significativa dei ventricoli. Pertanto, i vasi coronarici che crescono da ventricoli più vecchi possono essere costituiti da entrambi i vasi coronarici derivati da SV e Endo1,2,10,19,20. Per questo motivo, per disprima con precisione la crescita del vaso coronarico dall'Endo, è fondamentale per i ventricoli di coltura (meno SV e tratto di deflusso) da e11.5 embrioni20. Inoltre, l'SV è relativamente più grande ed è più facile da isolare a e11.5.
In terzo luogo, poiché il protocollo comporta una notevole quantità di lavoro al di fuori della cappa di coltura dei tessuti, è fondamentale mantenere un ambiente di lavoro sterile. È importante sterilizzare gli strumenti di dissezione (pinze, forbici, ecc.) e le piastre di coltura dei tessuti ed evitare il contatto con le aree non sterili in ogni momento. È importante spruzzare l'area di lavoro e il campo di dissezione con 70% di etanolo. Per evitare la contaminazione, è importante eseguire rapidamente la procedura di dissezione e ridurre al minimo il lavoro al di fuori del cofano di coltura dei tessuti.
In quarto luogo, per ottenere colture espiante sane, è importante che gli espianti rimangano attaccati alla base della membrana in ogni momento. Gli espianti galleggianti nel mezzo devono essere evitati per far crescere con successo le colture espiante. Per evitare di galleggiare, è fondamentale mantenere un'interfaccia aria-liquido in cui la superficie basale dell'inserto è a contatto con il mezzo, ma la superficie superiore è esposta all'aria. Tale interfaccia si ottiene quando l'espianto è sufficientemente coperto dal mezzo, ma non è completamente sommerso. È importante monitorare il volume del mezzo giornaliero, poiché il volume può essere perso per evaporazione. Per evitare questo, la piastra di coltura può essere umidificata con l'aggiunta di PBS nei pozze inutilizzate delle piastre di coltura.
Simili colture espiante di SV ed Endo sono descritte altrove20. In questi metodi, gli espianti sono stati coltivati direttamente nei pozzi delle lastre di coltura dei tessuti, il che limita l'imaging confocale ad alta risoluzione. Le immagini catturate in questo ambiente sono di qualità relativamente scarsa rispetto al metodo qui proposto, limitando analisi microscopiche dettagliate. Per aggirare questo, abbiamo utilizzato inserti di coltura da cui le membrane che contengono la coltura possono essere staccate e montate sui vetrini di vetro per l'imaging. Ciò consente l'imaging confocale ad alta risoluzione in cui è possibile visualizzare dettagli cellulari come modelli di espressione e morfologia. Inoltre, la coltura diretta sulle piastre richiede un protocollo di colorazione separato per DAPI o altre macchie di marcatori pan-nucleari. Questo protocollo non richiede passaggi di colorazione separati perché i vetrini possono essere montati con un supporto di montaggio contenente DAPI. Inoltre, il montaggio su scivoli consente di immagazzinare a lungo termine senza sbiadire fluorescenti, mentre le colture immagazzinate in pozzi con un mezzo liquido si tradurranno in una rapida dissolvenza e non sono suscettibili di stoccaggio e imaging a lungo termine.
I modelli di coltura in vitro qui descritti sono ideali per interrogare i meccanismi cellulari e molecolari dell'angiogenesi coronarica in modo accessibile e ad alto valore. Questo sistema in vitro può essere utilizzato per esaminare potenziali farmaci o bersagli molecolari per valutare il loro effetto sull'angiogenesi coronarica. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato anche per studiare il guadagno di funzione e perdita di funzione di vari geni per la loro funzione autonoma nell'angiogenesi coronarica. Abbiamo osservato che i germogli coronarici di SV seguivano la migrazione epicardiale nelle nostre colture in vitro, suggerendo un'importante interazione tra cellule endoteliali coronariche e cellule epicardiche. È ben noto che l'epicardio è una ricca fonte di fattori di crescita per l'angiogenesi coronarica dal SV. Ad esempio, sono stati precedentemente dimostrati fattori di crescita di derivazione epicardiale come VEGF-C ed ELABELA per regolare l'angiogenesi coronarica di derivazione da SV2,19. Possiamo usare questo sistema di coltura SV per studiare ulteriormente l'interazione tra le cellule endoteliali dell'epicardio e identificare nuove vie molecolari derivate dall'epicardiodellano dell'angiogenesi coronarica. Inoltre, i nostri dati in vivo suggeriscono che l'ipossia miocardiale può essere coinvolta nell'angiogenesi endocardiale19. Il nostro sistema di coltura in vitro offre un ottimo modello per studiare il ruolo dell'ipossia nell'angiogenesi endocardiale incubando le culture in condizioni ipossiche o normossiche. Questi sono esperimenti difficili da condurre in vivo perché richiede che un topo incinta sia collocato in una camera ipossica controllata. Dalla nostra esperienza, è molto difficile ottenere risultati coerenti e affidabili da esperimenti in vivo. In sintesi, il nostro modello in vitro di angiogenesi coronarica fornisce un sistema affidabile per interrogare una vasta gamma di domande relative alla biologia cellulare e molecolare dell'angiogenesi coronarica.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano i membri del laboratorio Sharma per aver fornito un ambiente di ricerca favorevole. Ci piace estendere un ringraziamento speciale a Diane (Dee) R. Hoffman che mantiene e si prende cura della nostra colonia di topi. Vorremmo anche ringraziare i dottori Philip J. Smaldino e Carolyn Vann per la revisione completa del manoscritto e fornire commenti utili. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi provenienti da Ball State University Provost Office e Department of Biology a B.S, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant fondi a B.S, e NIH (RO1-HL128503) e i fondi della New York Stem Cell Foundation a K.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
References
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