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Medicine

स्पाइनल इम्प्लांट संक्रमण के विवो माउस मॉडल में।

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/60560
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 2, 2, 2, 2, 2, 1, 1, 1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles, 2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 3University of South Carolina School of Medicine, University of South Carolina

ERRATUM NOTICE

Summary

प्रोटोकॉल स्पाइनल इम्प्लांट संक्रमण के विवो माउस मॉडल में एक उपन्यास का वर्णन करता है जहां एक स्टेनलेस-स्टील के-वायर इम्प्लांट बायोल्यूमिनेसेंट स्टेफिलोकोकस ऑरियस एक्सएन 36 से संक्रमित है। बैक्टीरियल बोझ की निगरानी बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग के साथ अनुदैर्ध्य रूप से की जाती है और इच्छामृत्यु के बाद कॉलोनी बनाने वाली इकाई की गिनती के साथ पुष्टि की जाती है।

Abstract

स्पाइन इम्प्लांट संक्रमण खराब परिणामों को दर्शाता है क्योंकि निदान चुनौतीपूर्ण है और सर्जिकल उन्मूलन यांत्रिक रीढ़ की हड्डी की स्थिरता के विपरीत है। इस विधि का उद्देश्य स्पाइनल इम्प्लांट संक्रमण (एसआईआई) के एक नए माउस मॉडल का वर्णन करना है जिसे स्पाइनल इम्प्लांट संक्रमण के लिए संभावित चिकित्सीय और उपचार रणनीतियों का परीक्षण करने के लिए विवो टूल में एक सस्ती, तेज और सटीक प्रदान करने के लिए बनाया गया था।

इस विधि में, हम पश्चवर्ती-दृष्टिकोण रीढ़ की हड्डी की सर्जरी का एक मॉडल प्रस्तुत करते हैं जिसमें एक स्टेनलेस-स्टील के-तार को 12 सप्ताह के सी 57बीएल / 6 जे जंगली-प्रकार के चूहों की एल 4 स्पिनस प्रक्रिया में स्थानांतरित किया जाता है और स्टेफिलोकोकस ऑरियस ज़ेन 36 बैक्टीरिया के बायोल्यूमिनेसेंट स्ट्रेन के 1 x 103 सीएफयू के साथ टीका लगाया जाता है। चूहों को तब पोस्ट-ऑपरेटिव दिनों 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 और 35 पर विवो में बायोल्यूमिनेसेंस के लिए अनुदैर्ध्य रूप से चित्रित किया जाता है। विवो बैक्टीरियल बोझ को मापने के लिए एक मानकीकृत क्षेत्र से बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग (बीएलआई) संकेतों को परिमाणित किया जाता है।

प्रत्यारोपण और पेरी-इम्प्लांट ऊतक का पालन करने वाले बैक्टीरिया की मात्रा निर्धारित करने के लिए, चूहों को इच्छामृत्यु दी जाती है और प्रत्यारोपण और आसपास के नरम ऊतक की कटाई की जाती है। बैक्टीरिया को सोनिकेशन द्वारा इम्प्लांट से अलग किया जाता है, रात भर सुसंस्कृत किया जाता है और फिर कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की गणना की जाती है। इस विधि से प्राप्त परिणामों में विवो एस ऑरियस बायोल्यूमिनेसेंस (औसत अधिकतम प्रवाह) और इच्छामृत्यु के बाद सीएफयू गणना द्वारा मापा गया अनुदैर्ध्य जीवाणु गणना शामिल है।

जबकि इंस्ट्रूमेंटेड स्पाइन संक्रमण के पूर्व पशु मॉडल में आक्रामक, पूर्व विवो ऊतक विश्लेषण शामिल है, इस पेपर में प्रस्तुत एसआईआई का माउस मॉडल स्थिर ऊतक अध्ययन को बदलने के लिए बायोल्यूमिनेसेंट बैक्टीरिया के विवो ऑप्टिकल इमेजिंग में गैर-आक्रामक, वास्तविक समय का लाभ उठाता है। मॉडल के अनुप्रयोग व्यापक हैं और इसमें वैकल्पिक बायोल्यूमिनेसेंट बैक्टीरियल उपभेदों का उपयोग करना, मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का समकालीन अध्ययन करने के लिए अन्य प्रकार के आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों को शामिल करना और एंटीबायोटिकदवाओं या प्रत्यारोपण कोटिंग्स जैसे नए नैदानिक और चिकित्सीय तौर-तरीकों का मूल्यांकन करना या जांच करना शामिल हो सकता है।

Introduction

इस विधि का उद्देश्य स्पाइनल इम्प्लांट संक्रमण (एसआईआई) के एक नए माउस मॉडल का वर्णन करना है। इस मॉडल को विवो में मेजबान, रोगज़नक़ और / या प्रत्यारोपण चर के प्रभाव का लचीले ढंग से आकलन करने के लिए एक सस्ती और सटीक उपकरण प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। इस मॉडल में स्पाइनल इम्प्लांट संक्रमण के लिए संभावित चिकित्सीय और उपचार रणनीतियों का परीक्षण बड़े पशु मॉडल और नैदानिक परीक्षणों में आवेदन से पहले अनुसंधान विकास का मार्गदर्शन करने के उद्देश्य से है।

रीढ़ की सर्जरी के बाद प्रत्यारोपण से संबंधित संक्रमण एक विनाशकारी जटिलता है और दुर्भाग्य से वैकल्पिक रीढ़ की सर्जरी से गुजरने वाले लगभग 3-8% रोगियों में 1,2,3,4,5 और बहुस्तरीय यासंशोधन सर्जरी से गुजरने वाले 65% रोगियों में होताहै। स्पाइनल इम्प्लांट संक्रमण के उपचार के लिए अक्सर कई अस्पताल में भर्ती, कई सर्जरी और लंबे समय तक एंटीबायोटिक थेरेपी की आवश्यकता होती है। एसआईआई न्यूरोलॉजिकल समझौता, विकलांगता और मृत्यु दर के बढ़ते जोखिम सहित खराब रोगी परिणामों को दर्शाता है। एसआईआई का प्रबंधन बेहद महंगा है, जिसकी लागत प्रति रोगी$ 900,000 से ऊपर है।

स्टेफिलोकोकस ऑरियस एसआईआई 8,9,10,11 का सबसे आम विषैला रोगज़नक़ है। बैक्टीरिया सर्जरी के दौरान सीधे हार्डवेयर को बीज दे सकते हैं, पोस्टऑपरेटिव अवधि के दौरान घाव के माध्यम से, या बाद में हेमटोजेनस प्रसार के माध्यम से। धातु प्रत्यारोपण की उपस्थिति में, एस ऑरियस बायोफिल्म बनाता है जो बैक्टीरिया को एंटीबायोटिक थेरेपी और प्रतिरक्षा कोशिकाओं से बचाता है। जबकि संक्रमित हार्डवेयर को हटाने से संक्रमण को प्रभावी ढंग से मिटाने में मदद मिल सकती है, यह अक्सर अस्थिरता पैदा किए बिना रीढ़ की हड्डी में संभव नहीं होता है और न्यूरोलॉजिकल समझौता12 का खतरा होता है।

संक्रमित हार्डवेयर की खोज की अनुपस्थिति में, एसआईआई को रोकने, पता लगाने और इलाज करने के लिए नए दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। ऐतिहासिक रूप से, नए उपचारों की सुरक्षा और प्रभावकारिता का कुशलतापूर्वक आकलन करने के लिए एसआईआई के सीमित पशु मॉडल रहे हैं। एसआईआई के पिछले पशु मॉडल में बड़ी संख्या में जानवरों की आवश्यकता होती है और कॉलोनी गिनती, हिस्टोलॉजी और संस्कृति13,14,15 सहित इच्छामृत्यु की आवश्यकता वाले डेटा बिंदुओं के संग्रह की आवश्यकता होती है। विवो निगरानी में अनुदैर्ध्य की कमी, ये मॉडल प्रति जानवर केवल एक डेटा बिंदु प्रदान करते हैं और इसलिए महंगे और अक्षम हैं।

घुटने के आर्थ्रोप्लास्टी संक्रमण के एक माउस मॉडल का अध्ययन करने वाले पिछले काम ने संक्रमणके बोझ की अनुदैर्ध्य निगरानी के लिए विवो ऑप्टिकल इमेजिंग में नॉनइनवेसिव के मूल्य और सटीकता को स्थापित किया। बायोल्यूमिनेसेंस का पता लगाने से बैक्टीरिया के बोझ को एक ही जानवर में एक अनुदैर्ध्य समय पाठ्यक्रम में मानवीय, सटीक और कुशलता से निर्धारित किया जा सकता है। इसके अलावा, पूर्व अध्ययनों ने विवो बायोल्यूमिनेसेंस और प्रत्यारोपणके अनुरूप सीएफयू के बीच एक उच्च सहसंबंध का प्रदर्शन किया है। समय के साथ संक्रमण को ट्रैक करने की क्षमता ने प्रत्यारोपण से संबंधित संक्रमण की अधिक बारीक समझ पैदा की है। इसके अलावा, इस तरह से अनुदैर्ध्य संक्रमण की निगरानी ने एंटीबायोटिक थेरेपी और नोवेल एंटीमाइक्रोबियल की प्रभावशीलता का सटीक मूल्यांकन करने की अनुमति दी है16,17,18.

इन उपकरणों का लाभ उठाते हुए, हमने पोस्टऑपरेटिव स्पाइनल इम्प्लांट संक्रमण का एक मॉडल विकसित और मान्य किया। प्रस्तुत विधि में, हम बैक्टीरियल बोझ16,17,18 की अनुदैर्ध्य निगरानी के लिए एसआईआई के इनविवो माउस मॉडल को स्थापित करने के लिए बायोल्यूमिनेसेंट एस ऑरियस ज़ेन 36 के एक इनोकुलम का उपयोग करते हैं। यह नया मॉडल बड़े पशु मॉडल और नैदानिक परीक्षणों में उनके आवेदन से पहले एसआईआई के लिए संभावित पहचान, रोकथाम और उपचार रणनीतियों का कुशलतापूर्वक परीक्षण करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है।

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Protocol

पशु कल्याण अधिनियम (एडब्ल्यूए), प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए 1996 गाइड, प्रयोगशाला जानवरों की मानवीय देखभाल और उपयोग के लिए पीएचएस नीति, साथ ही पशु देखभाल और उपयोग के लिए संस्थान की नीतियों और प्रक्रियाओं में परिभाषित संघीय नियमों में परिभाषित अच्छे पशु अभ्यास के अनुसार सभी जानवरों को सख्ती से संभाला गया था। और सभी जानवरों के काम को कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय लॉस एंजिल्स चांसलर की पशु अनुसंधान समिति (एआरसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. एस ऑरियस बायोल्यूमिनेसेंट स्ट्रेन विकल्प।

  1. बायोल्यूमिनेसेंट एस ऑरियस स्ट्रेन Xen36 का उपयोग रुचि के इनोकुलम के रूप में करें।
    नोट: यह तनाव माता-पिता के तनाव एस ऑरियस एटीसीसी -49525 से लिया गया था, जो एक सेप्टिक रोगी से नैदानिक अलगाव है। एस ऑरियस। Xen36 विशिष्ट रूप से एक लक्सABCDE ऑपेरॉन का उपयोग करता है, जिसे मेजबान के मूल प्लास्मिड में अनुकूलित और एकीकृत किया जाता है। नतीजतन , Xen36 स्ट्रेन 490 nm के चरम तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन के साथ नीले-हरे रंग के बायोल्यूमिनेसेंट प्रकाश का उत्पादन करने में सक्षम है। यह उत्सर्जन संकेत केवल जीवित चयापचय रूप से सक्रिय जीवाणु जीवों द्वारा निर्मित होता है।

2. एस की तैयारी। टीकाकरण के लिए ऑरियस

  1. लक्स ऑपेरॉन19 से जुड़े कानामाइसिन प्रतिरोध जीन का उपयोग करके, संभावित संदूषकों से एस ऑरियस ज़ेन 36 को अलग करने के लिए लुरिया शोरबा में 200 μg / mL Kanamycin और 1.5% एगर जोड़ें।
  2. स्ट्रीक एस ऑरियस ज़ेन 36 बैक्टीरिया ट्राइप्टिक सोया एगर प्लेटों (ट्राइप्टिक सोया शोरबा [टीएसबी] प्लस 1.5% एगर) पर और 12-16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करते हैं।
  3. एक हिलने वाले इनक्यूबेटर (200 आरपीएम) में 37 डिग्री सेल्सियस पर 12-16 घंटे के लिए टीएसबी में एस ऑरियस ज़ेन 36 और व्यक्तिगत संस्कृति की एकल कॉलोनियों को अलग करें।
  4. परिणामी संस्कृति को 1:50 के अनुपात में पतला करें।
  5. मिडलघुगणकीय चरण बैक्टीरिया को अलग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 2 घंटे के लिए कल्चर करें।
  6. फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में बैक्टीरिया को तीन बार गोली मारना, पुन: निलंबित करना और धोना।
  7. 600 एनएम पर अवशोषण को मापें। आदर्श OD600 0.700 और 0.750 के बीच है जो 4x105 CFU / mL से मेल खाती है। वांछित बैक्टीरियल इनोकुलम (1 x 103 सीएफयू / 2 μL) प्राप्त करने के लिए सीरियल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें।
    नोट: क्रोनिक संक्रमण की स्थापना के लिए Xen36 की इष्टतम एकाग्रता 1 x 103 CFU पाई गई। बैक्टीरिया की कम खुराक मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा साफ की गई थी और उच्च खुराक घाव टूटने का कारण बनी थी। घाव टूटना एक गहरे प्रत्यारोपण संक्रमण और एक सतही घाव संक्रमण के बीच अंतर नहीं करता है और इसलिए इस मॉडल (चित्रा 1)20 में टाला जाता है।

3. चूहे

  1. 12 सप्ताह के नर C57BL/6J जंगली प्रकार के चूहों का उपयोग करें।
  2. पिंजरों में चूहों को एक समय में अधिकतम 4 के साथ रखें।
  3. हर समय पानी उपलब्ध रखें। 12 घंटे के प्रकाश / अंधेरे चक्र को बनाए रखें और चक्र के अंधेरे चरण के दौरान प्रयोग न करें।
  4. फ्लोरोसेंट सिग्नलिंग के साथ संभावित हस्तक्षेप के कारण खिलाने के लिए अल्फाल्फा-मुक्त चाउ का उपयोग करें।
  5. प्रयोग की संपूर्णता में जानवरों की भलाई सुनिश्चित करने के लिए अनुसंधान या पशु चिकित्सा कर्मचारियों ने रोजाना चूहों का आकलन किया है।

4. माउस शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं

  1. चूहों को लगभग 5 मिनट के लिए एक आइसोफ्लुरेन (2%) कक्ष में रखकर संज्ञाहरण को प्रेरित करें। जागने और हानिकारक उत्तेजनाओं (जैसे, सर्जिकल हेरफेर, पैर की अंगुली चुटकी) के जवाब में नहीं बदलने की तुलना में लयबद्ध और धीमी रहने के लिए श्वसन की निगरानी करके संज्ञाहरण की उचित गहराई की पुष्टि करें।
  2. एनेस्थेटाइज्ड चूहों को एक तैयारी स्टेशन में स्थानांतरित करें और कृंतक क्लिपर के साथ ऊपरी वक्ष रीढ़ की थैली से बालों को हटा दें।
  3. वैकल्पिक बीटाडीन समाधान और आइसोप्रोपिल अल्कोहल के ट्रिपल वॉश के साथ त्वचा को साफ और निष्फल करें।
  4. नाक शंकु के माध्यम से इनहेल्ड आइसोफ्लुरेन (2%) के प्रशासन के साथ एनेस्थेसिया बनाए रखने वाले बाँझ सर्जिकल बिस्तर पर प्रवण स्थिति में एनेस्थेटाइज्ड और स्टरलाइज़्ड चूहों को स्थानांतरित करें।
  5. कूल्हों को अधिकतम रूप से फ्लेक्स करें और रीढ़ के स्तर पर घुटने की स्थिति की पहचान करें ताकि काठ 4 कशेरुक शरीर का अनुमान लगाया जा सके।
  6. 15-ब्लेड सर्जिकल स्केलपेल के साथ त्वचा के माध्यम से एक अनुदैर्ध्य 2 सेमी चीरा बनाएं।
  7. मध्य रेखा की पुष्टि करने के लिए घुमावदार प्रक्रियाओं को घुमाएं और चीरा को हड्डी तक जारी रखें।
  8. एल 4 स्पिनस प्रक्रिया के दाईं ओर सबपेरियोचुपके से विच्छेदन करें, जो अनुप्रस्थ प्रक्रिया तक पार्श्व रूप से विस्तारित हो।
  9. भविष्य में बंद होने की तैयारी में एक अवशोषक चोटी वाले सीवन आकार 5-0 सेफेलड और कॉडाड को प्रावरणी के माध्यम से एल 4 शरीर में पारित करें और खुला छोड़ दें।
  10. 25 ग्राम रीढ़ की सुई का उपयोग करके, 25 ग्राम रीढ़ की सुई का उपयोग करके एल 4 की स्पिनस प्रक्रिया को फिर से तैयार करें और 0.1 मिमी व्यास, 1 सेमी लंबा "एल-आकार" सर्जिकल ग्रेड स्टेनलेस-स्टील इम्प्लांट डालें।
  11. इम्प्लांट को 1 x 103 सीएफयू / 2 μL बायोल्यूमिनेसेंट एस ऑरियस ज़ेन 36 के साथ टीका लगाएं, यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी समाधान प्रत्यारोपण से संपर्क करते हैं।
  12. इम्प्लांट पर इनोकुलम की रोकथाम सुनिश्चित करने के लिए टीकाकरण के बाद पहले से पारित अवशोषक सीवन को बांधने से पहले लगभग 10 सेकंड प्रतीक्षा करें।
  13. अवशोषित सीवन के साथ चलने वाले फैशन में त्वचा को बंद करें।
  14. बुप्रेनोर्फिन (0.1 मिलीग्राम / किग्रा) के चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से दर्द की दवा का तुरंत उपयोग करें और फिर उसके बाद 3 दिनों के लिए हर 12 घंटे में।
  15. हीटिंग पैड पर चूहों को पुनर्प्राप्त करें और सामान्य गतिविधि पर लौटने के लिए निगरानी करें।
  16. इम्प्लांट के उचित प्लेसमेंट की पुष्टि करने के लिए पोस्टऑपरेटिव रेडियोग्राफ प्राप्त करें।

5. बैक्टीरियल बोझ को मापने के लिए विवो बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग में अनुदैर्ध्य

  1. इनहेल्ड आइसोफ्लुरेन (2%) के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें। जागने और हानिकारक उत्तेजनाओं (जैसे, सर्जिकल हेरफेर, पैर की अंगुली चुटकी) के जवाब में नहीं बदलने की तुलना में लयबद्ध और धीमी रहने के लिए श्वसन की निगरानी करके संज्ञाहरण की उचित गहराई की पुष्टि करें।
  2. कृंतक क्लिपर के साथ ऊपरी वक्ष रीढ़ की थैली से बालों को हटा दें।
  3. विवो बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग (बीएलआई) 19 में प्रदर्शन करने के लिए बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग प्लेटफॉर्म के दृश्य के क्षेत्र पर चूहों को लोड करें।
  4. 5 मिनट के अधिग्रहण समय में बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल कैप्चर करें। 15 सेमी फील्ड ऑफ व्यू (बी) के साथ बड़ी बिनिंग सेटिंग्स का उपयोग करें।
  5. बैक्टीरिया के बोझ की निगरानी के लिए पोस्टऑपरेटिव दिनों 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 और 35 (या विशिष्ट प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर अन्य दिनों) पर चरण 5.1-5.4 दोहराएं।
  6. ग्रेस्केल फोटोग्राफ पर कलर स्केल और ओवरले के माध्यम से बीएलआई डेटा प्रस्तुत करें। कुल फ्लक्स (फोटॉन प्रति सेकंड) या औसत अधिकतम फ्लक्स (फोटॉन / सेकंड / सेंटीमीटर2 / स्टेरडियन) में बीएलआई को मापने के लिए बीएलआई सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक मानक ओवॉइड क्षेत्र (आरओआई) को अलग करें।

6. प्रत्यारोपण और आसपास के ऊतक ों के अनुरूप बैक्टीरिया की मात्रा निर्धारित करें

  1. एवीएमए दिशानिर्देशों के अनुसार पीओडी 35 या कार्बन डाइऑक्साइड के संपर्क में आने के साथ पसंद की वैकल्पिक पोस्ट-ऑपरेटिव तारीख पर चूहों को इच्छामृत्यु दें। द्वितीयक गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के साथ इच्छामृत्यु की पुष्टि करें।
  2. चरण 4.3 के अनुसार पृष्ठीय त्वचा को निष्फल करें और माउस को बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र पर रखें।
  3. 15-ब्लेड सर्जिकल स्केलपेल का उपयोग करके पिछले चीरे को तेजी से इंजेक्ट करें।
  4. एल 4 स्पिनस प्रक्रिया को स्पष्ट रूप से विच्छेदित करने और सर्जिकल इम्प्लांट की पहचान करने के लिए बाँझ कैंची का उपयोग करें।
  5. एल 4 स्पिनस प्रक्रिया में इम्प्लांट को धीरे से मोड़ने और उसकी स्थिति से हटाने के लिए एक सुई चालक का उपयोग करें।
  6. बाँझ बल और कैंची का उपयोग करके, सर्जिकल इम्प्लांट के आसपास लगभग 0.1 ग्राम स्पिनस प्रक्रिया हड्डी और नरम ऊतक की कटाई करें और 4 तेज होमोजेनाइजिंग बीड्स के साथ छोटे शंक्वाकार राइनो ट्यूब में पीबीएस के 1 मिलीलीटर में रखें।
  7. फसल से पहले और बाद में शंक्वाकार ट्यूब का वजन करके नरम ऊतक का वजन रिकॉर्ड करें।
  8. इम्प्लांट को टीएसबी में 0.3% ट्वीन -80 के 0.5 एमएल में रखें और 15 मिनट के लिए सोनिकेट करें।
  9. परिणामस्वरूप इम्प्लांट निलंबन 2 मिनट के लिए और 12-16 घंटे के लिए रात भर कल्चर करें।
  10. होमोजिनाइज़र का उपयोग करके इम्प्लांट के आसपास 1 मिलीलीटर पीबीएस में पहले से रखी गई नरम ऊतक और स्पिनस प्रक्रियाओं को होमोजिनाइज़ करें।
  11. परिणामस्वरूप नरम ऊतक निलंबन 5 मिनट के लिए और रात भर 12-16 घंटे के लिए कल्चर करें।
  12. रात भर कल्चर के बाद, क्रमशः इम्प्लांट और आसपास के ऊतकों से सीएफयू की गणना करें। नरम ऊतक के लिए काटे गए कुल सीएफयू/जी और सोनिकेटेड इम्प्लांट के लिए सीएफयू/एमएल के रूप में व्यक्त मूल्य।

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Representative Results

यहां प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग एसआईआई के इनविवो माउस मॉडल में एंटीबायोटिक आहार की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए किया गया था। विशेष रूप से, वैनकोमाइसिन और रिफैम्पिन एंटीबायोटिक थेरेपी के संयोजन की प्रभावकारिता की तुलना वैनकोमाइसिन मोनोथेरेपी और अनुपचारित संक्रमित नियंत्रणों से की गई थी।

सर्जरी से पहले, चूहों को या तो संयोजन चिकित्सा, मोनोथेरेपी या संक्रमित नियंत्रण के लिए यादृच्छिक किया गया था। नमूना आकार की गणना करने के लिए एक सांख्यिकीय शक्ति विश्लेषण किया गया था। नमूना आकार निर्धारित करने के लिए औसत अधिकतम प्रवाह 1 x 10 5 ± 3.2 x 10 4 और1.4 x 105 के प्रत्याशित साधनों का उपयोग किया गया था, जिनकी गणना प्रत्येक समूह में एन = 10 के रूप में की गई थी। चूहों को सर्जिकल इम्प्लांटेशन से गुजरना पड़ा, एस ऑरियस ज़ेन 36 के साथ टीका लगाया गया, और पीओडी 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 और 35 पर विवो एस ऑरियस बायोल्यूमिनेसेंस में मापा गया। पीओडी 35 पर, चूहों की बलि दी गई और प्रत्यारोपण-अनुयायी और आसपास के ऊतक बैक्टीरिया के लिए सीएफयू की मात्रा निर्धारित की गई।

मोनोथेरेपी समूह में चूहों को वैनकोमाइसिन (110 मिलीग्राम / किग्रा दो बार दैनिक) की चिकित्सीय खुराक मिली। इस खुराक को वैनकोमाइसिन21,22,23 के लिए विशिष्ट मानव जोखिम के लिए वक्र के नीचे के क्षेत्र का अनुमान लगाने के लिए चुना गया था। संयोजन चिकित्सा समूह में चूहों को वैनकोमाइसिन (110 मिलीग्राम / किग्रा दो बार दैनिक) और रिफैम्पिन (25 मिलीग्राम / किग्रा दैनिक) की चिकित्सीय उपचर्म खुराक मिली। संक्रमित नियंत्रण समूह में चूहों को बाँझ खारा के शाम इंजेक्शन प्राप्त हुए। सभी समूहों के लिए उपचार पोस्टऑपरेटिव दिनों 7 से 14 तक किया गया था।

बीएलआई पर एंटीबायोटिक थेरेपी का प्रभाव
संक्रमित नियंत्रण चूहों में पीओडी 10 पर बीएलआई सिग्नल चरम पर थे जो बलिदान तक 1.0 x 105 फोटॉन / एस / सेमी 2 / एसआर से ऊपर रहे, सफलतापूर्वक एक पुरानी एसआईआई मॉडलिंग (चित्रा 2)। वैनकोमाइसिन मोनोथेरेपी के साथ इलाज किए गए चूहों में संक्रमित नियंत्रण की तुलना में बीएलआई संकेत काफी कम था, पीओडी 10-21 (पी < 0.03) से 2 गुना कमी के साथ। पीओडी 21 के बाद, मोनोथेरेपी और संक्रमित नियंत्रण समूहों के बीच बीएलआई में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। वैनकोमाइसिन-रिफैम्पिन संयोजन चिकित्सा के साथ इलाज किए गए चूहों में भी कम बीएलआई संकेत था, जो पीओडी 10 पर संक्रमित नियंत्रण से 20 गुना कम था। पीओडी 28 (पी<0.01) तक एक महत्वपूर्ण कमी बनी रही। पीओडी 28 के बाद, समूहों के बीच बीएलआई में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। पीओडी 35 पर अंतिम इमेजिंग में तीन समूहों में से किसी के बीच बीएलआई में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था।

प्रत्यारोपण और आसपास के ऊतक से सीएफयू।
पीओडी 35 पर चूहों की बलि दी गई। प्रत्यारोपण और आसपास के ऊतक को सीएफयू गिनती के लिए काटा और संसाधित किया गया था (चित्रा 3)। संक्रमित नियंत्रण, मोनोथेरेपी, या संयोजन चिकित्सा समूहों के बीच सीएफयू में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया।

Figure 1
चित्र 1: उच्च खुराक एस ऑरियस ज़ेन 36 इनोकुलम में घाव टूटना। रीढ़ प्रत्यारोपण संक्रमण के दौरान एस ऑरियस एक्सएन 36 के साथ टीका लगाए गए चूहों की पृष्ठीय त्वचा की छवियां। (ए) माउस को 1 x 103 सीएफयू, और बरकरार पृष्ठीय त्वचा के साथ टीका लगाया गया। (बी) माउस को 1 x 104 सीएफयू के साथ टीका लगाया गया, और काफी घाव टूटने के सबूत। Dworsky et al.25 से अनुमति के साथ अनुकूलित और पुनर्मुद्रित चित्र कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: विवो बायोल्यूमिनेसेंस में उपयोग करके बैक्टीरिया के बोझ का माप। एक स्थिर प्लास्मिड (Xen36) में बायोल्यूमिनेसेंट निर्माण रखने वाले एस ऑरियस के 1 x 103 सीएफयू को स्टेनलेस-स्टील इम्प्लांट की उपस्थिति में चूहों (एन = 10 चूहे प्रति समूह) की एल 4 स्पिनस प्रक्रिया में टीका लगाया गया था। (ए) नीचे दिए गए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के प्रवाह आरेख के साथ विवो एस ऑरियस बायोल्यूमिनेसेंस (औसत अधिकतम प्रवाह [फोटॉन/एस/सेमी2/एसआर] ± सेम [लघुगणकीय पैमाने]) द्वारा मापा गया बैक्टीरियल गिनती। पीओडी 7 पर, एंटीबायोटिक प्रशासन वैनकोमाइसिन के साथ शुरू हुआ, वैनकोमाइसिन और रिफैम्पिन का संयोजन या एक बाँझ खारा नियंत्रण। पीओडी 14 पर एंटीबायोटिक देना बंद कर दिया गया था। पीओडी 35 पर, चूहों की बलि दी गई और प्रत्यारोपण और आसपास के ऊतक से सीएफयू को मापा गया। (बी) विवो एस ऑरियस बायोल्यूमिनेसेंस में प्रतिनिधि चूहों की ग्रेस्केल छवि के शीर्ष पर एक रंग पैमाने पर रखा गया है। हू एट अल.25 से अनुमति के साथ अनुकूलित और पुनर्मुद्रित चित्र कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सीएफयू गणना का उपयोग करके बैक्टीरिया के बोझ की पुष्टि। पीओडी 35 में, चूहों की बलि दी गई, पिन को सोनिकेटेड किया गया, ऊतक को होमोजिनाइज किया गया, और बैक्टीरिया को सुसंस्कृत और गिना गया। हू एट अल.25 की अनुमति से अनुकूलित और पुनर्मुद्रित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

रीढ़ की हड्डी में प्रत्यारोपण से संबंधित संक्रमण 1,2,3,4,5 रोगियों के लिए खराब परिणाम दिखाते हैं। शरीर के कई अन्य क्षेत्रों के विपरीत, अस्थिरता और न्यूरोलॉजिकल समझौता के जोखिम के कारण रीढ़ में संक्रमित हार्डवेयर को अक्सर हटाया नहीं जा सकता है। प्रणालीगत एंटीबायोटिक चिकित्सा के लिए प्रतिरोधी बायोफिल्म बैक्टीरिया की स्थापना में इस अनूठी चुनौती के लिए उपचारके लिए नए दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। एसआईआई के लिए नए उपचार में पिछला शोध महंगे, अक्षम पशु मॉडल द्वारा सीमित किया गया है। इन संक्रमणों का बेहतर अध्ययन करने और संभावित उपचारों की प्रभावकारिता का कुशलतापूर्वक आकलन करने के लिए, हमने विवो बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग में उपयोग करके एसआईआई का एक गैर-आक्रामक अनुदैर्ध्य माउस मॉडल विकसित किया।

इंस्ट्रूमेंटेड स्पाइन संक्रमण के पूर्व पशु मॉडल को परिणामों का मूल्यांकन करने के लिए पूर्व विवो ऊतक विश्लेषण की आवश्यकता होती है, जिसमें बड़े समूहों की आवश्यकता होती है और समय13,14,26 के साथ संक्रमण की निगरानी करने में असमर्थ थे। इसके विपरीत, इस पेपर में प्रस्तुत एसआईआई का माउस मॉडल16,17,18 समय के साथ बैक्टीरिया के बोझ की मज़बूती से निगरानी करने के लिए बीएलआई का लाभ उठाता है। यह नया दृष्टिकोण जांचकर्ताओं को एंटीबायोटिकदवाओं, कोटिंग्स, या प्रतिरक्षा मॉड्यूलेशन के लिए बैक्टीरिया और मेजबान की प्रतिक्रिया का आकलन करने में सक्षम बनाता है।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों में शामिल हैं: Xen36 S. Aureus की उपयुक्त तैयारी और एकल इनोकुलम 1 x 103 CFUs / 2 μL का अनुमान; सटीक सर्जिकल आरोपण, टीकाकरण और समापन; विवो बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग में; और सीएफयू गणना का उपयोग करके बैक्टीरिया के बोझ की पुष्टि।

मॉडल में संशोधनों में वैकल्पिक बायोल्यूमिनेसेंट बैक्टीरियल उपभेद, दीर्घकालिक समय बिंदु, या अन्य प्रकार के आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों के एकीकरण का उपयोग शामिल हो सकता है, जैसे कि माइलॉयड कोशिकाओं (लिस-ईजीएफपी) में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए विवो फ्लोरेसेंस इमेजिंग20 के साथ न्यूट्रोफिल घुसपैठ को समकालीन रूप से मापने के लिए।. कशेरुक ऑस्टियोलिसिस, डिस्क अपघटन, नरम ऊतक संक्रमण और प्रत्यारोपण बायोफिल्म संक्रमण जैसी प्रक्रियाओं को संबोधित करने के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित लोगों के पूरक के लिए अतिरिक्त पद्धतियों का उपयोग किया जा सकता है। इन प्रक्रियाओं में मात्रात्मक परिणाम प्रदान करने वाली तकनीकों में शामिल हो सकते हैं, लेकिन इन तक सीमित नहीं हैं: माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग, वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर, सीरोलॉजी, हिस्टोलॉजी, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, और / या चर दबाव स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी।

इस मॉडल की कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, रीढ़ की सर्जरी का मॉडल नैदानिक अभ्यास की तुलना में एक सकल सरलीकरण है। उच्च जोखिम वाले रीढ़ की सर्जरी के रोगियों के लिए विशिष्ट व्यापक डीकंप्रेशन और बहुस्तरीय संलयन सर्जरी के विपरीत, मॉडल सर्जरी में एकल स्टेनलेस-स्टील प्रत्यारोपण के साथ न्यूनतम हड्डी शोधन शामिल है। चूंकि नैदानिक रीढ़ प्रत्यारोपण में कई अलग-अलग सामग्री होती है, इसलिए इनमें बैक्टीरिया के संक्रमण और बायोफिल्म गठन के लिए अलग-अलग प्रतिक्रियाएं हो सकती हैं। इसके अलावा, सभी पशु मॉडल के साथ, चूहों के संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिक्रिया मनुष्यों की तुलना में अलग है।

भविष्य में, इस मॉडल का उपयोग वैनकोमाइसिन पाउडर, एंटीबायोटिक लोडेड बीड्स या लेपित प्रत्यारोपण सहित अन्य एंटीबायोटिक वितरण के तौर-तरीकों के साथ एसआईआई के उपचार का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, इस मॉडल का उपयोग एसआईआई के लिए मेजबान प्रतिक्रिया के यांत्रिक आधार का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इन प्रयोगों के लिए प्रमुख वित्त पोषण स्रोतों के रूप में बाल चिकित्सा आर्थोपेडिक सोसाइटी ऑफ नॉर्थ अमेरिका बायोमेट स्पाइन ग्रांट और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ क्लिनिकल एंड ट्रांसलेशनल साइंस इंस्टीट्यूट केएल 2 ग्रांट और एचएच ली सर्जिकल रिसर्च ग्रांट दोनों की प्राप्ति को स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analytical Balance ME104 Mettler Toledo 30029067 120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base
BD Bacto Tryptic Soy Broth Becton Dickinson (BD) BD 211825 BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer Thermo Scientific 840-208300 Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord
Bioshield 720+ swinging bucket rotor Thermo Scientific 75003183 Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm
Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator) Branson Ultrasonics CPX952217R *similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal
Bullet Blender Storm Homogenizer Next Advance BBY24M The Bullet Blender Storm is the most powerful member of the Bullet Blender family. Homogenize up to 24 of your toughest samples (mouse femur, skin, cartilage, tumor, etc.) in just minutes. Air cooling™ minimizes sample heat up. Uses 1.5ml screw-cap RINO® tubes or snap-cap Eppendorf® Safe-lock™ tubes.
Germinator 500 Electron Microscopy Sciences 66118-10 The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be
used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for
traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine
sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been
designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211.
Heracell 150i CO2 Incubator Thermo Scientific 51026282 Single 150L
IVIS Lumina X5 Imaging System Perkin Elmer CLS148590 The IVIS Lumina X5 high-throughput 2D optical imaging system combines high-sensitivity bioluminescence and fluorescence with high-resolution x-ray into a compact system that fits on your benchtop. With an expanded 5 mouse field of view for 2D optical imaging plus our unique line of accessories to accelerate setup and labeling, it has never been easier or faster to get robust data—and answers—on anatomical and molecular aspects of disease.
MAXQ 4450 Digtial Incubating Bench Shaker Thermo Scientific SHKE4450 Shaker, Incubated; Thermo Scientific; Digital; MaxQ 4450; Speed 15 to 500rpm +/-1rpm; 5 deg. C above ambient to 80 deg. C; 120V 50/60Hz
PBS, Phosphate Buffered Saline Fisher Bioreagents BP24384 PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4
Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated Thermo Scientific 75002436 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid
SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge Thermo Scientific 75004261 Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz
Staphylococcus aureus - Xen36 Perkin Elmer 119243 Staphylococcus aureus - Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid.
TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V Heidolph Tuttnauer 23210401 Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls
Tween 80 Fisher Bioreagents BP338-500 Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction
Vortex mixer VX-200 Labnet Internation S0200 120V touch or continuous mixer, 230V: 0 - 2,850 rpm,120V: 0 - 3,400 rpm
0.9% Sodium Chloride Pfizer Injectables/Hospira 00409-4888-10 0.9% Sodium Chloride Injection, USP

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References

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स्पाइनल इम्प्लांट संक्रमण माउस मॉडल विवो में चिकित्सीय उपचार रणनीतियों पश्चवर्ती-दृष्टिकोण स्पाइनल सर्जरी बायोल्यूमिनेसेंट स्ट्रेन स्टेफिलोकोकस ऑरियस ज़ेन 36 बैक्टीरिया बायोलुमिनेसेंस इमेजिंग बैक्टीरियल बोझ पेरी-इम्प्लांट ऊतक कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) पशु मॉडल

Erratum

Formal Correction: Erratum: In vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection
Posted by JoVE Editors on 05/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: In vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection. The Authors section was updated from:

Benjamin V. Kelley1
Stephen D. Zoller1
Danielle Greig1
Kellyn Hori1
Nicolas Cevallos1
Chad Ishmael1
Peter Hsiue1
Rishi Trikha1
Troy Sekimura2
Thomas Olson2
Ameen Chaudry2
Michael M. Le2
Anthony A. Scaduto1
Kevin P. Francis1
Nicholas M. Bernthal1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles
2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

to:

Benjamin V. Kelley1
Christopher Hamad1
Stephen D. Zoller1
Danielle Greig1
Zeinab Mamouei1
Rene Chun1
Kellyn Hori1
Nicolas Cevallos1
Chad Ishmael1
Peter Hsiue1
Rishi Trikha1
Troy Sekimura2
Brandon Gettleman3
Autreen Golzar2
Adrian Lin2
Thomas Olson2
Ameen Chaudry2
Michael M. Le2
Anthony A. Scaduto1
Kevin P. Francis1
Nicholas M. Bernthal1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles
2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles
3University of South Carolina School of Medicine, University of South Carolina

स्पाइनल इम्प्लांट संक्रमण के विवो माउस मॉडल में।
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Kelley, B. V., Hamad, C., Zoller, S. … More

Kelley, B. V., Hamad, C., Zoller, S. D., Greig, D., Mamouei, Z., Chun, R., Hori, K., Cevallos, N., Ishmael, C., Hsiue, P., Trikha, R., Sekimura, T., Gettleman, B., Golzar, A., Lin, A., Olson, T., Chaudry, A., Le, M. M., Scaduto, A. A., Francis, K. P., Bernthal, N. M. In Vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection. J. Vis. Exp. (160), e60560, doi:10.3791/60560 (2020).

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