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Medicine

In-vivo-Mausmodell für Wirbelsäulenimplantatinfektionen

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/60560
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 2, 2, 2, 2, 2, 1, 1, 1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles, 2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 3University of South Carolina School of Medicine, University of South Carolina

ERRATUM NOTICE

Summary

Das Protokoll beschreibt ein neuartiges In-vivo-Mausmodell für Wirbelsäulenimplantatinfektionen, bei dem ein K-Draht-Implantat aus Edelstahl mit biolumineszierendem Staphylococcus aureus Xen36 infiziert ist. Die bakterielle Belastung wird longitudinal mit biolumineszierender Bildgebung überwacht und mit koloniebildenden Einheitenzählungen nach Euthanasie bestätigt.

Abstract

Infektionen mit Wirbelsäulenimplantaten deuten auf schlechte Ergebnisse hin, da die Diagnose schwierig ist und die chirurgische Eradikation im Widerspruch zur mechanischen Stabilität der Wirbelsäule steht. Der Zweck dieser Methode ist es, ein neuartiges Mausmodell für spinale Implantatinfektionen (SII) zu beschreiben, das entwickelt wurde, um ein kostengünstiges, schnelles und genaues In-vivo-Werkzeug zum Testen potenzieller Therapeutika und Behandlungsstrategien für Wirbelsäulenimplantatinfektionen bereitzustellen.

In dieser Methode stellen wir ein Modell der posterioren Wirbelsäulenchirurgie vor, bei dem ein K-Draht aus Edelstahl in den Dornfortsatz L4 von 12 Wochen alten C57BL/6J-Wildtyp-Mäusen eingedrungen und mit 1 x 103 KBE eines biolumineszierenden Stammes des Staphylococcus aureus Xen36-Bakteriums inokuliert wird. Die Mäuse werden dann an den postoperativen Tagen 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 und 35 in vivo longitudinal für Biolumineszenz abgebildet. Biolumineszenz-Bildgebungssignale (BLI) aus einem standardisierten Sichtfeld werden quantifiziert, um die bakterielle Belastung in vivo zu messen.

Um Bakterien zu quantifizieren, die an Implantaten und periimplantärem Gewebe haften, werden Mäuse euthanasiert und das Implantat und das umgebende Weichgewebe entnommen. Die Bakterien werden durch Beschallung vom Implantat gelöst, über Nacht kultiviert und dann werden koloniebildende Einheiten (KBE) gezählt. Zu den Ergebnissen, die mit dieser Methode gewonnen werden, gehören longitudinale Bakterienzahlen, gemessen durch in vivo S. aureus-Biolumineszenz (mittlerer maximaler Fluss) und KBE-Zählungen nach Euthanasie.

Während frühere Tiermodelle für instrumentierte Wirbelsäuleninfektionen eine invasive Ex-vivo-Gewebeanalyse beinhalteten, nutzt das in dieser Arbeit vorgestellte Mausmodell der SII die nicht-invasive, optische Echtzeit-In-vivo-Bildgebung von biolumineszierenden Bakterien, um statische Gewebeuntersuchungen zu ersetzen. Die Anwendungen des Modells sind breit gefächert und können die Verwendung alternativer biolumineszierender Bakterienstämme, die Einbeziehung anderer Arten von gentechnisch veränderten Mäusen zur gleichzeitigen Untersuchung der Immunantwort des Wirts und die Bewertung aktueller oder die Untersuchung neuer diagnostischer und therapeutischer Modalitäten wie Antibiotika oder Implantatbeschichtungen umfassen.

Introduction

Das Ziel dieser Methode ist es, ein neuartiges Mausmodell der spinalen Implantatinfektion (SII) zu beschreiben. Dieses Modell wurde entwickelt, um ein kostengünstiges und genaues Werkzeug zur flexiblen Bewertung der Wirkung von Wirts-, Erreger- und/oder Implantatvariablen in vivo bereitzustellen. Die Erprobung potenzieller Therapeutika und Behandlungsstrategien für Wirbelsäulenimplantatinfektionen in diesem Modell zielt darauf ab, die Forschungsentwicklung vor der Anwendung in größeren Tiermodellen und klinischen Studien zu steuern.

Implantatbedingte Infektionen nach Wirbelsäulenoperationen sind eine verheerende Komplikation und treten leider bei etwa 3–8 % der Patienten auf, die sich einer elektiven Wirbelsäulenoperation unterziehen 1,2,3,4,5 und bis zu 65 % der Patienten, die sich einer Mehrebenen- oder Revisionsoperation unterziehen 6. Die Behandlung von Wirbelsäulenimplantatinfektionen erfordert oft mehrere Krankenhausaufenthalte, mehrere Operationen und eine längere Antibiotikatherapie. SIIs deuten auf schlechte Patientenergebnisse hin, einschließlich neurologischer Beeinträchtigungen, Behinderungen und eines erhöhten Mortalitätsrisikos. Die Behandlung von SII ist extrem teuer und kostet mehr als 900.000 US-Dollar pro Patient7.

Staphylococcus aureus ist der häufigste virulente Erreger von SII 8,9,10,11. Bakterien können die Hardware direkt während der Operation, durch die Wunde während der postoperativen Phase oder später durch hämatogene Ausbreitung aussäen. In Gegenwart von Metallimplantaten bildet S. aureus einen Biofilm, der die Bakterien vor einer Antibiotikatherapie und Immunzellen schützt. Während die Entfernung infizierter Hardware dazu beitragen kann, eine Infektion effektiv auszurotten, ist dies in der Wirbelsäule häufig nicht möglich, ohne eine Destabilisierung zu verursachen und eine neurologische Beeinträchtigung zu riskieren12.

Da infizierte Hardware nicht explantiert werden kann, sind neue Ansätze zur Vorbeugung, Erkennung und Behandlung von SII erforderlich. In der Vergangenheit gab es nur begrenzte Tiermodelle für SII, um die Sicherheit und Wirksamkeit neuartiger Therapien effizient zu bewerten. Bisherige Tiermodelle der SII erfordern eine große Anzahl von Tieren und die Erfassung von Datenpunkten, die Euthanasie erfordern, einschließlich Koloniezählung, Histologie und Kultur13,14,15. Da es keine longitudinale In-vivo-Überwachung gibt, liefern diese Modelle nur einen Datenpunkt pro Tier und sind daher teuer und ineffizient.

Frühere Arbeiten zur Untersuchung eines Mausmodells für Knieendoprothetikinfektionen erwiesen den Wert und die Genauigkeit der nicht-invasiven optischen In-vivo-Bildgebung zur longitudinalen Überwachung der Infektionslast16. Der Nachweis von Biolumineszenz ermöglicht es, die bakterielle Belastung über einen longitudinalen Zeitverlauf in einem einzelnen Tier human, genau und effizient zu quantifizieren. Darüber hinaus haben frühere Studien eine hohe Korrelation zwischen In-vivo-Biolumineszenz und an Implantaten haftenden KBE gezeigt17. Die Fähigkeit, Infektionen im Laufe der Zeit zu verfolgen, hat zu einem nuancierteren Verständnis von implantatbedingten Infektionen geführt. Darüber hinaus hat die Überwachung der longitudinalen Infektion auf diese Weise eine genaue Bewertung der Wirksamkeit der Antibiotikatherapie und neuartiger antimikrobieller Mittel ermöglicht16,17,18.

Mit Hilfe dieser Werkzeuge haben wir ein Modell der postoperativen Wirbelsäulenimplantatinfektion entwickelt und validiert. In der vorgestellten Methode verwenden wir ein Inokulum von biolumineszierendem S. aureus Xen36, um ein in vivo Mausmodell der SII zu etablieren, um die bakterielle Belastung longitudinal zu überwachen16,17,18. Dieses neuartige Modell bietet ein wertvolles Werkzeug, um potenzielle Erkennungs-, Präventions- und Behandlungsstrategien für SII effizient zu testen, bevor sie in größeren Tiermodellen und klinischen Studien angewendet werden.

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Protocol

Alle Tiere wurden in strikter Übereinstimmung mit der guten Tierpraxis behandelt, wie sie in den Bundesvorschriften definiert ist, wie sie im Tierschutzgesetz (AWA), dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren von 1996, der PHS-Richtlinie für die humane Pflege und Verwendung von Labortieren sowie in den Richtlinien und Verfahren der Einrichtung festgelegt sind, wie sie im Schulungshandbuch für die Pflege und Verwendung von Tieren festgelegt sind. und alle Tierarbeiten wurden vom Animal Research Committee (ARC) des Kanzlers der University of California in Los Angeles genehmigt.

1. Wahl des biolumineszierenden Stamms S. aureus

  1. Verwenden Sie den biolumineszierenden S. aureus-Stamm Xen36 als Inokulum von Interesse.
    HINWEIS: Dieser Stamm wurde vom Elternstamm S. aureus ATCC-49525 abgeleitet, einem klinischen Isolat eines septischen Patienten. S. aureus Xen36 nutzt auf einzigartige Weise ein Lux-ABCDE-Operon, das optimiert und in das native Plasmid des Wirts integriert ist. 19 Infolgedessen ist der Xen36-Stamm in der Lage, ein blau-grünes biolumineszierendes Licht mit einer Spitzenwellenlänge von 490 nm zu erzeugen. Dieses Emissionssignal wird nur von lebenden stoffwechselaktiven Bakterien erzeugt.

2. Zubereitung von S. aureus zur Inokulation

  1. Zugabe von 200 μg/ml Kanamycin zu Luria-Bouillon plus 1,5%igem Agar, um S. aureus Xen36 aus potenziellen Verunreinigungen zu isolieren, wobei das Kanamycin-Resistenzgen, das mit dem Lux-Operon 19 verbunden ist, verwendet wird.
  2. S. aureus Xen36-Bakterien auf tryptische Soja-Agarplatten (tryptische Sojabrühe [TSB] plus 1,5 % Agar) auftragen und bei 37 °C für 12-16 h inkubieren.
  3. Einzelne Kolonien von S. aureus Xen36 isolieren und einzeln in TSB für 12-16 h bei 37 °C in einem Schüttelinkubator (200 U/min) kultivieren.
  4. Die resultierende Kultur wird im Verhältnis 1:50 verdünnt.
  5. Weitere 2 h bei 37 °C kultivieren, um Bakterien in der mittleren logarithmischen Phase zu isolieren.
  6. Pelletieren, resuspendieren und waschen Sie Bakterien dreimal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
  7. Messen Sie die Absorption bei 600 nm. Der ideale OD600 liegt zwischen 0,700 und 0,750, was 4x105 KBE/ml entspricht. Führen Sie serielle Verdünnungen durch, um das gewünschte bakterielle Inokulum (1 x 103 KBE/2 μl) zu erreichen.
    HINWEIS: Die optimale Konzentration von Xen36 für die Etablierung einer chronischen Infektion betrug 1 x 103 KBE. Eine niedrigere Dosierung der Bakterien wurde vom Immunsystem des Wirts beseitigt und eine höhere Dosierung führte zu einem Wundabbau. Der Wundabbau unterscheidet nicht zwischen einer tiefen Implantatinfektion und einer oberflächlichen Wundinfektion und wird daher in diesem Modell vermieden (Abbildung 1)20.

3. Mäuse

  1. Verwenden Sie 12 Wochen alte männliche C57BL/6J-Wildtyp-Mäuse.
  2. Hausmäuse in Käfigen mit maximal 4 auf einmal.
  3. Halten Sie jederzeit Wasser bereit. Halten Sie einen 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus ein und führen Sie während der Dunkelphase des Zyklus keine Experimente durch.
  4. Verwenden Sie luzernefreies Futter für die Fütterung, da es zu Interferenzen mit der Fluoreszenzsignalisierung kommen kann.
  5. Lassen Sie die Mäuse täglich von Forschungs- oder Veterinärpersonal untersuchen, um das Wohlergehen der Tiere während des gesamten Versuchs zu gewährleisten.

4. Chirurgische Eingriffe bei Mäusen

  1. Induzieren Sie eine Anästhesie, indem Sie Mäuse für etwa 5 Minuten in eine Isofluran-Kammer (2 %) legen. Bestätigen Sie eine angemessene Anästhesietiefe, indem Sie die Atmung so überwachen, dass sie rhythmisch und langsamer bleibt als im Wachzustand und sich nicht als Reaktion auf schädliche Reize (z. B. chirurgische Manipulation, Zehenkneifen) verändert.
  2. Bringen Sie betäubte Mäuse in eine Vorbereitungsstation und entfernen Sie die Haare vom Kreuzbein bis zur oberen Brustwirbelsäule mit einer Nagetierschere.
  3. Reinigen und sterilisieren Sie die Haut mit dreifachen Waschungen mit abwechselnder Betadinlösung und Isopropylalkohol.
  4. Übertragen Sie anästhesierte und sterilisierte Mäuse in Bauchlage auf ein steriles Operationsbett unter Aufrechterhaltung der Anästhesie mit Verabreichung von inhalativem Isofluran (2%) über den Nasenkegel.
  5. Beugen Sie die Hüften maximal und identifizieren Sie die Position des Knies auf Höhe der Wirbelsäule, um sich dem Wirbelkörper der Lendenwirbelsäule 4 anzunähern.
  6. Machen Sie einen 2 cm langen Längsschnitt durch die Haut mit einem chirurgischen Skalpell mit 15 Klingen.
  7. Abtasten Sie die Dornfortsätze, um die Mittellinie zu bestätigen, und setzen Sie den Schnitt bis zum Knochen fort.
  8. Subperiostal auf der rechten Seite des Dornfortsatzes L4 sezieren, der sich lateral zum Querfortsatz erstreckt.
  9. Eine resorbierbare geflochtene Naht der Größe 5-0 Cephalad und Caudad durch die Faszie an den L4-Körper führen und offen lassen, um einen zukünftigen Verschluss vorzubereiten.
  10. Mit einer 25-G-Wirbelsäulennadel den Dornfortsatz von L4 mit einer 25-G-Wirbelsäulennadel einreiben und ein 1 cm langes, "L-förmiges" chirurgisches Edelstahlimplantat mit 0,1 mm Durchmesser entlang der Lamina einsetzen, wobei der lange Arm auf Cephalad liegt.
  11. Beimpfen Sie das Implantat mit 1 x 103 KBE/2 μl biolumineszierendem S. aureus Xen36 und achten Sie darauf, dass die gesamte Lösung mit dem Implantat in Kontakt kommt.
  12. Warten Sie ca. 10 Sekunden, bevor Sie die zuvor durchgeführte resorbierbare Naht nach der Inokulation abbinden, um sicherzustellen, dass das Inokulum auf dem Implantat eingeschlossen ist.
  13. Schließen Sie die Haut laufend mit resorbierbarem Nahtmaterial.
  14. Verabreichen Sie Schmerzmittel durch subkutane Injektion von Buprenorphin (0,1 mg/kg) sofort nach und danach alle 12 Stunden für 3 Tage.
  15. Erholen Sie Mäuse auf einem Heizkissen und überwachen Sie sie, um zur normalen Aktivität zurückzukehren.
  16. Postoperative Röntgenaufnahmen anfertigen, um die richtige Platzierung des Implantats zu bestätigen.

5. Longitudinale In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung zur Messung der Bakterienbelastung

  1. Mäuse mit inhalativem Isofluran anästhesieren (2%). Bestätigen Sie eine angemessene Anästhesietiefe, indem Sie die Atmung so überwachen, dass sie rhythmisch und langsamer bleibt als im Wachzustand und sich nicht als Reaktion auf schädliche Reize (z. B. chirurgische Manipulation, Zehenkneifen) verändert.
  2. Entfernen Sie die Haare vom Kreuzbein bis zur oberen Brustwirbelsäule mit einer Nagetierschere.
  3. Laden Sie Mäuse in das Sichtfeld der biolumineszierenden Bildgebungsplattform, um In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) durchzuführen19.
  4. Erfassen Sie biolumineszierende Signale über eine Aufnahmezeit von 5 Minuten. Verwende große Binning-Einstellungen mit einem Sichtfeld von 15 cm (B).
  5. Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.4 an den postoperativen Tagen 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 und 35 (oder an anderen Tagen, die auf einem bestimmten Versuchsdesign basieren), um die Bakterienlast zu überwachen.
  6. Präsentieren Sie BLI-Daten über Farbskala und Überlagerung auf einem Graustufenfoto. Isolieren Sie eine standardmäßige eiförmige Region of Interest (ROI) mit BLI-Software, um BLI im Gesamtfluss (Photonen pro Sekunde) oder im mittleren maximalen Fluss (Photonen/Sekunde/Zentimeter2/Steradian) zu quantifizieren.

6. Quantifizierung von Bakterien, die an Implantaten und umgebendem Gewebe haften

  1. Euthanasieren Sie Mäuse am POD 35 oder zu einem alternativen postoperativen Zeitpunkt Ihrer Wahl mit Kohlendioxid-Exposition gemäß den AVMA-Richtlinien. Euthanasie mit sekundärer Zervixluxation bestätigen.
  2. Sterilisieren Sie die Rückenhaut gemäß Schritt 4.3 und positionieren Sie die Maus in Bauchlage auf einem sterilen Operationsfeld.
  3. Schneiden Sie den vorherigen Schnitt mit einem chirurgischen Skalpell mit 15 Klingen scharf ein.
  4. Verwenden Sie eine sterile Schere, um den Dornfortsatz L4 stumpf zu präparieren und das chirurgische Implantat zu identifizieren.
  5. Verwenden Sie einen Nadeltreiber, um das Implantat vorsichtig zu drehen und aus seiner Position im Dornfortsatz L4 zu entfernen.
  6. Entnehmen Sie mit einer sterilen Pinzette und Schere ca. 0,1 g Dornfortsatzknochen und Weichgewebe unmittelbar um das chirurgische Implantat herum und geben Sie 1 ml PBS in ein kleines konisches Nashornröhrchen mit 4 scharfen Homogenisierungskügelchen.
  7. Erfassen Sie das Gewicht des Weichgewebes, indem Sie das konische Röhrchen vor und nach der Ernte wiegen.
  8. Platzieren Sie das Implantat in 0,5 ml 0,3 % Tween-80 in TSB und beschallen Sie es 15 Minuten lang.
  9. Die resultierende Implantatsuspension wird 2 min vortex und über Nacht 12-16 h kultiviert.
  10. Homogenisieren Sie das Weichgewebe und die Dornfortsätze, die zuvor in 1 ml PBS um das Implantat herum platziert wurden, mit einem Homogenisator.
  11. Die resultierende Weichteilsuspension wird 5 min vortex und über Nacht 12-16 h kultiviert.
  12. Zählen Sie nach der Kultur über Nacht KBE aus dem Implantat bzw. aus dem umliegenden Gewebe. Geben Sie den Wert als Gesamtmenge KBE/g für Weichgewebe und KBE/ml für beschallte Implantate an.

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Representative Results

Das hier vorgestellte Verfahren wurde verwendet, um die Wirksamkeit von Antibiotikatherapien in einem in vivo Mausmodell der SII zu bewerten. Insbesondere wurde die Wirksamkeit einer kombinierten Antibiotikatherapie mit Vancomycin und Rifampicin mit einer Vancomycin-Monotherapie und unbehandelten infizierten Kontrollen verglichen.

Vor der Operation wurden die Mäuse entweder einer Kombinationstherapie, einer Monotherapie oder einer infizierten Kontrolle zugeteilt. Eine statistische Poweranalyse wurde durchgeführt, um die Stichprobengröße zu berechnen. Zur Bestimmung des Stichprobenumfangs wurden die erwarteten Mittelwerte des mittleren maximalen Flusses 1 x 10 5 ± 3,2 x 10 4 und1,4 x 105 verwendet, die in jeder Gruppe als N=10 berechnet wurden. Die Mäuse wurden chirurgisch implantiert, mit S. aureus Xen36 inokuliert und auf In-vivo-Biolumineszenz von S. aureus an POD 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 und 35 gemessen. An POD 35 wurden Mäuse getötet und KBE für implantatadhärente und umgebende Gewebebakterien quantifiziert.

Mäuse in der Monotherapie-Gruppe erhielten eine therapeutische Dosis Vancomycin (110 mg/kg zweimal täglich), die subkutan verabreicht wurde. Diese Dosis wurde so gewählt, dass sie sich dem Bereich unter der Kurve für die typische Exposition des Menschen gegenüber Vancomycin21,22,23 annähert. Die Mäuse in der Kombinationstherapiegruppe erhielten eine therapeutische subkutane Dosis von Vancomycin (110 mg/kg zweimal täglich) und Rifampicin (25 mg/kg täglich)24. Mäuse in der infizierten Kontrollgruppe erhielten Scheininjektionen mit steriler Kochsalzlösung. Die Behandlung wurde für alle Gruppen vom 7. bis zum 14. postoperativen Tag durchgeführt.

Wirkung einer Antibiotikatherapie auf BLI
Infizierte Kontrollmäuse wiesen BLI-Signale auf, die auf POD 10 ihren Höhepunkt erreichten und bis zum Opfer über 1,0 x 105 Photonen/s/cm 2/sr blieben, wodurch ein chronischer SII erfolgreich modelliert wurde (Abbildung 2). Mäuse, die mit Vancomycin-Monotherapie behandelt wurden, hatten im Vergleich zur infizierten Kontrollgruppe ein signifikant niedrigeres BLI-Signal mit einer 2-fachen Reduktion von POD 10–21 (p<0,03). Nach POD 21 gab es keinen signifikanten Unterschied im BLI zwischen Monotherapie und infizierten Kontrollgruppen. Mäuse, die mit einer Vancomycin-Rifampicin-Kombinationstherapie behandelt wurden, hatten ein noch niedrigeres BLI-Signal, das 20-fach niedriger war als die infizierte Kontrolle auf POD 10. Eine signifikante Reduktion hielt bis POD 28 an (p<0,01). Nach POD 28 gab es keinen signifikanten Unterschied im BLI zwischen den Gruppen. Es gab keinen signifikanten Unterschied im BLI zwischen den drei Gruppen bei der abschließenden Bildgebung auf POD35.

KBE aus Implantaten und umgebendem Gewebe
Mäuse wurden am 35. POD geopfert. Implantate und umgebendes Gewebe wurden entnommen und für die KBE-Zählung aufbereitet (Abbildung 3). Bei KBE wurde kein signifikanter Unterschied zwischen infizierten Kontroll-, Monotherapie- oder Kombinationstherapiegruppen beobachtet.

Figure 1
Abbildung 1: Wundaufschlüsselung im hochdosierten S. aureus Xen36-Inokulum. Bilder der Rückenhaut von Mäusen, die während einer Wirbelsäulenimplantatinfektion mit S. aureus Xen36 geimpft wurden. (A) Maus, die mit 1 x 103 KBE und intakter Rückenhaut inokuliert wurde. (B) Maus, die mit 1 x 104 KBE beimpft wurde, und Nachweis einer beträchtlichen Wundzerkleinerung. Abbildung angepasst und nachgedruckt mit freundlicher Genehmigung von Dworsky et al.25Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Messung der Bakterienbelastung mittels In-vivo-Biolumineszenz. 1 x 103 KBE S. aureus, die das biolumineszierende Konstrukt in einem stabilen Plasmid (Xen36) besaßen, wurden in Gegenwart eines Edelstahlimplantats in den Dornfortsatz L4 von Mäusen (n = 10 Mäuse pro Gruppe) inokuliert. (A) Bakterienzahl, gemessen durch In-vivo-Biolumineszenz von S. aureus (mittlerer maximaler Fluss [Photonen/s/cm2/sr] ± SEM [logarithmische Skala]), mit einem Flussdiagramm des nachstehenden Versuchsprotokolls. Am POD 7 begann die Antibiotikagabe mit Vancomycin, einer Kombination aus Vancomycin und Rifampicin oder einer sterilen Kochsalzlösung. Die Verabreichung von Antibiotika wurde am POD 14 gestoppt. Am POD 35 wurden Mäuse getötet und KBE aus dem Implantat und dem umgebenden Gewebe gemessen. (B) Repräsentative in vivo S. aureus-Biolumineszenz auf einer Farbskala, die über ein Graustufenbild von Mäusen gelegt wurde. Abbildung angepasst und nachgedruckt mit freundlicher Genehmigung von Hu et al.25Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Bestätigung der Keimbelastung anhand der KBE-Zählung. Bei POD 35 wurden Mäuse getötet, Stifte beschallt, Gewebe homogenisiert und Bakterien kultiviert und gezählt. Abbildung angepasst und nachgedruckt mit freundlicher Genehmigung von Hu et al.25. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Implantatbedingte Infektionen in der Wirbelsäule deuten auf schlechte Ergebnisse für die Patienten hin 1,2,3,4,5. Im Gegensatz zu vielen anderen Bereichen im Körper kann infizierte Hardware in der Wirbelsäule aufgrund des Risikos von Instabilität und neurologischer Beeinträchtigung häufig nicht entfernt werden. Diese einzigartige Herausforderung im Umfeld von Biofilmbakterien, die gegen eine systemische Antibiotikatherapie resistent sind, erfordert neue Behandlungsansätze12. Bisherige Forschung zu neuartigen Behandlungen für SII wurde durch teure, ineffiziente Tiermodelle eingeschränkt. Um diese Infektionen besser untersuchen und die Wirksamkeit potenzieller Behandlungen effizient beurteilen zu können, haben wir ein nicht-invasives longitudinales Mausmodell der SII unter Verwendung von In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung entwickelt.

Frühere Tiermodelle für instrumentierte Wirbelsäuleninfektionen erforderten eine Ex-vivo-Gewebeanalyse, um die Ergebnisse zu bewerten, was große Kohorten erforderte und nicht in der Lage war, die Infektion über einen längeren Zeitraum zu überwachen13,14,26. Im Gegensatz dazu nutzt das in dieser Arbeit vorgestellte Mausmodell der SII BLI, um die bakterielle Belastung über die Zeit zuverlässig zu überwachen16,17,18. Dieser neuartige Ansatz ermöglicht es den Forschern, die Reaktion von Bakterien und des Wirts auf Antibiotika, Beschichtungen oder Immunmodulation zu beurteilen.

Zu den kritischen Schritten des Protokolls gehören: geeignete Vorbereitung von Xen36 S. aureus und Schätzung eines einzelnen Inokulums 1 x 103 KBE/2 μl; präzise chirurgische Implantation, Inokulation und Verschluss; In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung; und Bestätigung der Keimbelastung anhand von KBE-Zählungen.

Modifikationen des Modells können alternative biolumineszierende Bakterienstämme, längerfristige Zeitpunkte oder die Verwendung der Integration anderer Arten von gentechnisch veränderten Mäusen umfassen, wie z. B. solche, die grün fluoreszierendes Protein in myeloischen Zellen exprimieren (Lys-EGFP), um gleichzeitig die Infiltration von Neutrophilen mit In-vivo-Fluoreszenzbildgebung zu messen20. Zusätzliche Methoden können verwendet werden, um die im Protokoll beschriebenen zu ergänzen, um Prozesse wie Wirbelosteolyse, Bandscheibendegeneration, Weichteilinfektion und Implantatbiofilminfektion zu behandeln. Zu den Techniken, die quantitative Ergebnisse in diesen Prozessen liefern, gehören unter anderem: Mikro-Computertomographie, Magnetresonanztomographie, quantitative Echtzeit-PCR, Serologie, Histologie, Immunhistochemie und/oder Rasterelektronenmikroskopie mit variablem Druck.

Dieses Modell weist mehrere Einschränkungen auf. Erstens ist das Modell der Wirbelsäulenchirurgie eine grobe Vereinfachung im Vergleich zur klinischen Praxis. Im Gegensatz zu den für Hochrisikopatienten der Wirbelsäulenchirurgie typischen umfangreichen Dekompressions- und mehrstufigen Fusionsoperationen handelt es sich bei der Modelloperation um eine minimale Knochenresektion mit einem einzigen Edelstahlimplantat. Da klinische Wirbelsäulenimplantate aus mehreren verschiedenen Materialien bestehen, können diese unterschiedlich anfällig für bakterielle Infektionen und Biofilmbildung sein. Darüber hinaus ist die Reaktion des Wirts auf eine Infektion bei Mäusen, wie bei allen Tiermodellen, anders als bei Menschen.

In Zukunft könnte dieses Modell verwendet werden, um die Behandlung von SII mit anderen Antibiotika-Verabreichungsmodalitäten wie Vancomycin-Pulver, antibiotikabeladenen Beads oder beschichteten Implantaten zu bewerten. Darüber hinaus kann dieses Modell verwendet werden, um die mechanistischen Grundlagen der Wirtsantwort auf SII zu untersuchen.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Die Autoren möchten sich für den Erhalt des Biomet Spine Grant der Pediatric Orthopaedic Society of North America und des National Institutes of Health Clinical and Translational Science Institute KL2 sowie des HH Lee Surgical Research Grant als Hauptfinanzierungsquellen für diese Experimente bedanken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analytical Balance ME104 Mettler Toledo 30029067 120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base
BD Bacto Tryptic Soy Broth Becton Dickinson (BD) BD 211825 BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
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PBS, Phosphate Buffered Saline Fisher Bioreagents BP24384 PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4
Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated Thermo Scientific 75002436 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid
SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge Thermo Scientific 75004261 Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz
Staphylococcus aureus - Xen36 Perkin Elmer 119243 Staphylococcus aureus - Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid.
TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V Heidolph Tuttnauer 23210401 Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls
Tween 80 Fisher Bioreagents BP338-500 Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction
Vortex mixer VX-200 Labnet Internation S0200 120V touch or continuous mixer, 230V: 0 - 2,850 rpm,120V: 0 - 3,400 rpm
0.9% Sodium Chloride Pfizer Injectables/Hospira 00409-4888-10 0.9% Sodium Chloride Injection, USP

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References

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Tags

Wirbelsäulenimplantatinfektion Mausmodell In vivo Therapeutika Behandlungsstrategien Rückenchirurgie mit posteriorem Zugang biolumineszierender Stamm Staphylococcus aureus Xen36-Bakterien Biolumineszenz-Bildgebung Bakterienlast periimplantäres Gewebe koloniebildende Einheiten (KBE) Tiermodelle

Erratum

Formal Correction: Erratum: In vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection
Posted by JoVE Editors on 05/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: In vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection. The Authors section was updated from:

Benjamin V. Kelley1
Stephen D. Zoller1
Danielle Greig1
Kellyn Hori1
Nicolas Cevallos1
Chad Ishmael1
Peter Hsiue1
Rishi Trikha1
Troy Sekimura2
Thomas Olson2
Ameen Chaudry2
Michael M. Le2
Anthony A. Scaduto1
Kevin P. Francis1
Nicholas M. Bernthal1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles
2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

to:

Benjamin V. Kelley1
Christopher Hamad1
Stephen D. Zoller1
Danielle Greig1
Zeinab Mamouei1
Rene Chun1
Kellyn Hori1
Nicolas Cevallos1
Chad Ishmael1
Peter Hsiue1
Rishi Trikha1
Troy Sekimura2
Brandon Gettleman3
Autreen Golzar2
Adrian Lin2
Thomas Olson2
Ameen Chaudry2
Michael M. Le2
Anthony A. Scaduto1
Kevin P. Francis1
Nicholas M. Bernthal1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles
2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles
3University of South Carolina School of Medicine, University of South Carolina

In-vivo-Mausmodell für Wirbelsäulenimplantatinfektionen
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Kelley, B. V., Hamad, C., Zoller, S. … More

Kelley, B. V., Hamad, C., Zoller, S. D., Greig, D., Mamouei, Z., Chun, R., Hori, K., Cevallos, N., Ishmael, C., Hsiue, P., Trikha, R., Sekimura, T., Gettleman, B., Golzar, A., Lin, A., Olson, T., Chaudry, A., Le, M. M., Scaduto, A. A., Francis, K. P., Bernthal, N. M. In Vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection. J. Vis. Exp. (160), e60560, doi:10.3791/60560 (2020).

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