Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Мышиная модель инфекции спинальных имплантатов in vivo

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/60560
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 2, 2, 2, 2, 2, 1, 1, 1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles, 2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 3University of South Carolina School of Medicine, University of South Carolina

ERRATUM NOTICE

Summary

Протокол описывает новую мышиную модель инфекции спинальных имплантатов in vivo, в которой имплантат из нержавеющей стали с проволокой инфицируется биолюминесцентным золотистым стафилококком Xen36. Бактериальная нагрузка контролируется в продольном направлении с помощью биолюминесцентной визуализации и подтверждается подсчетом колониеобразующих единиц после эвтаназии.

Abstract

Инфекции спинальных имплантатов предвещают неблагоприятные исходы, поскольку диагностика затруднена, а хирургическая эрадикация противоречит механической стабильности позвоночника. Целью этого метода является описание новой мышиной модели инфекции спинальных имплантатов (SII), которая была создана для предоставления недорогого, быстрого и точного инструмента in vivo для тестирования потенциальных терапевтических средств и стратегий лечения инфекций спинальных имплантатов.

В этом методе мы представляем модель хирургии позвоночника с задним доступом, при которой проволока из нержавеющей стали закрепляется в остистый отросток L4 12-недельных мышей дикого типа C57BL/6J и инокулируется 1 x10,3 КОЕ биолюминесцентного штамма бактерий Staphylococcus aureus Xen36. Затем мышей проводят продольную визуализацию для биолюминесценции in vivo на послеоперационные дни 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 и 35. Сигналы биолюминесцентной визуализации (BLI) из стандартизированного поля зрения количественно оцениваются для измерения бактериальной нагрузки in vivo.

Для количественного определения бактерий, прилипающих к имплантатам и околоимплантным тканям, мышей усыпляют, а имплантат и окружающие мягкие ткани собирают. Бактерии отделяются от имплантата с помощью ультразвука, культивируются в течение ночи, а затем подсчитываются колониеобразующие единицы (КОЕ). Результаты, полученные с помощью этого метода, включают продольный подсчет бактерий, измеренный с помощью биолюминесценции in vivo S. aureus (средний максимальный поток) и подсчет КОЕ после эвтаназии.

В то время как предыдущие модели инструментальной инфекции позвоночника на животных включали инвазивный анализ тканей ex vivo, мышиная модель SII, представленная в этой статье, использует неинвазивную оптическую визуализацию биолюминесцентных бактерий in vivo в реальном времени для замены статического исследования тканей. Область применения модели широка и может включать в себя использование альтернативных биолюминесцентных штаммов бактерий, включение других типов генетически модифицированных мышей для одновременного изучения иммунного ответа хозяина, а также оценку существующих или изучение новых диагностических и терапевтических методов, таких как антибиотики или покрытия имплантатов.

Introduction

Целью данного метода является описание новой мышиной модели инфекции спинальных имплантатов (SII). Эта модель была разработана, чтобы предоставить недорогой и точный инструмент для гибкой оценки влияния переменных хозяина, патогена и/или имплантата in vivo. Тестирование потенциальных терапевтических средств и стратегий лечения инфекций спинномозговых имплантатов в этой модели направлено на руководство развитием исследований перед их применением на более крупных животных моделях и клинических испытаниях.

Инфекция, связанная с имплантатами, после операции на позвоночнике является разрушительным осложнением и, к сожалению, встречается примерно у 3–8% пациентов, перенесших плановую операцию на позвоночнике 1,2,3,4,5, и у 65% пациентов, перенесших многоуровневую или ревизионную операцию6. Лечение инфекций спинномозговых имплантатов часто требует многократных госпитализаций, множественных операций и длительной антибиотикотерапии. СИИ предвещают неблагоприятные исходы для пациентов, включая неврологические нарушения, инвалидность и повышенный риск смертности. Лечение ИИМ является чрезвычайно дорогостоящим и обходится более чем в 900 000 долларов США на одного пациента7.

Золотистый стафилококк является наиболее распространенным вирулентным возбудителем SII 8,9,10,11. Бактерии могут проникать в аппаратное обеспечение непосредственно во время операции, через рану в послеоперационном периоде или позже путем гематогенного распространения. При наличии металлических имплантатов золотистый стафилокк образует биопленку, которая защищает бактерии от антибиотикотерапии и иммунные клетки. Несмотря на то, что удаление инфицированного аппаратного обеспечения может помочь эффективно искоренить инфекцию, это часто неосуществимо в позвоночнике, не вызывая дестабилизации и риска неврологических нарушений12.

При отсутствии эксплейтации зараженного оборудования необходимы новые подходы к профилактике, выявлению и лечению ИИИ. Исторически сложилось так, что существовало ограниченное количество моделей SII на животных для эффективной оценки безопасности и эффективности новых методов лечения. Предыдущие модели SII на животных требовали большого количества животных и сбора данных, требующих эвтаназии, включая подсчет колоний, гистологию и культивирование13,14,15. Из-за отсутствия продольного мониторинга in vivo эти модели предоставляют только одну точку данных для каждого животного и, следовательно, являются дорогостоящими и неэффективными.

Предыдущая работа по изучению мышиной модели инфекции эндопротезирования коленного сустава установила ценность и точность неинвазивной оптической визуализации in vivo для лонгитюдного мониторинга бремени инфекции16. Обнаружение биолюминесценции позволяет гуманно, точно и эффективно количественно определять бактериальную нагрузку в течение длительного периода времени у одного животного. Более того, предыдущие исследования продемонстрировали высокую корреляцию между биолюминесценцией in vivo и КОЕ, адгезивными к имплантатам17. Способность отслеживать инфекцию с течением времени привела к более тонкому пониманию инфекций, связанных с имплантатами. Кроме того, мониторинг лонгитюдной инфекции таким образом позволил точно оценить эффективность антибиотикотерапии и новых противомикробных препаратов16,17,18.

Используя эти инструменты, мы разработали и валидировали модель послеоперационной инфекции спинальных имплантатов. В представленном методе мы используем посевной материал биолюминесцентного S. aureus Xen36 для создания мышиной модели SII in vivo для лонгитюдного мониторинга бактериальной нагрузки16,17,18. Эта новая модель представляет собой ценный инструмент для эффективного тестирования потенциальных стратегий обнаружения, профилактики и лечения SII перед их применением на более крупных животных моделях и клинических испытаниях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Со всеми животными обращались в строгом соответствии с надлежащей ветеринарной практикой, как это определено в федеральных правилах, изложенных в Законе о благополучии животных (AWA), Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных 1996 года, Политике PHS по гуманному уходу и использованию лабораторных животных, а также в политике и процедурах учреждения, изложенных в Учебном руководстве по уходу за животными и их использованию. и все работы на животных были одобрены Комитетом по исследованиям на животных (ARC) канцлера Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе.

1. Выбор биолюминесцентного штамма S. aureus

  1. В качестве инокулята используют биолюминесцентный штамм S. aureus Xen36.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот штамм был получен из родительского штамма S. aureus ATCC-49525, который является клиническим изолятом пациента с сепсисом. Золотистый стафилококк Xen36 уникальным образом использует оперон ABCDE lux, который оптимизирован и интегрирован в нативную плазмиду хозяина. 19 В результате штамм Xen36 способен производить сине-зеленый биолюминесцентный свет с пиковой длиной волны излучения 490 нм. Этот эмиссионный сигнал производится только живыми метаболически активными бактериальными организмами.

2. Подготовка С. золотистый стафилоккаус для инокуляции

  1. Добавьте 200 мкг/мл канамицина в бульон Лурии плюс 1,5% агар, чтобы изолировать S. aureus Xen36 от потенциальных загрязнителей, используя ген резистентности к канамицину, связанный с опероном lux 19.
  2. Бактерии S. aureus Xen36 выложить на пластины триптического соевого агара (триптический соевый бульон [TSB] плюс 1,5% агара) и инкубировать при 37 °C в течение 12-16 ч.
  3. Изолируют одиночные колонии S. aureus Xen36 и индивидуально культивируют в TSB в течение 12-16 ч при 37 °C во встряхивающем инкубаторе (200 об/мин).
  4. Разбавьте полученную культуру в соотношении 1:50.
  5. Культивирование в течение дополнительных 2 ч при 37 °C для выделения бактерий средней логарифмической фазы.
  6. Гранулирование, ресуспендирование и промывка бактерий в фосфатно-солевом буфере (PBS) три раза.
  7. Измерьте абсорбцию при длине волны 600 нм. Идеальный OD600 составляет от 0,700 до 0,750, что соответствует 4x105 КОЕ/мл. Выполняйте последовательные разведения для получения желаемого бактериального посева (1 x 10,3 КОЕ/2 мкл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установлено, что оптимальная концентрация Xen36 для установления хронической инфекции составляет 1 х 103 КОЕ. Более низкая доза бактерий очищалась иммунной системой хозяина, а более высокая доза вызывала разрушение раны. Разрыв раны не делает различий между глубокой инфекцией имплантата и поверхностной раневой инфекцией, поэтому в этой модели его избегают (рис. 1)20.

3. Мыши

  1. Используйте 12-недельных самцов мышей дикого типа C57BL/6J.
  2. Содержать мышей в клетках максимум по 4 штуки за раз.
  3. Всегда держите воду под рукой. Соблюдайте 12-часовой цикл «свет/темнота» и не экспериментируйте во время темной фазы цикла.
  4. Используйте для кормления корм без люцерны из-за потенциальных помех флуоресцентной сигнализации.
  5. Попросите научно-исследовательский или ветеринарный персонал ежедневно осматривать мышей, чтобы убедиться в благополучии животных на протяжении всего эксперимента.

4. Хирургические процедуры на мышах

  1. Индуцируйте анестезию, поместив мышей в камеру с изофлураном (2%) примерно на 5 минут. Подтвердите надлежащую глубину анестезии, контролируя, чтобы дыхание оставалось ритмичным и медленным, чем в бодрствующем состоянии, и не изменялось в ответ на вредные раздражители (например, хирургические манипуляции, защемление пальца ноги).
  2. Перенесите мышей, находящихся под наркозом, на станцию подготовки и удалите шерсть от крестца до верхнего грудного отдела позвоночника с помощью кусачек для грызунов.
  3. Очистите и простерилизуйте кожу тройными смывками чередующимся раствором бетадина и изопропиловым спиртом.
  4. Обезболиванных и стерилизованных мышей в положении лежа на стерильной хирургической кровати с сохранением анестезии с введением ингаляционного изофлурана (2%) через носовой конус.
  5. Максимально согните бедра и определите положение колена на уровне позвоночника, чтобы приблизиться к поясничному отделу тела 4 позвонка.
  6. Сделайте продольный разрез 2 см через кожу хирургическим скальпелем с 15 лезвиями.
  7. Пальпируйте остистые отростки, чтобы подтвердить срединную линию, и продолжайте разрез до кости.
  8. Рассекают субпериостально с правой стороны остистого отростка L4, распространяясь латерально до поперечного отростка.
  9. Пропустите рассасывающийся плетеный шовный материал размером 5-0 на головку и хвост к телу L4 через фасцию и оставьте открытым, готовясь к будущему закрытию.
  10. С помощью спинномозговой иглы 25 G разверните остистый отросток L4 с помощью спинной иглы 25 G и вставьте L-образный хирургический имплантат из нержавеющей стали диаметром 0,1 мм, длиной 1 см вдоль пластинки с длинной укладкой цефалады.
  11. Инокуляция имплантата 1 x 103 КОЕ/2 мкл биолюминесцентного S. aureus Xen36, следя за тем, чтобы весь раствор контактировал с имплантатом.
  12. Подождите примерно 10 секунд перед завязыванием ранее пройденного рассасывающегося шовного материала после посева, чтобы обеспечить удержание посевного материала на имплантате.
  13. Подтяните кожу бегом с помощью рассасывающегося шва.
  14. Вводите обезболивающее лекарство путем подкожной инъекции бупренорфина (0,1 мг/кг) сразу после остановки, а затем каждые 12 часов в течение 3 дней.
  15. Извлекайте мышей на грелку и следите за возвращением к нормальной активности.
  16. Получите послеоперационные рентгенограммы для подтверждения правильной установки имплантата.

5. Продольная биолюминесцентная визуализация in vivo для измерения бактериальной нагрузки

  1. Обезболивайте мышей ингаляционным изофлураном (2%). Подтвердите надлежащую глубину анестезии, контролируя, чтобы дыхание оставалось ритмичным и медленным, чем в бодрствующем состоянии, и не изменялось в ответ на вредные раздражители (например, хирургические манипуляции, защемление пальца ноги).
  2. Удалите волосы от крестца до верхнего грудного отдела позвоночника с помощью машинок для стрижки грызунов.
  3. Загрузите мышей в поле зрения платформы биолюминесцентной визуализации для выполнения биолюминесцентной визуализации in vivo (BLI)19.
  4. Захват биолюминесцентного сигнала в течение 5 минут. Используйте большие настройки биннинга с полем зрения 15 см (B).
  5. Повторите шаги 5.1-5.4 на послеоперационные дни 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 и 35 (или в другие дни в зависимости от конкретного плана эксперимента) для мониторинга бактериальной нагрузки.
  6. Представление данных BLI с помощью цветовой шкалы и наложения на фотографию в градациях серого. Выделите стандартную область интереса (ROI) с помощью программного обеспечения BLI для количественной оценки BLI в общем потоке (фотоны в секунду) или среднем максимальном потоке (фотоны в секунду/сантиметр2 на стерадиан).

6. Количественное определение бактерий, прилипших к имплантатам и окружающим тканям

  1. Эвтаназия мышей на POD 35 или в альтернативную дату послеоперационного периода по выбору с воздействием углекислого газа в соответствии с рекомендациями AVMA. Подтвердите эвтаназию при вторичном вывихе шейки матки.
  2. Стерилизуйте спинную кожу в соответствии с шагом 4.3 и поместите мышь лежа на стерильное операционное поле.
  3. Резко надрежьте предыдущий разрез хирургическим скальпелем с 15 лезвиями.
  4. Используйте стерильные ножницы, чтобы тупо рассечь остистый отросток L4 и идентифицировать хирургический имплантат.
  5. Используйте игольчатую отвертку, чтобы аккуратно скрутить и удалить имплантат из его положения в остистом отростке L4.
  6. Используя стерильные щипцы и ножницы, соберите примерно 0,1 г остистых отростковых костей и мягких тканей, непосредственно окружающих хирургический имплантат, и поместите 1 мл PBS в маленькую коническую трубку носорога с 4 острыми гомогенизирующими шариками.
  7. Записывайте вес мягких тканей, взвешивая коническую трубку до и после сбора урожая.
  8. Поместите имплантат в 0,5 мл 0,3% Tween-80 в TSB и проведите ультразвуковую терапию в течение 15 минут.
  9. Встряхивают полученную суспензию имплантата в течение 2 мин и культивируют в течение ночи в течение 12-16 ч.
  10. Гомогенизировать мягкие ткани и остистые отростки, предварительно помещенные в 1 мл PBS, окружающего имплантат, с помощью гомогенизатора.
  11. Встряхивают полученную суспензию мягких тканей в течение 5 мин и культивируют в течение ночи в течение 12-16 ч.
  12. После ночного посева подсчитывают КОЕ из имплантата и окружающих тканей соответственно. Экспресс-значение: общее количество КОЕ/г, собранное для мягких тканей, и КОЕ/мл для ультразвукового имплантата.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Представленная здесь процедура была использована для оценки эффективности схем антибиотикотерапии на мышиной модели ИИМ in vivo. В частности, эффективность комбинированной антибиотикотерапии ванкомицином и рифампицином сравнивали с монотерапией ванкомицином и нелеченной инфицированной контрольной группой.

Перед операцией мышей рандомизировали либо для комбинированной терапии, либо для монотерапии, либо для контроля инфекции. Для расчета объема выборки был проведен статистический анализ мощности. Для определения объема выборки использовались ожидаемые средние значения максимального потока 1 x 10 5 ± 3,2 x 10 4 и1,4 x 105, которые рассчитывались как N=10 в каждой группе. Мышам была проведена хирургическая имплантация, инокуляция S. aureus Xen36 и измерена биолюминесценция S. aureus in vivo на POD 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 и 35. На POD 35 мышей приносили в жертву и количественно определяли КОЕ для бактерий, адгезивных к имплантатам и окружающих тканей.

Мыши в группе монотерапии получали терапевтическую дозу ванкомицина (110 мг/кг два раза в сутки) подкожно. Эта доза была выбрана для приближения площади под кривой для типичного воздействия на человека ванкомицина21,22,23. Мыши в группе комбинированной терапии получали терапевтическую подкожную дозу ванкомицина (110 мг/кг два раза в сутки) и рифампицина (25 мг/кг в сутки)24. Мыши в инфицированной контрольной группе получали фиктивные инъекции стерильного физиологического раствора. Лечение всем группам проводилось с 7 по 14 сутки послеоперационного периода.

Влияние антибиотикотерапии на БЛЖ
У инфицированных контрольных мышей сигналы BLI достигали пика на POD 10, который оставался выше 1,0 x 105 фотон/см2/ср до жертвы, успешно моделируя хронический SII (рис. 2). Мыши, получавшие монотерапию ванкомицином, имели значительно более низкий сигнал BLI по сравнению с инфицированной контрольной группой, с 2-кратным снижением по сравнению с POD 10–21 (p<0,03). После POD 21 не было существенной разницы в BLI между монотерапией и инфицированными контрольными группами. Мыши, получавшие комбинированную терапию ванкомицином и рифампицином, имели еще более низкий сигнал BLI, который был в 20 раз ниже, чем инфицированная контрольная группа на POD 10. Значительное снижение сохранялось до POD 28 (стр<0,01). После POD 28 не было существенных различий в BLI между группами. Не было существенной разницы в BLI между любой из трех групп при заключительной визуализации на POD35.

КОЕ из имплантатов и окружающих тканей
Мышей приносили в жертву на POD 35. Имплантаты и окружающие ткани собирали и обрабатывали для подсчета КОЕ (рис. 3). Не было выявлено существенных различий в КОЕ между группами инфицированной контрольной, монотерапии или комбинированной терапии.

Figure 1
Рисунок 1: Разрушение раны при высокой дозе инокулята S. aureus Xen36. Изображения дорсальной кожи мышей, инокулированных S. aureus Xen36 во время инфекции спинного имплантата. (А) Мыши, инокулированные 1 x 103 КОЕ, и неповрежденная спинная кожа. (Б) Мышь была инокулирована 1 х 104 КОЕ и признаки значительного разрушения раны. Рисунок адаптирован и перепечатан с разрешения Dworsky et al.25Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Измерение бактериальной нагрузки с использованием биолюминесценции in vivo. 1 x 10,3 КОЕ S. aureus, обладающих биолюминесцентной конструкцией в стабильной плазмиде (Xen36), инокулировали в остистый отросток L4 мышей (n = 10 мышей в группе) в присутствии имплантата из нержавеющей стали. (A) Количество бактерий, измеренное с помощью биолюминесценции S. aureus in vivo (средний максимальный поток [фотоны/с/см2/ср] ± sem [логарифмическая шкала]), с блок-схемой протокола эксперимента, приведенной ниже. На POD 7 введение антибиотиков начиналось с ванкомицина, комбинации ванкомицина и рифампицина или стерильного физиологического раствора. Введение антибиотиков было прекращено на POD 14. На POD 35 мышей приносили в жертву и измеряли КОЕ из имплантата и окружающих тканей. (B) Репрезентативная биолюминесценция S. aureus in vivo на цветовой шкале, наложенной поверх изображения мышей в оттенках серого. Рисунок адаптирован и перепечатан с разрешения Hu et al.25Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Подтверждение бактериальной нагрузки с помощью подсчета КОЕ. В POD 35 были принесены в жертву мыши, штифты подвергались ультразвуковой обработке, ткани гомогенизировались, а бактерии культивировались и подсчитывались. Рисунок адаптирован и перепечатан с разрешения Hu et al.25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Инфекции позвоночника, связанные с имплантатами, предвещают неблагоприятные исходы для пациентов 1,2,3,4,5. В отличие от многих других областей тела, инфицированное оборудование в позвоночнике часто не может быть удалено из-за риска нестабильности и неврологических нарушений. Эта уникальная проблема, связанная с биопленочными бактериями, устойчивыми к системной антибиотикотерапии, обуславливает необходимость новых подходов к лечению12. Предыдущие исследования новых методов лечения ИИМ были ограничены дорогостоящими и неэффективными моделями на животных. Для лучшего изучения этих инфекций и эффективной оценки эффективности потенциальных методов лечения мы разработали неинвазивную продольную мышиную модель SII с использованием биолюминесцентной визуализации in vivo.

Предыдущие животные модели инструментальной инфекции позвоночника требовали анализа тканей ex vivo для оценки результатов, требовали больших когорт и не могли отслеживать инфекцию с течением времени13,14,26. В отличие от этого, мышиная модель SII, представленная в этой статье, использует BLI для надежного мониторинга бактериальной нагрузки с течением времени16,17,18. Этот новый подход позволяет исследователям оценить реакцию бактерий и хозяина на антибиотики, оболочки или иммуномодуляцию.

Важнейшие этапы протокола включают: надлежащую подготовку Xen36 S. aureus и оценку одиночного посевного материала 1 x 103 КОЕ/2 мкл; точная хирургическая имплантация, посев и закрытие; биолюминесцентная визуализация in vivo; и подтверждение бактериальной нагрузки с помощью подсчета КОЕ.

Модификации модели могут включать альтернативные биолюминесцентные штаммы бактерий, более долгосрочные временные точки или использование интеграции других типов генетически модифицированных мышей, таких как те, которые экспрессируют зеленый флуоресцентный белок в миелоидных клетках (Lys-EGFP), для одновременного измерения инфильтрации нейтрофилов с помощью флуоресцентной визуализации in vivo20. Дополнительные методики могут быть использованы в дополнение к тем, которые описаны в протоколе, для лечения таких процессов, как остеолиз позвонков, дегенерация диска, инфекция мягких тканей и инфекция биопленки имплантата. Методы, обеспечивающие количественные результаты в этих процессах, могут включать, но не ограничиваться: микрокомпьютерная томография, магнитно-резонансная томография, количественная ПЦР в реальном времени, серология, гистология, иммуногистохимия и/или сканирующая электронная микроскопия с переменным давлением.

Данная модель имеет ряд ограничений. Во-первых, модель хирургии позвоночника является грубым упрощением по сравнению с клинической практикой. В отличие от обширных операций по декомпрессии и многоуровневому спондилодезу, типичных для пациентов с хирургией позвоночника высокого риска, модельная операция включает в себя минимальную резекцию кости с использованием одного имплантата из нержавеющей стали. Поскольку клинические имплантаты позвоночника состоят из нескольких различных материалов, они могут иметь различную восприимчивость к бактериальной инфекции и образованию биопленки. Кроме того, как и во всех моделях животных, реакция хозяина на инфекцию мышей отличается от таковой у людей.

В будущем эта модель может быть использована для оценки лечения SII с помощью других методов доставки антибиотиков, включая порошок ванкомицина, гранулы с антибиотиком или имплантаты с покрытием. Кроме того, эта модель может быть использована для изучения механистических основ реакции хозяина на SII.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Acknowledgments

Авторы хотели бы выразить признательность за получение гранта Biomet Spine Общества педиатрического ортопедического общества Северной Америки и гранта KL2 Института клинических и трансляционных наук Национального института здравоохранения, а также гранта HH Lee Surgical Research Grant в качестве основных источников финансирования этих экспериментов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analytical Balance ME104 Mettler Toledo 30029067 120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base
BD Bacto Tryptic Soy Broth Becton Dickinson (BD) BD 211825 BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer Thermo Scientific 840-208300 Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord
Bioshield 720+ swinging bucket rotor Thermo Scientific 75003183 Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm
Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator) Branson Ultrasonics CPX952217R *similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal
Bullet Blender Storm Homogenizer Next Advance BBY24M The Bullet Blender Storm is the most powerful member of the Bullet Blender family. Homogenize up to 24 of your toughest samples (mouse femur, skin, cartilage, tumor, etc.) in just minutes. Air cooling™ minimizes sample heat up. Uses 1.5ml screw-cap RINO® tubes or snap-cap Eppendorf® Safe-lock™ tubes.
Germinator 500 Electron Microscopy Sciences 66118-10 The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be
used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for
traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine
sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been
designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211.
Heracell 150i CO2 Incubator Thermo Scientific 51026282 Single 150L
IVIS Lumina X5 Imaging System Perkin Elmer CLS148590 The IVIS Lumina X5 high-throughput 2D optical imaging system combines high-sensitivity bioluminescence and fluorescence with high-resolution x-ray into a compact system that fits on your benchtop. With an expanded 5 mouse field of view for 2D optical imaging plus our unique line of accessories to accelerate setup and labeling, it has never been easier or faster to get robust data—and answers—on anatomical and molecular aspects of disease.
MAXQ 4450 Digtial Incubating Bench Shaker Thermo Scientific SHKE4450 Shaker, Incubated; Thermo Scientific; Digital; MaxQ 4450; Speed 15 to 500rpm +/-1rpm; 5 deg. C above ambient to 80 deg. C; 120V 50/60Hz
PBS, Phosphate Buffered Saline Fisher Bioreagents BP24384 PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4
Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated Thermo Scientific 75002436 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid
SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge Thermo Scientific 75004261 Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz
Staphylococcus aureus - Xen36 Perkin Elmer 119243 Staphylococcus aureus - Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid.
TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V Heidolph Tuttnauer 23210401 Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls
Tween 80 Fisher Bioreagents BP338-500 Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction
Vortex mixer VX-200 Labnet Internation S0200 120V touch or continuous mixer, 230V: 0 - 2,850 rpm,120V: 0 - 3,400 rpm
0.9% Sodium Chloride Pfizer Injectables/Hospira 00409-4888-10 0.9% Sodium Chloride Injection, USP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of neutrophils in experimental septicemia and septic arthritis induced by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 65 (7), 2517-2521 (1997).
  2. Fang, A., Hu, S. S., Endres, N., Bradford, D. S. Risk factors for infection after spinal surgery. Spine. 30 (12), Phila Pa. 1460-1465 (2005).
  3. Levi, A. D., Dickman, C. A., Sonntag, V. K. Management of postoperative infections after spinal instrumentation. Journal of Neurosurgery. 86 (6), 975-980 (1997).
  4. Weinstein, M. A., McCabe, J. P., Cammisa, F. P. Postoperative spinal wound infection: a review of 2,391 consecutive index procedures. Journal of Spinal Disorders. 13 (5), 422-426 (2000).
  5. Picada, R., et al. Postoperative deep wound infection in adults after posterior lumbosacral spine fusion with instrumentation: incidence and management. Journal of Spinal Disorders. 13 (1), 42-45 (2000).
  6. Smith, J. S., et al. Rates of infection after spine surgery based on 108,419 procedures: a report from the Scoliosis Research Society Morbidity and Mortality Committee. Spine. 36 (7), Phila Pa. 556-563 (2011).
  7. Abbey, D. M., Turner, D. M., Warson, J. S., Wirt, T. C., Scalley, R. D. Treatment of postoperative wound infections following spinal fusion with instrumentation. Journal of Spinal Disorders. 8 (4), 278-283 (1995).
  8. Silber, J. S., et al. Management of postprocedural discitis. Spine Journal. 2 (4), 279-287 (2002).
  9. Pappou, I. P., Papadopoulos, E. C., Sama, A. A., Girardi, F. P., Cammisa, F. P. Postoperative infections in interbody fusion for degenerative spinal disease. Clinical Orthopaedics and Related Research. 444, 120-128 (2006).
  10. Sampedro, M. F., et al. A biofilm approach to detect bacteria on removed spinal implants. Spine. 35 (12), Phila Pa. 1218-1224 (2010).
  11. Pull ter Gunne, A. F., Mohamed, A. S., Skolasky, R. L., van Laarhoven, C. J., Cohen, D. B. The presentation, incidence, etiology, and treatment of surgical site infections after spinal surgery. Spine. 35 (13), Phila Pa. 1323-1328 (2010).
  12. Olsen, M. A., et al. Risk factors for surgical site infection in spinal surgery. Journal of Neurosurgery. 98, 2 Suppl 149-155 (2003).
  13. Ofluoglu, E. A., et al. Implant-related infection model in rat spine. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 127 (5), 391-396 (2007).
  14. Guiboux, J. P., et al. The role of prophylactic antibiotics in spinal instrumentation. A rabbit model. Spine. 23 (6), Phila Pa. 653-656 (1998).
  15. Stavrakis, A. I., et al. Current Animal Models of Postoperative Spine Infection and Potential Future Advances. Frontiers in Medicine (Lausanne). 2, 34 (2015).
  16. Pribaz, J. R., et al. Mouse model of chronic post-arthroplasty infection: noninvasive in vivo bioluminescence imaging to monitor bacterial burden for long-term study. Journal of Orthopaedic Research. 30 (3), 335-340 (2012).
  17. Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS One. 5 (9), 12580 (2010).
  18. Niska, J. A., et al. Monitoring bacterial burden, inflammation and bone damage longitudinally using optical and muCT imaging in an orthopaedic implant infection in mice. PLoS One. 7 (10), 47397 (2012).
  19. Francis, K. P., et al. Monitoring bioluminescent Staphylococcus aureus infections in living mice using a novel luxABCDE construct. Infection and Immunity. 68 (6), 3594-3600 (2000).
  20. Dworsky, E. M., et al. Novel in vivo mouse model of implant related spine infection. Journal of Orthopaedic Research. 35 (1), 193-199 (2017).
  21. Hegde, S. S., et al. Activity of telavancin against heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) in vitro and in an in vivo mouse model of bacteraemia. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 65 (4), 725-728 (2010).
  22. Crandon, J. L., Kuti, J. L., Nicolau, D. P. Comparative efficacies of human simulated exposures of telavancin and vancomycin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus with a range of vancomycin MICs in a murine pneumonia model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (12), 5115-5119 (2010).
  23. Reyes, N., et al. Efficacy of telavancin in a murine model of bacteraemia induced by methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 58 (2), 462-465 (2006).
  24. Sakoulas, G., Eliopoulos, G. M., Alder, J., Eliopoulos, C. T. Efficacy of daptomycin in experimental endocarditis due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (5), 1714-1718 (2003).
  25. Hu, Y., et al. Combinatory antibiotic therapy increases rate of bacterial kill but not final outcome in a novel mouse model of Staphylococcus aureus spinal implant infection. PLoS One. 12 (2), 0173019 (2017).
  26. Poelstra, K. A., Barekzi, N. A., Grainger, D. W., Gristina, A. G., Schuler, T. C. A novel spinal implant infection model in rabbits. Spine. 25 (4), Phila Pa. 406-410 (2000).

Tags

Инфекция спинномозговых имплантатов мышиная модель in vivo терапия стратегии лечения хирургия позвоночника задним доступом биолюминесцентный штамм бактерии Staphylococcus aureus Xen36 биолюминесцентная визуализация бактериальная нагрузка периимплантная ткань колониеобразующие единицы (КОЕ) животные модели

Erratum

Formal Correction: Erratum: In vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection
Posted by JoVE Editors on 05/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: In vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection. The Authors section was updated from:

Benjamin V. Kelley1
Stephen D. Zoller1
Danielle Greig1
Kellyn Hori1
Nicolas Cevallos1
Chad Ishmael1
Peter Hsiue1
Rishi Trikha1
Troy Sekimura2
Thomas Olson2
Ameen Chaudry2
Michael M. Le2
Anthony A. Scaduto1
Kevin P. Francis1
Nicholas M. Bernthal1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles
2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

to:

Benjamin V. Kelley1
Christopher Hamad1
Stephen D. Zoller1
Danielle Greig1
Zeinab Mamouei1
Rene Chun1
Kellyn Hori1
Nicolas Cevallos1
Chad Ishmael1
Peter Hsiue1
Rishi Trikha1
Troy Sekimura2
Brandon Gettleman3
Autreen Golzar2
Adrian Lin2
Thomas Olson2
Ameen Chaudry2
Michael M. Le2
Anthony A. Scaduto1
Kevin P. Francis1
Nicholas M. Bernthal1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles
2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles
3University of South Carolina School of Medicine, University of South Carolina

Мышиная модель инфекции спинальных имплантатов in vivo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelley, B. V., Hamad, C., Zoller, S. … More

Kelley, B. V., Hamad, C., Zoller, S. D., Greig, D., Mamouei, Z., Chun, R., Hori, K., Cevallos, N., Ishmael, C., Hsiue, P., Trikha, R., Sekimura, T., Gettleman, B., Golzar, A., Lin, A., Olson, T., Chaudry, A., Le, M. M., Scaduto, A. A., Francis, K. P., Bernthal, N. M. In Vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection. J. Vis. Exp. (160), e60560, doi:10.3791/60560 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter