Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Spinal İmplant Enfeksiyonunun İn Vivo Fare Modeli

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/60560
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 2, 2, 2, 2, 2, 1, 1, 1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles, 2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 3University of South Carolina School of Medicine, University of South Carolina

ERRATUM NOTICE

Summary

Protokol, paslanmaz çelik bir k-tel implantının biyolüminesan Staphylococcus aureus Xen36 ile enfekte olduğu yeni bir in vivo spinal implant enfeksiyonu fare modelini açıklar. Bakteri yükü biyolüminesan görüntüleme ile uzunlamasına izlenir ve ötenazi sonrası koloni oluşturan birim sayıları ile doğrulanır.

Abstract

Omurga implantı enfeksiyonları, tanının zor olması ve cerrahi eradikasyonun mekanik spinal stabilite ile çelişmesi nedeniyle kötü sonuçlara işaret eder. Bu yöntemin amacı, spinal implant enfeksiyonları için potansiyel terapötikleri ve tedavi stratejilerini test etmek için ucuz, hızlı ve doğru bir in vivo araç sağlamak üzere oluşturulmuş yeni bir spinal implant enfeksiyonu (SII) fare modelini tanımlamaktır.

Bu yöntemde, paslanmaz çelik bir k-telinin 12 haftalık C57BL/6J vahşi tip farelerin L4 spinöz sürecine transfikse edildiği ve 1 x 103 CFU biyolüminesan bir Staphylococcus aureus Xen36 bakteri suşu ile aşılandığı bir posterior yaklaşım omurga cerrahisi modeli sunuyoruz. Fareler daha sonra ameliyat sonrası 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 ve 35. günlerde in vivo biyolüminesans için uzunlamasına görüntülenir. Standartlaştırılmış bir görüş alanından alınan biyolüminesans görüntüleme (BLI) sinyalleri, in vivo bakteri yükünü ölçmek için ölçülür.

İmplantlara ve implant çevresi dokuya yapışan bakterileri ölçmek için farelere ötenazi yapılır ve implant ve çevresindeki yumuşak doku hasat edilir. Bakteriler sonikasyon ile implanttan ayrılır, gece boyunca kültürlenir ve daha sonra koloni oluşturan birimler (CFU'lar) sayılır. Bu yöntemden elde edilen sonuçlar, in vivo S. aureus biyolüminesans (ortalama maksimum akı) ve ötenazi sonrası CFU sayıları ile ölçülen uzunlamasına bakteri sayımlarını içerir.

Aletli omurga enfeksiyonunun önceki hayvan modelleri invaziv, ex vivo doku analizini içerirken, bu yazıda sunulan SII'nin fare modeli, statik doku çalışmasının yerini almak için biyolüminesan bakterilerin invaziv olmayan, gerçek zamanlı in vivo optik görüntülemesinden yararlanır. Modelin uygulamaları geniştir ve alternatif biyolüminesan bakteri suşlarının kullanılmasını, konakçı bağışıklık tepkisini eşzamanlı olarak incelemek için diğer genetik olarak tasarlanmış fare türlerini dahil etmeyi ve antibiyotikler veya implant kaplamaları gibi mevcut veya yeni tanı ve tedavi yöntemlerini değerlendirmeyi içerebilir.

Introduction

Bu yöntemin amacı, spinal implant enfeksiyonunun (SII) yeni bir fare modelini tanımlamaktır. Bu model, konakçı, patojen ve/veya implant değişkenlerinin etkisini in vivo olarak esnek bir şekilde değerlendirmek için ucuz ve doğru bir araç sağlamak üzere tasarlanmıştır. Bu modelde spinal implant enfeksiyonları için potansiyel terapötiklerin ve tedavi stratejilerinin test edilmesi, daha büyük hayvan modellerinde ve klinik çalışmalarda uygulamadan önce araştırma geliştirmeye rehberlik etmeyi amaçlamaktadır.

Omurga cerrahisi sonrası implanta bağlı enfeksiyon yıkıcı bir komplikasyondur ve ne yazık ki elektif omurga cerrahisi geçiren hastaların yaklaşık %3-8'inde görülür 1,2,3,4,5 ve çok seviyeli veya revizyon cerrahisi geçiren hastaların %65'ine kadarı 6. Spinal implant enfeksiyonlarının tedavisi genellikle birden fazla hastaneye yatış, birden fazla ameliyat ve uzun süreli antibiyotik tedavisi gerektirir. SII'ler, nörolojik uzlaşma, sakatlık ve artmış mortalite riski dahil olmak üzere kötü hasta sonuçlarına işaret eder. SII'nin yönetimi son derece pahalıdır ve hasta başına 900.000 dolardan fazlaya mal olur7.

Staphylococcus aureus, SII 8,9,10,11'in en yaygın virülan patojenidir. Bakteriler donanımı doğrudan ameliyat sırasında, ameliyat sonrası dönemde yaradan veya daha sonra hematojen yayılma yoluyla tohumlayabilir. Metal implantların varlığında, S. aureus, bakterileri antibiyotik tedavisinden ve bağışıklık hücrelerinden koruyan biyofilm oluşturur. Enfekte olmuş donanımın çıkarılması bir enfeksiyonun etkili bir şekilde ortadan kaldırılmasına yardımcı olabilirken, bu genellikle omurgada istikrarsızlığa neden olmadan ve nörolojik uzlaşma riski taşımadanmümkün değildir 12.

Enfekte olmuş donanımın ekstrüktüre edilmemesi durumunda, SII'yi önlemek, tespit etmek ve tedavi etmek için yeni yaklaşımlara ihtiyaç vardır. Tarihsel olarak, yeni tedavilerin güvenliğini ve etkinliğini etkin bir şekilde değerlendirmek için SII'nin sınırlı hayvan modelleri olmuştur. SII'nin önceki hayvan modelleri, çok sayıda hayvan ve koloni sayımı, histoloji ve kültür dahil olmak üzere ötenazi gerektiren veri noktalarının toplanmasını gerektirir13,14,15. Uzunlamasına in vivo izlemeden yoksun olan bu modeller, hayvan başına yalnızca bir veri noktası sağlar ve bu nedenle pahalı ve verimsizdir.

Diz artroplastisi enfeksiyonunun bir fare modelini inceleyen önceki çalışma, enfeksiyon yükünü uzunlamasına izlemek için noninvaziv in vivo optik görüntülemenin değerini ve doğruluğunu ortaya koymuştur16. Biyolüminesansın tespiti, bakteri yükünün tek bir hayvanda uzunlamasına bir zaman boyunca insanca, doğru ve verimli bir şekilde ölçülmesini sağlar. Ayrıca, önceki çalışmalar, in vivo biyolüminesans ile implantlara bağlı CFU'lar arasında yüksek bir korelasyon olduğunu göstermiştir17. Zaman içinde enfeksiyonu takip etme kapasitesi, implantla ilişkili enfeksiyonun daha incelikli bir şekilde anlaşılmasına yol açmıştır. Ek olarak, boylamsal enfeksiyonun bu şekilde izlenmesi, antibiyotik tedavisinin ve yeni antimikrobiyallerin etkinliğinin doğru bir şekilde değerlendirilmesine olanak sağlamıştır16,17,18.

Bu araçlardan yararlanarak, postoperatif spinal implant enfeksiyonu modelini geliştirdik ve doğruladık. Sunulan yöntemde, bakteri yükünü uzunlamasına izlemek için SII'nin in vivo fare modelini oluşturmak için bir biyolüminesan S. aureus Xen36 aşısı kullanıyoruz16,17,18. Bu yeni model, daha büyük hayvan modellerinde ve klinik çalışmalarda uygulanmadan önce SII için potansiyel tespit, önleme ve tedavi stratejilerini verimli bir şekilde test etmek için değerli bir araç sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvanlar, Hayvan Refahı Yasası (AWA), 1996 Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu, Laboratuvar Hayvanlarının İnsani Bakımı ve Kullanımı için PHS Politikası ve ayrıca Hayvan Bakımı ve Kullanımı Eğitim Kılavuzunda belirtilen kurumun politika ve prosedürlerinde belirtilen federal düzenlemelerde tanımlanan iyi hayvan uygulamalarına sıkı sıkıya bağlı olarak ele alınmıştır. ve tüm hayvan çalışmaları, California Üniversitesi Los Angeles Şansölyesi'nin Hayvan Araştırma Komitesi (ARC) tarafından onaylandı.

1. S. aureus biyolüminesan gerinim seçimi

  1. İlgilenilen aşı olarak biyolüminesan S. aureus suşu Xen36'yı kullanın.
    NOT: Bu suş, septik bir hastadan alınan klinik bir izolat olan ebeveyn suşu S. aureus ATCC-49525'ten türetilmiştir. S. aureus ( S. aureus) Xen36, optimize edilmiş ve ana bilgisayarın doğal plazmidine entegre edilmiş bir luxABCDE operonunu benzersiz bir şekilde kullanır. 19 Sonuç olarak, Xen36 suşu, 490 nm'lik bir tepe dalga boyu emisyonuna sahip mavi-yeşil bir biyolüminesan ışık üretebilir. Bu emisyon sinyali sadece metabolik olarak aktif olan canlı bakteriyel organizmalar tarafından üretilir.

2. S'nin Hazırlanması. Aşılama için Aureus

  1. S. aureus Xen36'yı potansiyel kirleticilerden izole etmek için Luria Broth'a 200 μg/mL kanamisin artı %1.5 agar ekleyin, lux operon19'a bağlı kanamisin direnç genini kullanın.
  2. S. aureus Xen36 bakterilerini triptik soya agar plakalarına (triptik soya suyu [TSB] artı %1.5 agar) yerleştirin ve 37 °C'de 12-16 saat inkübe edin.
  3. S. aureus Xen36'nın tek kolonilerini izole edin ve TSB'de 12-16 saat boyunca 37 ° C'de çalkalayan bir inkübatörde (200 rpm) ayrı ayrı kültürleyin.
  4. Elde edilen kültürü 1:50 oranında seyreltin.
  5. Midlogaritmik faz bakterilerini izole etmek için 37 ° C'de 2 saat daha kültür.
  6. Bakterileri fosfat tamponlu salin (PBS) içinde üç kez peletleyin, yeniden süspanse edin ve yıkayın.
  7. Absorbansı 600 nm'de ölçün. İdeal OD600, 0.700 ile 0.750 arasındadır ve bu da 4x105 CFU/mL'ye karşılık gelir. İstenilen bakteriyel aşılamayı (1 x 103 CFU / 2 μL) elde etmek için seri seyreltmeler gerçekleştirin.
    NOT: Kronik bir enfeksiyonun kurulması için optimal Xen36 konsantrasyonunun 1 x 103 CFU olduğu bulunmuştur. Daha düşük bakteri dozu, konakçı bağışıklık sistemi tarafından temizlendi ve daha yüksek dozlama, yara parçalanmasına neden oldu. Yara parçalanması, derin implant enfeksiyonu ile yüzeysel yara enfeksiyonu arasında ayrım yapmaz ve bu nedenle bu modelde önlenir (Şekil 1)20.

3. Fareler

  1. 12 haftalık erkek C57BL / 6J vahşi tip fareler kullanın.
  2. Bir seferde en fazla 4 tane olan kafeslerdeki ev fareleri.
  3. Suyu her zaman hazır bulundurun. 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsü sürdürün ve döngünün karanlık evresinde deney yapmayın.
  4. Floresan sinyalizasyonu ile potansiyel parazit nedeniyle besleme için yonca içermeyen yem kullanın.
  5. Deneyin tamamı boyunca hayvanların refahını sağlamak için araştırma veya veteriner personelinin fareleri günlük olarak değerlendirmesini sağlayın.

4. Fare cerrahi prosedürleri

  1. Fareleri yaklaşık 5 dakika boyunca bir izofluran (% 2) odasına yerleştirerek anesteziyi indükleyin. Solunumun uyanık olduğundan daha ritmik ve daha yavaş kalmasını ve zararlı uyaranlara yanıt olarak değişmemesini izleyerek uygun anestezi derinliğini onaylayın (ör., cerrahi manipülasyon, ayak parmağı sıkışması).
  2. Anestezi uygulanmış fareleri bir hazırlık istasyonuna aktarın ve kemirgen makası ile sakrumdan üst torasik omurgaya kadar tüyleri alın.
  3. Cildi alternatif betadin çözeltisi ve izopropil alkolün üçlü yıkamasıyla temizleyin ve sterilize edin.
  4. Yüzüstü pozisyonda anestezi uygulanmış ve sterilize edilmiş fareleri steril bir cerrahi yatağa aktarın, burun konisi yoluyla inhale izofluran (% 2) uygulanarak anesteziyi koruyun.
  5. Kalçaları maksimum düzeyde esnetin ve lomber 4 vertebral gövdeye yaklaşmak için dizin omurga seviyesindeki konumunu belirleyin.
  6. 15 bıçaklı cerrahi neşter ile deriden uzunlamasına 2 cm'lik bir kesi yapın.
  7. Orta hattı doğrulamak için dikenli süreçleri palpe edin ve insizyonu kemiğe kadar devam ettirin.
  8. L4 spinöz işleminin sağ tarafında subperiostal olarak diseksiyon yapın ve enine sürece lateral olarak uzanın.
  9. 5-0 sefalad ve kaudad boyutunda, emilebilir örgülü bir sütürü fasyadan L4 gövdesine geçirin ve gelecekteki kapanmaya hazırlık olarak açık bırakın.
  10. 25 G'lik bir spinal iğne kullanarak, 25 G'lik bir spinal iğne kullanarak L4'ün dikenli işlemini raybalayın ve uzun kol döşeme sefaladı ile lamina boyunca 0,1 mm çapında, 1 cm uzunluğunda "L-şekilli" cerrahi sınıf paslanmaz çelik bir implant yerleştirin.
  11. İmplantı 1 x 103 CFU/2 μL biyolüminesan S. aureus Xen36 ile aşılayın ve tüm solüsyonun implanta temas etmesine dikkat edin.
  12. İmplant üzerinde aşı tutulmasını sağlamak için aşılamadan sonra daha önce geçirilen emilebilir sütürü bağlamadan önce yaklaşık 10 saniye bekleyin.
  13. Emilebilir sütür ile cildi koşu tarzında kapatın.
  14. Ağrı kesici ilaçları deri altı buprenorfin (0.1 mg / kg) enjeksiyonu yoluyla hemen postop ve daha sonra 3 gün boyunca her 12 saatte bir uygulayın.
  15. Bir ısıtma yastığındaki fareleri kurtarın ve normal aktiviteye dönüş için izleyin.
  16. İmplantın uygun yerleşimini doğrulamak için postoperatif radyografiler alın.

5. Bakteri yükünü ölçmek için uzunlamasına in vivo biyolüminesans görüntüleme

  1. Fareleri inhale izofluran (% 2) ile uyuşturun. Solunumun uyanık olduğundan daha ritmik ve daha yavaş kalmasını ve zararlı uyaranlara yanıt olarak değişmemesini izleyerek uygun anestezi derinliğini onaylayın (ör., cerrahi manipülasyon, ayak parmağı sıkışması).
  2. Kemirgen makası ile sakrumdan üst torasik omurgaya kadar kılları alın.
  3. İn vivo biyolüminesans görüntüleme (BLI)19 gerçekleştirmek için fareleri biyolüminesans görüntüleme platformunun görüş alanına yükleyin.
  4. Biyolüminesan sinyali 5 dakikalık bir çekim süresi boyunca yakalayın. 15 cm'lik görüş alanına (B) sahip büyük gruplama ayarlarını kullanın.
  5. Bakteri yükünü izlemek için postoperatif 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 ve 35. günlerde (veya belirli deneysel tasarıma dayalı diğer günlerde) 5.1-5.4 adımlarını tekrarlayın.
  6. BLI verilerini renk skalası aracılığıyla sunun ve gri tonlamalı bir fotoğrafın üzerine bindirin. BLI'yi toplam akı (saniyedeki fotonlar) veya ortalama maksimum akı (fotonlar/saniye/santimetre2/steradyan) cinsinden ölçmek için BLI yazılımını kullanarak standart bir oval ilgi bölgesini (ROI) izole edin.

6. İmplantlara ve çevresindeki dokuya yapışan bakterileri ölçün

  1. Fareleri POD 35'te ötenazi yapın veya AVMA Yönergelerine uygun olarak karbondioksite maruz kalma ile alternatif bir ameliyat sonrası tercih tarihi. İkincil servikal çıkık ile ötenaziyi onaylayın.
  2. Sırt derisini Adım 4.3'e göre sterilize edin ve fareyi steril bir cerrahi alana yüzüstü yerleştirin.
  3. 15 bıçaklı bir cerrahi neşter kullanarak önceki kesiği keskin bir şekilde kesin.
  4. L4 spinöz sürecini kör bir şekilde incelemek ve cerrahi implantı tanımlamak için steril makas kullanın.
  5. L4 dikenli işlemde implantı nazikçe bükmek ve konumundan çıkarmak için bir iğne ucu kullanın.
  6. Steril forseps ve makas kullanarak, cerrahi implantı hemen çevreleyen yaklaşık 0.1 g dikenli işlem kemiği ve yumuşak dokuyu toplayın ve 4 keskin homojenleştirici boncuklu küçük konik gergedan tüpüne 1 mL PBS'ye yerleştirin.
  7. Hasattan önce ve sonra konik boruyu tartarak yumuşak dokunun ağırlığını kaydedin.
  8. İmplantı TSB'de 0.5 mL% 0.3 Tween-80'e yerleştirin ve 15 dakika boyunca sonikasyon yapın.
  9. Elde edilen implant süspansiyonunu 2 dakika vorteksleyin ve gece boyunca 12-16 saat boyunca kültürleyin.
  10. Daha önce implantı çevreleyen 1 ml PBS'ye yerleştirilmiş yumuşak doku ve spinöz işlemleri homojenizatör kullanarak homojenize edin.
  11. Elde edilen yumuşak doku süspansiyonunu 5 dakika boyunca vorteksleyin ve gece boyunca 12-16 saat boyunca kültürleyin.
  12. Gece kültüründen sonra, sırasıyla implanttan ve çevresindeki dokulardan CFU sayın. Yumuşak doku için hasat edilen toplam CFU / g ve sonikasyonlu implant için CFU / mL olarak ifade edilen değer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada sunulan prosedür, SII'nin in vivo fare modelinde antibiyotik rejimlerinin etkinliğini değerlendirmek için kullanıldı. Spesifik olarak, vankomisin ve rifampin antibiyotik kombinasyonunun etkinliği, vankomisin monoterapisi ve tedavi edilmemiş enfekte kontrollerle karşılaştırıldı.

Ameliyattan önce, fareler kombinasyon tedavisine, monoterapiye veya enfekte kontrole randomize edildi. Örneklem büyüklüğünü hesaplamak için istatistiksel güç analizi yapılmıştır. Örneklem büyüklüğünü belirlemek için beklenen ortalama maksimum akı ortalamaları 1 x 10 5 ± 3.2 x 10 4 ve1.4 x 105 kullanıldı ve her grupta N=10olarak hesaplandı. Farelere cerrahi implantasyon, S. aureus Xen36 ile aşılama yapıldı ve in vivo POD 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 ve 35'te S. aureus biyolüminesansı ölçüldü. POD 35'te fareler sakrifiye edildi ve implanta yapışan ve çevresindeki doku bakterileri için CFU'lar ölçüldü.

Monoterapi grubundaki fareler, deri altından verilen terapötik bir vankomisin dozu (günde iki kez 110 mg / kg) aldı. Bu doz, vankomisin21,22,23 için tipik insan maruziyeti için eğrinin altındaki alanı yaklaşık olarak tahmin etmek üzere seçildi. Kombinasyon tedavisi grubundaki farelere terapötik subkutan dozda vankomisin (günde iki kez 110 mg / kg) ve rifampin (günde 25 mg / kg) verildi24. Enfekte kontrol grubundaki farelere sahte steril salin enjeksiyonları yapıldı. Tüm gruplar için tedavi postoperatif 7-14. günler arasında yapıldı.

Antibiyotik tedavisinin BLI üzerine etkisi
Enfekte kontrol fareleri, kurban edilene kadar 1.0 x 105 foton / s / cm 2 / sr'nin üzerinde kalan POD 10'da zirve yapan BLI sinyallerine sahipti ve kronik bir SII'yi başarılı bir şekilde modelledi (Şekil 2). Vankomisin monoterapisi ile tedavi edilen fareler, enfekte kontrole kıyasla önemli ölçüde daha düşük BLI sinyaline sahipti ve POD 10-21'den 2 kat azalma vardı (p<0.03). POD 21'den sonra, monoterapi ve enfekte kontrol grupları arasında BLI'da anlamlı bir fark yoktu. Vankomisin-rifampin kombinasyon tedavisi ile tedavi edilen fareler, POD 10'daki enfekte kontrolden 20 kat daha düşük olan daha düşük bir BLI sinyaline sahipti. POD 28'e kadar anlamlı bir azalma devam etti (p<0.01). POD 28'den sonra BLI'da gruplar arasında anlamlı bir fark yoktu. POD35'teki son görüntülemede üç gruptan herhangi biri arasında BLI açısından anlamlı bir fark yoktu.

İmplantlardan ve çevresindeki dokulardan CFU'lar
Fareler POD 35'te sakrifiye edildi. İmplantlar ve çevresindeki dokular çıkarıldı ve CFU sayımı için işlendi (Şekil 3). CFU'larda enfekte kontrol, monoterapi veya kombinasyon tedavisi grupları arasında anlamlı bir fark gözlenmedi.

Figure 1
Şekil 1: Yüksek doz S. aureus Xen36 inoculum'da yara parçalanması. Omurga implantı enfeksiyonu sırasında S. aureus Xen36 ile aşılanan farelerin dorsal derisinin görüntüleri. (A) 1 x 103 CFU ile aşılanmış fare ve sağlam sırt derisi. (B) 1 x 104 CFU ile aşılanmış fare ve önemli yara parçalanmasının kanıtı. Şekil, Dworsky ve ark.25'in izniyle uyarlanmış ve yeniden basılmıştır Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: İn vivo biyolüminesans kullanılarak bakteri yükünün ölçümü. Stabil bir plazmidde (Xen36) biyolüminesan yapıya sahip olan S. aureus'un 1 x 103 CFU'su, paslanmaz çelik bir implant varlığında farelerin L4 spinöz sürecine (grup başına n = 10 fare) aşılandı. (A) İn vivo S. aureus biyolüminesansı (ortalama maksimum akı [fotonlar/s/cm2/sr] ± sem [logaritmik ölçek]) ile ölçülen bakteri sayımları, aşağıdaki deneysel protokolün akış diyagramı ile. POD 7'de antibiyotik uygulaması, vankomisin ve rifampin kombinasyonu veya steril salin kontrolü olan vankomisin ile başladı. POD 14'te antibiyotik uygulaması durduruldu. POD 35'te fareler sakrifiye edildi ve implant ve çevresindeki dokudan CFU'lar ölçüldü. (B) Temsili in vivo Farelerin gri tonlamalı görüntüsünün üzerine yerleştirilmiş bir renk skalasında S. aureus biyolüminesansı. Şekil Hu ve ark.25'in izniyle uyarlanmış ve yeniden basılmıştır Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: CFU sayımları kullanılarak bakteri yükünün doğrulanması. POD 35'te fareler kurban edildi, pimler sonikleştirildi, doku homojenize edildi ve bakteriler kültürlendi ve sayıldı. Şekil, Hu ve ark.25'in izniyle uyarlanmış ve yeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Omurgadaki implantla ilişkili enfeksiyonlar, 1,2,3,4,5 hastaları için kötü sonuçlara işaret eder. Vücuttaki diğer birçok bölgeden farklı olarak, omurgadaki enfekte donanım, instabilite ve nörolojik uzlaşma riski nedeniyle sıklıkla çıkarılamaz. Sistemik antibiyotik tedavisine dirençli biyofilm bakterileri ortamındaki bu benzersiz zorluk, tedaviye yeni yaklaşımlar gerektirmektedir12. SII için yeni tedavilerde yapılan önceki araştırmalar, pahalı, verimsiz hayvan modelleri ile sınırlandırılmıştır. Bu enfeksiyonları daha iyi incelemek ve potansiyel tedavilerin etkinliğini verimli bir şekilde değerlendirmek için, in vivo biyolüminesans görüntüleme kullanarak noninvaziv bir uzunlamasına SII fare modeli geliştirdik.

Aletli omurga enfeksiyonunun önceki hayvan modelleri, sonuçları değerlendirmek için ex vivo doku analizi gerektiriyordu, büyük kohortlar gerektiriyordu ve zaman içinde enfeksiyonu izleyemiyordu13,14,26. Buna karşılık, bu yazıda sunulan SII'nin fare modeli, zaman içinde bakteri yükünü güvenilir bir şekilde izlemek için BLI'dan yararlanır16,17,18. Bu yeni yaklaşım, araştırmacıların bakterilerin ve konakçının antibiyotiklere, kaplamalara veya bağışıklık modülasyonuna tepkisini değerlendirmelerini sağlar.

Protokoldeki kritik adımlar şunları içerir: Xen36 S. aureus'un uygun şekilde hazırlanması ve tek aşının 1 x 103 CFU/2 μL tahmini; hassas cerrahi implantasyon, aşılama ve kapatma; in vivo biyolüminesan görüntüleme; ve CFU sayımları kullanılarak bakteri yükünün doğrulanması.

Modelde yapılan modifikasyonlar, alternatif biyolüminesan bakteri suşlarını, daha uzun vadeli zaman noktalarını veya in vivo floresan görüntüleme ile nötrofil infiltrasyonunu eşzamanlı olarak ölçmek için miyeloid hücrelerde (Lys-EGFP) yeşil floresan proteini eksprese edenler gibi diğer genetik olarak tasarlanmış fare türlerinin entegrasyonunun kullanımını içerebilir20. Vertebra osteolizi, disk dejenerasyonu, yumuşak doku enfeksiyonu ve implant biyofilm enfeksiyonu gibi süreçleri ele almak için protokolde açıklananları tamamlamak için ek metodolojiler kullanılabilir. Bu süreçlerde kantitatif sonuçlar sağlayan teknikler şunları içerebilir ancak bunlarla sınırlı değildir: mikro bilgisayarlı tomografi, manyetik rezonans görüntüleme, gerçek zamanlı kantitatif PCR, seroloji, histoloji, immünohistokimya ve/veya değişken basınçlı taramalı elektron mikroskobu.

Bu modelin birkaç sınırlaması vardır. İlk olarak, omurga cerrahisi modeli, klinik uygulamaya kıyasla büyük bir basitleştirmedir. Yüksek riskli omurga cerrahisi hastalarına özgü kapsamlı dekompresyon ve çok seviyeli füzyon ameliyatlarının aksine, model cerrahi, tek bir paslanmaz çelik implant ile minimal kemik rezeksiyonunu içerir. Klinik omurga implantları birden fazla farklı materyale sahip olduğundan, bunlar bakteriyel enfeksiyona ve biyofilm oluşumuna karşı farklı duyarlılıklara sahip olabilir. Ek olarak, tüm hayvan modellerinde olduğu gibi, farelerin enfeksiyonuna konakçı tepkisi insanlarınkinden farklıdır.

Gelecekte, bu model SII'nin vankomisin tozu, antibiyotik yüklü boncuklar veya kaplanmış implantlar dahil olmak üzere diğer antibiyotik verme modaliteleri ile tedavisini değerlendirmek için kullanılabilir. Ek olarak, bu model, SII'ye konakçı yanıtının mekanik temelini incelemek için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Yazarlar, hem Kuzey Amerika Pediatrik Ortopedi Derneği Biomet Omurga Hibesi hem de Ulusal Sağlık Enstitüleri Klinik ve Translasyonel Bilim Enstitüsü KL2 Hibesi ve HH Lee Cerrahi Araştırma Hibesi'nin bu deneyler için ana finansman kaynakları olarak alındığını kabul etmek istemektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analytical Balance ME104 Mettler Toledo 30029067 120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base
BD Bacto Tryptic Soy Broth Becton Dickinson (BD) BD 211825 BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer Thermo Scientific 840-208300 Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord
Bioshield 720+ swinging bucket rotor Thermo Scientific 75003183 Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm
Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator) Branson Ultrasonics CPX952217R *similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal
Bullet Blender Storm Homogenizer Next Advance BBY24M The Bullet Blender Storm is the most powerful member of the Bullet Blender family. Homogenize up to 24 of your toughest samples (mouse femur, skin, cartilage, tumor, etc.) in just minutes. Air cooling™ minimizes sample heat up. Uses 1.5ml screw-cap RINO® tubes or snap-cap Eppendorf® Safe-lock™ tubes.
Germinator 500 Electron Microscopy Sciences 66118-10 The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be
used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for
traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine
sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been
designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211.
Heracell 150i CO2 Incubator Thermo Scientific 51026282 Single 150L
IVIS Lumina X5 Imaging System Perkin Elmer CLS148590 The IVIS Lumina X5 high-throughput 2D optical imaging system combines high-sensitivity bioluminescence and fluorescence with high-resolution x-ray into a compact system that fits on your benchtop. With an expanded 5 mouse field of view for 2D optical imaging plus our unique line of accessories to accelerate setup and labeling, it has never been easier or faster to get robust data—and answers—on anatomical and molecular aspects of disease.
MAXQ 4450 Digtial Incubating Bench Shaker Thermo Scientific SHKE4450 Shaker, Incubated; Thermo Scientific; Digital; MaxQ 4450; Speed 15 to 500rpm +/-1rpm; 5 deg. C above ambient to 80 deg. C; 120V 50/60Hz
PBS, Phosphate Buffered Saline Fisher Bioreagents BP24384 PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4
Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated Thermo Scientific 75002436 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid
SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge Thermo Scientific 75004261 Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz
Staphylococcus aureus - Xen36 Perkin Elmer 119243 Staphylococcus aureus - Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid.
TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V Heidolph Tuttnauer 23210401 Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls
Tween 80 Fisher Bioreagents BP338-500 Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction
Vortex mixer VX-200 Labnet Internation S0200 120V touch or continuous mixer, 230V: 0 - 2,850 rpm,120V: 0 - 3,400 rpm
0.9% Sodium Chloride Pfizer Injectables/Hospira 00409-4888-10 0.9% Sodium Chloride Injection, USP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of neutrophils in experimental septicemia and septic arthritis induced by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 65 (7), 2517-2521 (1997).
  2. Fang, A., Hu, S. S., Endres, N., Bradford, D. S. Risk factors for infection after spinal surgery. Spine. 30 (12), Phila Pa. 1460-1465 (2005).
  3. Levi, A. D., Dickman, C. A., Sonntag, V. K. Management of postoperative infections after spinal instrumentation. Journal of Neurosurgery. 86 (6), 975-980 (1997).
  4. Weinstein, M. A., McCabe, J. P., Cammisa, F. P. Postoperative spinal wound infection: a review of 2,391 consecutive index procedures. Journal of Spinal Disorders. 13 (5), 422-426 (2000).
  5. Picada, R., et al. Postoperative deep wound infection in adults after posterior lumbosacral spine fusion with instrumentation: incidence and management. Journal of Spinal Disorders. 13 (1), 42-45 (2000).
  6. Smith, J. S., et al. Rates of infection after spine surgery based on 108,419 procedures: a report from the Scoliosis Research Society Morbidity and Mortality Committee. Spine. 36 (7), Phila Pa. 556-563 (2011).
  7. Abbey, D. M., Turner, D. M., Warson, J. S., Wirt, T. C., Scalley, R. D. Treatment of postoperative wound infections following spinal fusion with instrumentation. Journal of Spinal Disorders. 8 (4), 278-283 (1995).
  8. Silber, J. S., et al. Management of postprocedural discitis. Spine Journal. 2 (4), 279-287 (2002).
  9. Pappou, I. P., Papadopoulos, E. C., Sama, A. A., Girardi, F. P., Cammisa, F. P. Postoperative infections in interbody fusion for degenerative spinal disease. Clinical Orthopaedics and Related Research. 444, 120-128 (2006).
  10. Sampedro, M. F., et al. A biofilm approach to detect bacteria on removed spinal implants. Spine. 35 (12), Phila Pa. 1218-1224 (2010).
  11. Pull ter Gunne, A. F., Mohamed, A. S., Skolasky, R. L., van Laarhoven, C. J., Cohen, D. B. The presentation, incidence, etiology, and treatment of surgical site infections after spinal surgery. Spine. 35 (13), Phila Pa. 1323-1328 (2010).
  12. Olsen, M. A., et al. Risk factors for surgical site infection in spinal surgery. Journal of Neurosurgery. 98, 2 Suppl 149-155 (2003).
  13. Ofluoglu, E. A., et al. Implant-related infection model in rat spine. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 127 (5), 391-396 (2007).
  14. Guiboux, J. P., et al. The role of prophylactic antibiotics in spinal instrumentation. A rabbit model. Spine. 23 (6), Phila Pa. 653-656 (1998).
  15. Stavrakis, A. I., et al. Current Animal Models of Postoperative Spine Infection and Potential Future Advances. Frontiers in Medicine (Lausanne). 2, 34 (2015).
  16. Pribaz, J. R., et al. Mouse model of chronic post-arthroplasty infection: noninvasive in vivo bioluminescence imaging to monitor bacterial burden for long-term study. Journal of Orthopaedic Research. 30 (3), 335-340 (2012).
  17. Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS One. 5 (9), 12580 (2010).
  18. Niska, J. A., et al. Monitoring bacterial burden, inflammation and bone damage longitudinally using optical and muCT imaging in an orthopaedic implant infection in mice. PLoS One. 7 (10), 47397 (2012).
  19. Francis, K. P., et al. Monitoring bioluminescent Staphylococcus aureus infections in living mice using a novel luxABCDE construct. Infection and Immunity. 68 (6), 3594-3600 (2000).
  20. Dworsky, E. M., et al. Novel in vivo mouse model of implant related spine infection. Journal of Orthopaedic Research. 35 (1), 193-199 (2017).
  21. Hegde, S. S., et al. Activity of telavancin against heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) in vitro and in an in vivo mouse model of bacteraemia. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 65 (4), 725-728 (2010).
  22. Crandon, J. L., Kuti, J. L., Nicolau, D. P. Comparative efficacies of human simulated exposures of telavancin and vancomycin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus with a range of vancomycin MICs in a murine pneumonia model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (12), 5115-5119 (2010).
  23. Reyes, N., et al. Efficacy of telavancin in a murine model of bacteraemia induced by methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 58 (2), 462-465 (2006).
  24. Sakoulas, G., Eliopoulos, G. M., Alder, J., Eliopoulos, C. T. Efficacy of daptomycin in experimental endocarditis due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (5), 1714-1718 (2003).
  25. Hu, Y., et al. Combinatory antibiotic therapy increases rate of bacterial kill but not final outcome in a novel mouse model of Staphylococcus aureus spinal implant infection. PLoS One. 12 (2), 0173019 (2017).
  26. Poelstra, K. A., Barekzi, N. A., Grainger, D. W., Gristina, A. G., Schuler, T. C. A novel spinal implant infection model in rabbits. Spine. 25 (4), Phila Pa. 406-410 (2000).

Tags

Spinal İmplant Enfeksiyonu Fare Modeli In Vivo Terapötikler Tedavi Stratejileri Posterior Yaklaşım Omurga Cerrahisi Biyolüminesan Suş Staphylococcus Aureus Xen36 Bakterileri Biyolüminesans Görüntüleme Bakteri Yükü İmplant Çevresi Doku Koloni Oluşturan Birimler (CFU'lar) Hayvan Modelleri

Erratum

Formal Correction: Erratum: In vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection
Posted by JoVE Editors on 05/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: In vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection. The Authors section was updated from:

Benjamin V. Kelley1
Stephen D. Zoller1
Danielle Greig1
Kellyn Hori1
Nicolas Cevallos1
Chad Ishmael1
Peter Hsiue1
Rishi Trikha1
Troy Sekimura2
Thomas Olson2
Ameen Chaudry2
Michael M. Le2
Anthony A. Scaduto1
Kevin P. Francis1
Nicholas M. Bernthal1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles
2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

to:

Benjamin V. Kelley1
Christopher Hamad1
Stephen D. Zoller1
Danielle Greig1
Zeinab Mamouei1
Rene Chun1
Kellyn Hori1
Nicolas Cevallos1
Chad Ishmael1
Peter Hsiue1
Rishi Trikha1
Troy Sekimura2
Brandon Gettleman3
Autreen Golzar2
Adrian Lin2
Thomas Olson2
Ameen Chaudry2
Michael M. Le2
Anthony A. Scaduto1
Kevin P. Francis1
Nicholas M. Bernthal1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles
2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles
3University of South Carolina School of Medicine, University of South Carolina

Spinal İmplant Enfeksiyonunun İn Vivo Fare Modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelley, B. V., Hamad, C., Zoller, S. … More

Kelley, B. V., Hamad, C., Zoller, S. D., Greig, D., Mamouei, Z., Chun, R., Hori, K., Cevallos, N., Ishmael, C., Hsiue, P., Trikha, R., Sekimura, T., Gettleman, B., Golzar, A., Lin, A., Olson, T., Chaudry, A., Le, M. M., Scaduto, A. A., Francis, K. P., Bernthal, N. M. In Vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection. J. Vis. Exp. (160), e60560, doi:10.3791/60560 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter