Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para medir rapidamente e facilmente o fator nuclear kappa-light-chain-enhancer de células B ativadas (NF-κB) ativação em linhas celulares expressando NF-κB::luciferase repórter constrói, através de medições de luminescência no lysate celular. Além disso, a expressão gênica é determinada via RT-qPCR isolada de células infectadas com Salmonella Typhimurium.
Abstract
O fator dimeric da transcrição NF-κB regula muitos caminhos celulares da resposta, incluindo caminhos inflamatórios induzindo a expressão de várias citocinas e chemokines. NF-κB é constitutivamente expresso e é seqüestrado no citosol pelo fator nuclear de proteína inibitiva do potenciador de genes de polipeptídeos leves kappa no inibidor de células B, alfa (IκBα). A ativação do NF-κB requer a degradação do IκBα, que então expõe um sinal de localização nuclear no NF-κB e promove seu tráfico para o núcleo. Uma vez no núcleo, nf-κb liga-se à região promotor de NF-κB alvo genes como interleucina 6 (IL-6) e IL-23, para promover a sua expressão.
A ativação do NF-κB ocorre independentemente da transcrição ou tradução. Portanto, o estado de ativação do NF-κB deve ser medido por quantificar nf-κB especificamente no núcleo, ou por quantificar a expressão de NF-κB alvo genes. Neste protocolo, as células evigoradas com um NF-κB::luciferase repórter construir são auplado para nf-κb ativação usando in vitro tecido cultura técnicas. Essas células estão infectadas com Salmonella Typhimurium para ativar nf-κb, que trafica para o núcleo e se liga a κB sites na região promotor a luciferase, induzindo a sua expressão. As células são lysed e analisados com o sistema de ensaio luciferase. A quantidade de luciferase produzida pelas células correlaciona-se com a intensidade do sinal de luminescência, que é detectado por um leitor de placas. O sinal de luminescência gerado por este procedimento fornece um método rápido e altamente sensível pelo qual avaliar a ativação nf-κB uma série de condições. Este protocolo também utiliza a transcrição reversa quantitativa PCR (RT-qPCR) para detectar níveis relativos de mRNA que são indicativos de expressão gênica.
Introduction
A família de proteínas fator-κB nuclear (NF-κB) são importantes ativadores de transcrição que regulam a expressão gênica em várias vias biológicas. A ativação do NF-κB induz a transcrição de genes-alvo, muitos dos quais são importantes para respostas imunes e inflamatórias, proliferação celular, respostas ao estresse e progressão do câncer1,2. NF-κB desempenha um papel integral na mediação dos primeiros resultados inflamatórios para a desminagem de patógenos. Dado os muitos processos biológicos mediados pela ativação nf-κB, interrupções em sua sinalização podem ter sérias conseqüências para a saúde e doença. A perda de mutações de função na sinalização NF-κB está associada em vários fenótipos de deficiência imunológica, enquanto o ganho de mutações de função está associado a vários tipos de cânceres, incluindo linfomas de células B e câncer de mama3. Além disso, muitos patógenos têm demonstrado modular diretamente o estado de ativação do NF-κB através da expressão dos fatores de virulência4,5,6,7.
A ativação do NF-κB é conhecida por ser uma conseqüência de muitos estímulos variáveis, incluindo produtos bacterianos, como lipopolissacarídeos (LPS), flagenina e peptidoglicans conhecidos como padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs). Esses PAMPs são detectados por receptores de reconhecimento de padrões (PRRs), como os receptores semelhantes a pedágios (TLRs) e receptores semelhantes ao Nod (NLRs), levando à ativação do NF-κB e à expressão subsequente de uma matriz de genes inflamatórios dependentes de NF-κB8. Além da ativação da RPR por PAMPs, outros produtos bacterianos, como proteínas efívoras, podem induzir a ativação do NF-κB. Curiosamente, as bactérias também expressam proteínas efetivas que atenuam ativamente a via NF-κB e aumentam sua patogenicidade, ressaltando a importância da NF-κB como mediador essencial da imunidade9.
Existem cinco subunidades diferentes que formam os dimers NF-κB; p50, p52, RelA (p65), RelB e cRel. Os dois principais heterodimers NF-κB são o p50:RelA e o p52:RelB dimers. Os dimers nf-κb ativados ligam-se a locais de DNA, conhecidos como locais de κB, nas regiões promotoras e potenciadoras de vários genes-alvo. Em condições homeostáticas normais, nf-κb interage com uma família de proteínas inibidoras conhecidas como proteínas IκB para permanecer inativo. Após a estimulação, iκB é fosforilado por IκB Kinase (IKK), que permite que ele seja alvo de ubiquitinação e, posteriormente, degradação. Degradação do IκB ativa NF-κB, revelando um sinal de localização nuclear. NF-κB, em seguida, translocaliza para o núcleo, onde liga locais κB na região promotor de genes-alvo e promover a transcrição10. Assim, a ativação do NF-κB regula a expressão de mRNA de genes-alvo NF-κB, e essa mudança pode ser medida através de ensaios de quantificação de RNA, como RT-qPCR11.
Vários métodos existem e são comumente usados para a medição da ativação nf-κb, incluindo ensaios de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA), translocação nuclear e ensaios de repórters genéticos. A EMSA é usada para detectar complexos proteicos com ácidos nucleicos. As células estimuladas são fracionadas para isolar proteínas nucleares, incluindo o NF-κB translocado, que é então incubado com nucleotídeos radiografados contendo o domínio de ligação NF-κB. As amostras são executadas em um gel e imagemdas por autoradiografia de 32ácidos nucleicos p-etiquetados. Se nf-κb está presente na fração de proteína, ele vai ligar os nucleotídeos, que migrará mais lento através do gel e presente como bandas discretas. Frações nucleares de células sem NF-κB ativado (por exemplo, células de controle não estimuladas) não produzirão bandas à medida que os nucleotídeos migrarem mais rápido para o final do gel. Uma grande desvantagem deste método é que ele é em grande parte quantitativo no sentido binário (ou seja, dentro ou fora) e não captura adequadamente diferenças significativas na capacidade de ligação NF-κB. Além disso, este método não considera estruturas de cromatina que são funcionalmente importantes para os genes-alvo NF-κB12,13.
Semelhante ao método anterior, há um ensaio "não-turno", no qual placas multi-poço são revestidas com nucleotídeos contendo a seqüência de ligação NF-κB. Após o tratamento de células com frações nucleares de proteína, NF-κB vai ligar-se aos nucleotídeos ligados ao poço. Os anticorpos anti-NF-κB são então adicionados, que interagirão com o NF-κB vinculado e produzirão um sinal colorimétrico proporcional à quantidade de NF-κB, indicando o grau de ativação nf-κB. Este método é vantajoso sobre o EMSA na medida em que não requer ácidos nucleicos radiorotulados e é quantitativo, em comparação. No entanto, uma ressalva deste método é que ele novamente não diferencia entre os estados de cromatina de NF-κB alvo genes14.
Outro método pelo qual a ativação nf-κb pode ser detectada é por imunoprecipitação de cromatina (ChIP), pelo qual o DNA e as proteínas interagindo estão interligados com formaldeído e imunoprecipitado com anticorpos específicos anti-NF-κB. Os fragmentos específicos do nucleotídeo são então purificados e identificados através da amplificação do PCR ou do sequenciamento de alta transferência direta. Os resultados gerados a partir deste método fornecem resultados semiquantitativos da atividade de ligação NF-κB com genes-alvo. No entanto, os resultados são altamente dependentes das condições de fixação e dos processos de purificação em cada etapa15.
Em ensaios de translocação nuclear, as células são estimuladas a induzir a ativação nf-κb e, em seguida, corrigido. Os anticorpos anti-p65 são adicionados às células fixas. Alternativamente, o subunidade p65 em si pode ser marcado com um peptídeo fluorescente, como verde fluorescente verde (GFP). Em ambos os casos, a imunofluorescência permitirá que a imagem latente da localização do p65 determine a distribuição celular. Medindo a proporção de proteína localizada citossólica e nuclear, os investigadores podem determinar o estado relativo de ativação do NF-κB. Uma desvantagem deste método é que a imunofluorescência é comparativamente demorada, requer anticorpos caros e precisa de experiência técnica relativamente maior16.
Genes de repórter são ferramentas comumente usadas para estudar os padrões regulatórios e de expressão de um gene de interesse. Tipicamente, os genes do repórter são construídos da seqüência do promotor de um gene do interesse fundido a uma codificação do gene para uma proteína facilmente detectável. Proteínas com atividades enzimáticas, fluorescência ou propriedades de luminescência são comumente escolhidas por sua capacidade de serem assumidas e quantificadas. Assim, a leitura (por exemplo, luminescência, fluorescência) serve como um sinal para a detecção da expressão gênica. Estas construções do repórter podem então ser introduzidas em tipos diferentes da pilha, tais como pilhas epiteliais ou macrófagos.
Descrito no protocolo é o uso de uma linha de células HeLa clonada (HeLa 57A) que é evigorada mente transfeccionada com um repórter lúciferase contendo três cópias do consenso κB da imunoglobulina tradi-chain promotor região17. A expressão de luciferase depende da ativação do NF-κB, que ocorre após a estimulação celular. As células estimuladas são facilmente lysed usando tampão de lyse celular fornecido no kit de ensaio luciferase. Uma parte do lysate celular é então misturada com tampão de ensaio luciferase que contém luciferino. Luciferin é o substrato de lúciferase e é necessário para a geração de luz na presença de lúciferase. Depois de combinar o amortecedor de ensaio com o liceu, a solução emitirá luz em um processo conhecido como luminescência. A quantidade de luz produzida, dada em lumens, é proporcional à quantidade de lúciferase presente no lysate e serve como medida de ativação nf-κB. As leituras do lúmen são interpretadas em comparação com um padrão não estimulado para dar conta da atividade de linha de base NF-κB e o sinal em si é estável por vários minutos para permitir uma medição confiável. Além disso, a linha celular HeLa 57A está evigorada com um repórter independente de NF-κB β-galactosidase. O repórter β-galactosidase é expresso constitutivamente, e a atividade β-galactosidase pode ser medida para controlar a viabilidade celular ou variação nos números celulares17. Os valores de luciferase podem então ser ajustados aos valores β-galactosidase e relatados como aumento da dobra sobre as células de controle não estimuladas.
Como o NF-κB é um fator de transcrição responsável pelo aumento da expressão de genes-alvo dependentes de NF-κB, um experimento de acompanhamento para controlar o aumento da expressão gênica dependente de NF-κB é a reação quantitativa em cadeia de transcrição reversa ( RT-qPCR). RT-qPCR é um método altamente sensível pelo qual as mudanças na expressão gênica podem ser quantificadas ao longo de várias ordens de magnitude. Células estimuladas e de controle são colhidas para RNA através da extração fenol-clorofórmio. Após a separação de fase, o RNA é extraído como o principal componente da camada aquosa. RNA é então precipitado e lavado para produzir uma pelota pura. Esta pelota é então reconstituída e ainda mais limpa de DNA contaminante através do tratamento do DNAse. O RNA puro é então transcrito reverso para criar DNA complementar (CDNA). Este CDNA pode então ser analisado através de técnicas quantitativas de PCR, onde a abundância de uma sequência específica de mRNA é quantificada para determinar a expressão gênica. Esta técnica não elucida o controle translacional, a modificação pós-translacional, a abundância de proteínas ou a atividade proteica. No entanto, muitos genes, particularmente aqueles envolvidos em processos pró-inflamatórios, são regulados via NF-κB e sua abundância de mRNA é indicativa de sua expressão.
O método proposto aqui utiliza uma maneira rápida e simples pela qual a ativação NF-κB pode ser detectada através de ensaios de luminescência de lisoza celular. RT-qPCR de NF-κB expressão gênica alvo pode ser usado para quantificar a expressão de genes particulares, bem como validar a atividade funcional da ativação NF-κB. As principais vantagens de tal sistema são sua simplicidade e velocidade, o que permite a triagem de alta produtividade de uma série de condições que modulam a ativação nf-κB. Este protocolo é adequado para outras linhas celulares expressando um NF-κB::luciferase repórter, e tem sido demonstrado em evigorados RAW264.7 células18. A quantidade de tempo necessária para lidar com amostras, a partir de lyse celular para gerar um sinal de luminescência, é mínima e leva o espaço de cerca de uma hora. A medição do NF-κB requer apenas equipamentos básicos de laboratório, como placas opacas, um leitor de placas capaz de medir a luminescência e um software simples de análise de dados, como um programa de planilha.
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Protocol
1. Passaging e semeadura da pilha
- Mantenha as células HeLa 57A em um frasco de 75 cm2 contendo 10 mL da mídia eagle modificada de Dulbecco (DMEM) complementada com 5% de calor inativado soro bovino fetal (FBS) em 37 °C em uma incubadora de 5% CO2.
- Aspirate mídia cultura celular e lavar com 1 mL de 0,05% solução trypsin-EDTA. Aspirate trypsin e substituir por um adicional de 1 mL. Coloque o frasco em uma incubadora de 37 °C por 4-5 min para permitir que as células se separam do frasco.
- Adicione 9 mL de mídia de cultura celular e lave suavemente o fundo do frasco algumas vezes para desalojar as células e formar uma suspensão homogênea.
- Diluir as células HeLa 57A 1:6 ou 1:8 em novas mídias e sementes em novos frascos. Células de passagem quando são 90% confluent ou a cada três dias e manter as células em um mínimo de 25% de confluência.
- Um dia antes da estimulação celular, trippsinizar células HeLa 57A e suspender em 10 mL de mídia de crescimento. Conte as células em suspensão usando um hemocytometer e use mídia de crescimento para diluir as células a uma concentração final de 2,5 x 105 células/mL em um tubo cônico de 50 mL.
- Transfira 250 μL de suspensão celular (~6.25 x 104 células) para cada poço de uma placa de 48 poços. Periodicamente tampa e virar o tubo cônico para garantir uma suspensão celular homogênea. Toque na placa suavemente ao lado para garantir que as células distribuam uniformemente nos poços.
- Transfira a placa para 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2 e permita que as células se anexem e cresçam durante a noite.
2. Preparação de bactérias
- Dois dias antes da infecção, raia estoques congelados de Salmonella em placas de ágar LB para produzir colônias individuais. Transfira placas para uma incubadora fixada em 37 °C e permita o crescimento noturno.
- Um dia antes da infecção, adicione 3 mL de caldo de lysogeny (LB) para tubos de cultura bacteriana estéril, adicionando os antibióticos adequados para a mídia.
- Usando um loop de inoculação estéril, escolha uma única colônia de culturas bacterianas listradas e toque o laço para a mídia LB. Tampe os tubos após a inoculação e descarte o laço.
- Coloque os tubos em uma incubadora tremendo situada em 37 °C, 180 rpm, e deixe crescer durante a noite.
- No dia da infecção, recuperar culturas bacterianas durante a noite da incubadora.
- Prepare tubos para a subcultura, adicionando 3 mL de LB fresco, contendo antibióticos quando apropriado.
- Transfira 30 μL da cultura bacteriana durante a noite (1 em 100 diluição) para a mídia recém-preparada. Coloque os tubos em uma incubadora tremendo fixado em 37 °C para 3 h.
- Após a incubação de 3 h, transfira 1 mL de caldo LB estéril para um cuvette de plástico para servir como o espaço em branco. Transfira 900 μL de LB para as outras cuvettes para serem usadas para a análise da amostra.
- Transfira 100 μL de subcultura bacteriana em um cuvette contendo 900 μL de LB e pipeta para cima e para baixo várias vezes para misturar. Repita isso para cada suspensão bacteriana.
- Ligue o espectrômetro para medir a densidade óptica (OD) das culturas bacterianas em um comprimento de onda de 600 nm (OD600).
- Coloque o espaço em branco no espectrômetro. Tome nota da orientação, pois deve haver uma marca para o topo indicando tal.
- Feche a tampa e pressione o botão Em branco no espectrômetro para obter a absorção de fundo.
- Substitua o cuvette em branco por uma amostra de cuvette na mesma orientação e pressione Leia.
- Registre os600 valores da OD dessas amostras. Multiplique o valor por 10 para dar conta do fator de diluição.
- Diluir a subcultura bacteriana com LB fresco para alcançar um valor de absorção de aproximadamente 1,0, que corresponde aproximadamente com 1 x 109 cfu/mL. Diluir esta suspensão 1:10 em um cuvette e medir a absorção - que deve dar um valor de ~ 0,1.
- Em um novo tubo, adicione um volume apropriado da subcultura diluída para LB fresco para alcançar uma suspensão de 1 x 108 cfu/mL para ser usado como um inóculo.
- Prepare diluições em série do inóculo transferindo 50 μL de suspensão bacteriana para um tubo contendo 450 μL de PBS estéreis (diluição de 10 vezes) até que uma diluição final de aproximadamente 102 cfu/mL seja feita.
- Transfira 100 μL das duas diluições mais baixas (102 e 103 correspondentes a 10 e 100 unidades formadoras de colônias, respectivamente) para uma placa de ágar LB e espalhe a suspensão com um propagador de células para obter colônias individuais. Transfira estas placas para uma incubadora de 37 °C e incubada durante a noite.
- No dia seguinte, conte as colônias e calcule a concentração bacteriana do inóculo inicial para determinar a concentração real de inóculos.
3. Infecção das células
NOTA: Neste ponto, as células devem estar em cerca de 90% de confluência. Para as células HeLa 57A em uma placa de 48 poços, isso é aproximadamente 1 x 105 células por poço. As células serão infectadas com multiplicidade de infecção (MOI) de 10, ou 106 cfu/well.
- Rotular a tampa da placa de acordo com as condições de infecção que serão utilizados para cada poço, com cada condição a ser feito em triplicado.
- Adicione 10 μL do inóculo aos poços apropriados. Adicione 10 μL de LB estéril a poços de controle não infectados.
- Para sincronizar o tempo da infecção, coloque a placa em uma centrífuga de mesa e gire a 500 x g por 5 min, garantindo que a placa seja compensada.
- Transfira células infectadas para uma incubadora de 5% de CO2 a 37 °C por 1 h.
- Coloque um alibato de mídia de cultura celular em um banho de água de 37 °C para uso na próxima etapa.
- Uma hora após o tempo de infecção, remover a mídia de cultura celular do banho de água e limpar o exterior com 70% de etanol. Transferir placa de cultura de tecido saquear o armário de biossegurança.
- Usando técnica estéril, aspirate mídia de poços e substituir por 250 μL de fresco, mídia cultura de células quentes.
- Placas de retorno para a incubadora de 5% de CO2 a 37 °C para 4 h adicionais.
- Retire as placas da incubadora de CO2 e aspirar a mídia dos poços. Para a análise luciferase continuar a passo 4.1. Para o isolamento do RNA, vá para o passo 5.1.
4. Análise Luciferase
- Adicione 100 μL de 1x célula lysis buffer para os poços. O amortecedor pode precisar de primeiramente ser diluído a uma concentração de funcionamento, dependendo do reagent.
- Transfira a placa para um congelador de -80 °C e incubapor por pelo menos 30 min para garantir a lyse celular eficiente.
- Coloque a placa contendo lysate de células congeladas em um banco para descongelar e preparar reagentes de substrato luciferase de acordo com as recomendações do fabricante.
- Permita que os reagentes do substrato luciferase equilibrem-se à temperatura ambiente.
- Ligue o leitor de placas e abra o programa de leitor correspondente. Defina a máquina para medir a luminescência.
- Transfira 10 μL de cada amostra para um poço de uma placa opaca de 96 poços.
- Adicione 50 μL do Luciferase Assay Reagent usando uma pipeta multicanal para cada poço da placa opaca.
- Toque suavemente a placa do lado para misturar poços e garantir que a superfície inferior é coberta com líquido. Coloque a placa em um leitor de placa e iniciar a leitura.
- Copie os valores de luminescência em um programa de planilha e trace os resultados.
5. Isolamento rna
- Adicione 500 μL de guanidium tiacianato a cada poço e pipeta para cima e para baixo várias vezes para garantir a lyse completa.
- Transfira o conteúdo para um tubo de microcentrífuga rotulado. Mantenha amostras no gelo, tanto quanto possível para manter a qualidade do RNA.
- Defina uma centrífuga de mesa para 4 °C e mantenha a centrífuga a esta temperatura para o restante do protocolo.
- Para cada tubo de amostra, adicione 100 μL de clorofórmio, tampa firmemente, e agite por 15 s. Incubar à temperatura ambiente por 10 min.
- Centrífuga a 12.000 x g por 15 min a 4 °C. Durante este tempo, prepare-se para a próxima etapa da purificação de RNA, rotulando novos tubos.
- Transfira a fase aquosa superior para o novo tubo contendo 250 μL de isopropanol, tomando cuidado para não perturbar as camadas média ou inferior.
- Armazenar produto não utilizado em um congelador -80 °C, que também pode ser usado para análise de proteínas. A camada aquosa residual também pode servir como um backup se o RNA for necessário mais tarde.
- Vortex a mistura de camada aquosa e isopropanol e permitir que as amostras para sentar-se à temperatura ambiente por 10 min.
- Centrífugas as amostras a 12.000 x g por 10 min a 4 °C.
- Retire os tubos da centrífuga. O precipitate do RNA dá forma a uma pelota branca no lado e na parte inferior do tubo. Abra os tubos e retire cuidadosamente o supernatant derramando para fora em um recipiente waste.
- Lave a pelota de RNA adicionando 500 μL de 75% de etanol e vórtice.
- Centrífuga a 8.000 x g por 5 min a 4 °C.
- Retire o supernatant derramando e novamente lave a pelota com 75% de etanol.
- Centrífuga a 8.000 x g por 5 min a 4 °C.
- Usando uma pipeta de pequeno volume (por exemplo, 10-200 μL volume), aspirar o máximo de supernatant possível, tomando cuidado para não empurrar qualquer líquido de volta para o tubo ou desalojar a pelota com a ponta da pipeta. Se a pelota se desalojar, a centrífuga brevemente e novamente tentar remover supernatant.
- Secar as pelotas de RNA. Se as pelotas são visíveis para qualquer amostra, periodicamente (a cada 5 minutos) verificar sobre eles para ver se eles mudam de branco para claro, indicando que eles estão secos. Uma vez que as pelotas começam a ficar claras, adicione 20 μL de água ultrapura e livre de RNase para dissolver o RNA.
- Se as pelotas não eram inicialmente visíveis para quaisquer amostras, basta adicionar água ultrapura 5 min após a remoção de supernatant.
- Para aumentar a solubilidade, passe a solução algumas vezes através de uma ponta de pipeta e incubar por 10 minutos a 55-60 °C.
6. Tratamento de DNA de RNA
- Para manter a integridade do RNA, guarde amostras de RNA no gelo, a menos que indicado de outra forma. Neste momento, o tampão de DNase 10x pode ser removido do congelador e autorizado a descongelar no gelo.
- Prepare o espectrômetro para análise de amostras limpando todas as superfícies de análise de amostras com um pano livre de fiapos.
- Faça uma medida de fundo antes da análise. Para isso, carregue o sensor com 1,5 μL da mesma água ultrapura usada para dissolver as pelotas de RNA. Pressione o botão Leia em branco para gerar uma leitura de fundo.
- Use o pano livre de fiapos para limpar a superfície de carregamento da amostra do instrumento. Repita esta etapa após cada leitura da amostra.
- Load 1.5 μL de RNA resuspendido para o titular da amostra e selecione Amostra leia. Repita até que todas as amostras tenham sido lidas.
- Prepare a mistura mestra de DNase combinando 2,4 μL de buffer de DNase 10x e 1 μL de DNAse, por amostra, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Prepare a mistura principal para dois volumes extras.
- Misture a mistura mestre, sacudindo o tubo várias vezes. Brevemente centrífuga do tubo para coletar conteúdo na parte inferior do tubo. Adicione 3,4 μL de mastermix a 20 μL de amostra de RNA. Misture o conteúdo por flicking e centrífuga brevemente, como antes.
- Transfira as amostras para um bloco de calor fixado em 37 °C por 20 min. Retire o reagente de inativação de DNase do congelador e descongele à temperatura ambiente.
- 20 min depois de colocar amostras no bloco de calor, transferir as amostras para um rack de tubo colocado no banco de trabalho.
- Vortex delicadamente o índice do reagent da inativação do DNase. Transfira 2,6 μL de reagente de inativação de DNase para os tubos contendo RNA e, em seguida, agite os tubos para criar uma mistura homogênea.
- Centrífuga s amostras a 12.000 x g por 1 min.
- Cuidadosamente pipeta o supernatant para um novo tubo, rotulado.
7. Transcrição reversa de mRNA para cDNA
- Prepare uma mistura mestra dependendo da quantidade de amostras mais duas extras para contabilizar a perda através de pipetting (Tabela 1). Use 1 μg de RNA e adicione H2O a um volume de 50 μL total.
| Reagente | Volume (μL) | Concentração final |
| MgCl2 (25mM) | 3.5 | 1,75 mM |
| Tampão de transcrição reversa (10x) | 5 | 1x 1x 1x |
| dNTP mix (10 μM, cada) | 2.5 | 500 nm |
| hexamer aleatório (100 μM) | 1.25 | 2,5 μM |
| Transcrição reversa multiscribe (50 U/μL) | 1 | 1 U/μL 1 U/μL |
| Inibidor de RNase (20 U/μL) | 1.25 | 1.25 U/μL 1.25 U/μL |
| RNA (1 μg) | 20 ng/uL 20 ng/uL | |
| H2O | completar até 50 |
Tabela 1: Componentes e receita para mistura mestre de transcrição reversa.
- Tampe as amostras firmemente e rotule os tubos PCR no lado, pois os rótulos na tampa podem ser removidos da tampa aquecida do termociclor mais tarde. Misture por vórtice.
- Brevemente centrífuga os tubos PCR para coletar amostras para o fundo do tubo.
- Coloque os tubos PCR em um termocicloe e executar as amostras as seguintes configurações:
25 °C por 10 min, 48 °C por 30 min, 95 °C por 5 min, e depois segurar a 10 °C. - Transfira tubos contendo cDNA recém-sintetizado para um freezer de -20 °C ou uso imediatamente na análise qPCR.
8. Placa de preparação e carregamento para análise rt-qPCR
- Antes de começar, planeje a configuração da placa qPCR de 384 poços para análise de amostras.
- Descongelar primers e cDNA no gelo.
- Prepare uma mistura mestre (ver Tabela 2), além de aproximadamente 10% extra para responder pela perda através de pipetting.
| Reagente | Volume (μL) |
| 10 μM F primer 10 μM F primer | 1 |
| 10 μM R primer 10 μM R primer | 1 |
| Ultrapure H2O | 4 |
| 2x SYBR verde | 10 |
Tabela 2: Componentes e receita para a mistura mestra qPCR.
- Vortex a mistura mestre e dispensar 8 μL nos poços da placa de 384 poços usando uma pipeta repetidor. As amostras serão analisadas em duplicata para cada combinação de amostra de primer e cDNA.
- Usando uma pipeta P10 (ou menor), transfira 2 μL de cDNA para duplicar poços para cada cartilha definido para ser analisado. Substitua dicas após cada poço para evitar contaminação cruzada.
- Selar a placa aplicando cuidadosamente o filme adesivo à superfície, garantindo que todos os poços são cobertos. Pressione o filme usando uma raquete de vedação ou rolo para selar firmemente.
- Coloque a placa em uma centrífuga, com uma placa vazia como um contrapeso. Centrífuga a placa a 500 x g por 5 min.
9. Executando o Termociclo para análise qPCR
- Poder no computador e no instrumento pcr em tempo real.
- Abra o software RT-qPCR e selecione novo experimento.
- a guia de configuração, selecione Propriedades experimentais,onde os parâmetros para a execução podem ser definidos.
- Defina o nomeexperiment, que definirá o nome do arquivo e as configurações usadas para armazenar resultados.
- Para a Seleçãode Instrumentos, selecione o instrumento atualmente conectado que estará executando a análise. Selecione o método de execução de CT Comparativo (ΔΔCt).
- Selecione SYBR Green Reagents como o corante de DNA fluorescente para ser usado e Standard como a velocidade da rampa.
- Certifique-se de que a caixa ao lado de Incluir Curva de Derretimento é verificada.
- a guia Define, atribua alvos (ou seja, genes a serem amplificados) e amostras (ou seja, condições experimentais).
- Selecione a guia Assign. Rotular os poços com os alvos e amostras apropriados, pois correspondem ao esquema de carregamento da placa de 384 poços.
- Selecione o método de execução. Use os parâmetros para análise listados em(Tabela 3).
| Mantenha o palco | Estágio PCR | Estágio da curva do derretimento | |||||
| Passo 1 | Passo 2 | Passo 1 | Passo 2 | Passo 1 | Passo 2 | Passo 3 | |
| Temp | 50 °C | 95 °C | 95 °C | 60 °C | 95 °C | 60 °C | 95 °C |
| Tempo | 2:00 | 10:00 | 0:15 | 1:00 | 0:15 | 1:00 | 0:15 |
| Coleta de dados | Sim | Sim | |||||
| Número de ciclos | 1x 1x 1x | 40x 40x | 1x 1x 1x | ||||
Tabela 3: Parâmetros de ciclo para termóspere.
- Coloque a placa de 384 poços no termociclo e inicie a análise.
10. Análise dos resultados qPCR com o Método Delta-Delta Ct (2-ΔΔct)
- Analise os resultados gerados a partir da reação qPCR para erros que podem interferir na análise a jusante. Muitos erros serão sinalizados automaticamente pelo sistema.
- Para primers corretamente construídos, as curvas do derretimento devem somente ter um pico. Exclua todos os poços que contenham uma curva de derretimento com mais de um pico de uma análise mais adicional.
- Exportar os valores ct para um programa de planilha para analisar os dados usando o método ΔΔCt. Um formato sugerido é fornecido(Tabela 4). A última coluna é a mudança de expressão da amostra, em relação às amostras de controle.
| Gene da limpeza(GAPDH) | Gene de interesse (IL6) | ||||||||||
| Ct1 Ct1 | Ct2 Ct2 | Ave Ct | Ct1 Ct1 | Ct2 Ct2 | Ave Ct | Δct Δct | Ave ΔCt ctrls Ave Δct ctrls | ΔΔCt ΔΔct | 2^-(ΔΔCt) | Geomean Geomean | |
| Controle 1 | 15.33 | 15.37 | 15.35 | 26.81 | 26.91 | 26.86 | 11.51 | 10.51 | 1.00 | 0.50 | 1.00 |
| Controle 2 | 16.83 | 16.77 | 16.80 | 26.89 | 26.92 | 26.91 | 10.11 | 10.51 | -0.41 | 1.33 | |
| Controle 3 | 17.56 | 17.53 | 17.54 | 27.38 | 27.56 | 27.47 | 9.93 | 10.51 | -0.59 | 1.50 | |
| Sl1344 1 Sl1344 1 | 15.50 | 15.41 | 15.45 | 22.15 | 22.13 | 22.14 | 6.69 | 10.51 | -3.83 | 14.21 | 13.23 |
| SL1344 2 SL1344 2 | 16.02 | 15.98 | 16.00 | 23.01 | 22.96 | 22.98 | 6.98 | 10.51 | -3.53 | 11.57 | |
| SL1344 3 SL1344 3 | 17.27 | 17.30 | 17.28 | 23.99 | 23.98 | 23.98 | 6.70 | 10.51 | -3.82 | 14.09 | |
| sipA sopB sopE2 1 sipA sopB sopE2 1 | 15.38 | 15.41 | 15.39 | 23.31 | 23.09 | 23.20 | 7.80 | 10.51 | -2.71 | 6.56 | 7.29 |
| sipA sopB sopE2 2 sipA sopB sopE2 2 | 16.01 | 16.05 | 16.03 | 23.89 | 23.92 | 23.91 | 7.88 | 10.51 | -2.64 | 6.23 | |
| sipA sopB sopE2 3 sipA sopB sopE2 3 | 16.78 | 16.78 | 16.78 | 24.02 | 24.06 | 24.04 | 7.27 | 10.51 | -3.25 | 9.49 | |
| sipA sopB sopE2 sopE 1 sipA sopB sopE2 1 | 15.52 | 15.60 | 15.56 | 27.04 | 27.03 | 27.03 | 11.47 | 10.51 | 0.96 | 0.51 | 0.79 |
| sipA sopB sopE2 sopE 2 sipA sopE2 sopE 2 | 15.56 | 15.59 | 15.57 | 26.37 | 26.42 | 26.39 | 10.82 | 10.51 | 0.31 | 0.81 | |
| sipA sopB sopE 2 sopE 3 sipA sopB sopE 2 sopE 3 | 15.91 | 15.92 | 15.91 | 26.24 | 26.12 | 26.18 | 10.27 | 10.51 | -0.25 | 1.19 | |
Tabela 4: Formato para análise de dados qPCR.
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Representative Results
O ensaio descrito aqui centra-se na ativação do fator de transcrição NF-κB usando um repórter luciferase nf-κB-dependente que é evigorado em uma linha de células HeLa. Ativado NF-κB transloca para o núcleo onde liga κB sites de ligação de genes-alvo, incluindo as citocinas pró-inflamatórias IL6 e IL23. Uma visão geral da ativação nf-κb é retratada na Figura 1. A bactéria gram-negativa Salmonella enterica serovar Typhimurium foi utilizada neste estudo como ativadora de NF-κB e expressão subsequente de IL6 (Figura 2). Um dos principais fatores de virulência necessários para a patogênese é o Sistema de Secreção Tipo III-1 (T3SS-1) que permite S. Typhimurium infecta células e induzir a ativação nf-κb. A função do T3SS-1 é entregar proteínas bacterianas, denominados efecionistas, em células hospedeiras. Aqui as proteínas efetivas têm como alvo inúmeras vias de sinalização celular para mediar a invasão de células epiteliais hospedeiras. A ativação NF-κB induzida por S. Typhimurium é principalmente dependente das proteínas efetoras T3SS-1 SopE, SipA, SopB e SopE218. Aqui, as células HeLa 57A foram infectadas com o tipo selvagem S. Typhimurium cepa SL1344 e duas cepas mutantes sem três(SipA, SopB, SopE2) ou quatro(SipA, SopB, SopE2, SopE) proteínas efeticadoras. A Figura 2 é um experimento representativo da ativação de luciferase dependente de NF-κB (Figura 2A)e expressão gênica IL6 (Figura 2B)em células HeLa 57A infectadas com o S. Cepas de Typhimurium. A infecção com a cepa selvagem SL1344 induz um forte sinal de luciferase que é diminuído em células infectadas com o sipa, sopb, sope2 triplo mutante (sope-dependente resposta), e reduzido a níveis de controle com o SipA, SopB, SopE2, SopE quadruple mutante. As unidades relativas de luminescência (RLU) correlacionam-se com os níveis de expressão IL6 (Figura 2). A Figura 3 representa os resultados gerados pela análise rt-qPCR.
Figura 1: Esquemático da ativação nf-κb e leituras a jusante. Descrito acima, NF-κB é mantido no citosol em um estado inativo pela proteína inibidora IκBα. Os estímulos internos e externos podem contribuir para a ativação do IKK, que fosforila tola IκBα e causa sua subsequente degradação proteossômica. A degradação do IκBα revela o sinal de localização nuclear da NF-κB, que promove a translocação. No núcleo, nf-κB ativado se liga a κB locais de ligação de genes-alvo, promovendo sua transcrição e expressão. Genes-alvo, como as citocinas IL6 e IL23,são expressos e quantificados via RT-qPCR. Em HeLa 57A células luciferase é expressa após a ativação NF-κB, que pode ser quantificada através de ensaios de luminescência. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Dados representativos do ensaio de luminescência e análise RT-qPCR após S. Infecção por Typhimurium das células HeLa 57A. 1 x 105 células HeLa 57A foram infectadas com 106 cfu (MOI = 10) da fase de log S. Typhimurium tipo selvagem SL1344, ou as cepas mutantes sem SipA, SopB e SopE2, e SipA, SopB, SopE2 e SopE. Após 1h, a mídia foi substituída, e a incubação continuou por mais quatro horas. (A)As células foram processadas para expressão de luciferase através de ensaios de luminescência. (B) As células foram extraídas de RNA, que foi utilizado para rt-qPCR análise. A expressão relativa de genes-alvo usando o método Delta-delta Ct (2-ΔΔCt)é mostrada. O desvio médio e padrão de poços triplicados é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Resultados sumários gerados pela análise rt-qPCR. (A) Um enredo de amplificação é mostrado para os poços amplificando GAPDH de células HeLa 57A infectadas com S. Typhimurium. (B) O lote da curva do derretimento dos poços que contêm primers de GAPDH mostra um único pico do derretimento que corresponde a aproximadamente 84 °C. (C) Poços duplicados contendo primers para IL-6. Um dos poços exibe um segundo pico de derretimento, como denotado por uma seta preta, e deve ser excluído da análise. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
A principal contribuição do protocolo descrito é que ele fornece um método rápido e fácil para detectar a ativação NF-κB em células, o que permite uma análise de alta taxa de taxa de taxa de múltiplas condições de estímulo ou medicamentos que afetam a ativação nf-κb. Aqui, descrevemos um protocolo para a ativação nf-κb em células HeLa infectadas por Salmonella. Estas pilhas podem ser usadas para a infecção com outros micróbios patogénicos também para estudar o impacto da infecção bacteriana na ativação nf-κB. Além disso, a ativação de luciferase dependente de NF-κB nas células HeLa 57A pode ser usada para rastrear ativadores ou inibidores de vias de sinalização que levam à ativação nf-κB. Aqui, nós semeamos células HeLa 57A em placas de 48 poços, mas esses experimentos podem ser dimensionados até 96 - e até mesmo 384 placas de poço para permitir mais amostras por experimento. As células HeLa 57A expressam sistemamente LacZ, que pode ser medida como um controle interno para o número celular e a viabilidade usando ensaios β-gal. O protocolo descrito aqui é aplicável para uso em linhas celulares, quer de forma evigorada ou transitóriamente transfecída com uma construção de repórter NF-κB::luciferase reporter construct. A linha celular raw264.7 macrófago já foi usada para tal finalidade18. É importante ressaltar que esse método não faz distinção entre ativação dos diferentes homo/heterodimers das cinco subunidades nf-κB distintas. Os diferentes complexos de homo-heterodemer NF-κB têm afinidades diferentes para sequências de promotores, bem como diferentes consequências transcricionais21. É possível que a ativação de um dimer nf-κB específico seja perdida usando o repórter descrito aqui devido à baixa afinidade que liga aos locais de ligação do κB da região de promotora de imunoglobulina.
É importante notar que as condições adequadas para estimular uma linha celular podem não ser diretamente aplicáveis a outra. Portanto, é altamente recomendado que as condições de ensaio sejam otimizadas em cada sistema de ensaio. Tempo de infecção, MOI, duração do tratamento medicamentoso, dose de drogas e condições de semeadura são considerações importantes a serem consideradas ao avaliar a ativação do NF-κB. Por exemplo, raw264.7 macrófagos são mais sensíveis à infecção por salmonella exigindo condições diferentes para produzir um sinal de luminescência semelhante, como visto com células HeLa 57A18.
Durante as medições de luminescência, não é incomum que os poços de borda tenham valores consideravelmente diferentes dos outros poços que foram estimulados da mesma forma. Isto é tipicamente devido às taxas de evaporação mais elevadas dos poços da borda na placa que conduz à concentração aumentada da droga. Isto pode ser endereçado adicionando meios livres do soro ao espaço entre os poços, para as placas que o permitem, alterando combinações da tampa/placa para reduzir a evaporação, ou omitem poços da borda completamente se as edições persistem.
Expresso em células de mamíferos, o vaga-lume de fogo-de-fogo tem uma meia-vida de várias horas e é geralmente considerado estável para os fins da maioria dos ensaios repórter22. Durações de tratamento mais longas do que as descritas aqui podem ser realizadas de forma confiável. No entanto, o sistema de ensaio luciferase usado aqui produz um sinal estável apenas para o primeiro minuto e rapidamente se deteriora depois disso. Portanto, é altamente importante que a medida de luminescência seja feita rapidamente após a mistura de lisato celular e substrato.
NF-κB é um fator de transcrição para uma grande variedade de genes, incluindo citocinas e quimiocinas (ou seja, Il6 e Il23). Medir a atividade luciferase dependente de NF-κB não significa necessariamente que essas citocinas e quimiocinas sejam expressas. Este método pode complementar as técnicas de quantificação molecular existentes, servindo como uma primeira tela potencial para a caracterização das condições que afetam a atividade NF-κB, que pode ser validada funcionalmente através de RT-qPCR. A validação funcional da ativação nf-κb também pode ser realizada através de análise de borrão ocidental ou ensaios funcionais específicos de uma proteína de interesse nos casos em que a quantificação de mRNA pode não ser apropriada. Este é o caso da interleucina-beta (Il1b), um gene cuja transcrição é induzida pela ligação NF-κB, mas o produto proteico requer modificação pós-translacional para formar o produto maduro23,24.
O protocolo específico de isolamento de RNA descrito aqui não é o único que pode ser empregado para uso na análise RT-qPCR, e outros métodos preferidos, como kits comercialmente disponíveis, podem ser usados. É importante notar que a qualidade do RNA é muito importante para o processo e, portanto, o RNA deve ser mantido no gelo, tanto quanto possível para evitar a degradação. É importante executar reações duplicadas nas reações RT-qPCR para verificar se as reações de PCR são consistentes, já que o pipetting de tais pequenos volumes ao carregar a placa de 384 poços muitas vezes pode ser motivo de erro. Os valores do ct do gene da limpeza devem ser consistentes entre amostras, e os desvios deste podem ser indicativos de etapas ineficientes da limpeza ou de discrepâncias em concentrações do RNA durante a transcrição reversa que podem afetar os resultados finais. Também é importante verificar a curva de fusão após cada experimento qPCR. A presença de um pico sugere que as primers qPCR estão amplificando um único gene. Múltiplas curvas sugerem que há amplificação genética fora do alvo ou presença de dimers primer. Em ambos os casos, vários picos presentes na curva de derretimento sugerem que as cartilhadevem ser redesenhadas para garantir a especificidade. Com tanto espaço para variabilidade, exercício e refinamento de boa técnica em cada etapa são essenciais para gerar resultados precisos e reprodutíveis.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
A pesquisa no laboratório Keestra-Gounder é apoiada por doações do NIAID do NIH o prêmio Número R21AI122092 e da Associação Americana de Diabetes o Prêmio Número 1-18-JDF-035.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive film | VWR International | 60941-070 | |
| Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-500 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11665092 | |
| DNAse treatment kit | Qiagen | 79254 | |
| dNTPs | Promega | U1511 | |
| Ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818100 | molecular grade |
| FBS | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| HeLa 57A cells | Ref # 15 | ||
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP26181 | |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | BP906-5 | |
| LB agar | Fisher Bioreagents | BP1425-500 | |
| Lysogeny broth | Fisher Bioreagents | BP1426-500 | |
| MgCl2 | Fisher Chemical | ||
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Scientific | spectrophotometer | |
| Promega luciferase assay system | Promega | E1501 | Cell lysis buffer & luciferin substrate |
| Random Hexamers | Thermo Scientific | SO142 | |
| Real-time GAPDH forward primer | 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3' |
||
| Real-time GAPDH reverse primer | 5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3' |
||
| Real-time IL-23 forward primer | 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3' |
||
| Real-time IL-23 reverse primer | 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3' | ||
| Real-time IL-6 forward primer | 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3' | ||
| Real-time IL-6 reverse primer | 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3' |
||
| Reverse Transcriptase | Applied Biosystems | 4308228 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| RT buffer | Promega | A3561 | |
| SL1344 | Ref # 17 | ||
| SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SYBR green | Applied Biosystems | 4309155 | 2x mastermix |
| Tri-reagent | Molecular Research Center | TR 118 | guanidine thiocyanate |
| Trypsin -EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| Ultrapure water | Fisher Bioreagents | BP248450 | |
| Well plate for PCR | VWR International | 89218-294 | 384-well plate |
References
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