Summary
在这里，我们提出了一个协议，通过测量细胞裂解中的发光，快速、轻松地测量活性B细胞（NF-B）激活细胞系中激活的核因子kappa-光链增强剂：：快星酶报告器结构。此外，基因表达通过从感染沙门氏菌的细胞中分离的RT-qPCR确定。
Abstract
二分体转录因子NF-βB调节许多细胞反应途径，包括通过诱导各种细胞因子和化学因子的表达来引起炎症通路。NF-βB是组织表达的，通过B细胞抑制剂α（I+B+）中的卡帕光多肽基因增强剂的抑制蛋白核因子在细胞溶质中固存。NF-βB的激活需要I+B+的降解，然后它暴露NF-βB上的核定位信号，并促进其向核的贩运。一旦进入细胞核，NF-βB与NF-βB靶基因的介子基因（如白细胞介素6（IL-6）和IL-23）的介动区域结合，以促进其表达。
NF-βB 的激活独立于转录或翻译而发生。因此，NF-βB的激活状态必须通过在核中具体量化NF-βB，或者通过量化NF-βB靶基因的表达来测量。在此协议中，使用NF-βB：：乳酸酶报告器构造的细胞通过体外组织培养技术进行NF-βB激活。这些细胞感染了沙门氏菌，以激活NF-βB，它流到细胞核，并结合在荧光素酶的启动区βB位点，诱导其表达。细胞用荧光素酶测定系统进行分化和分析。细胞产生的荧光素酶量与发光信号的强度相关，发光信号由板读取器检测到。此过程生成的发光信号提供了一种快速且高度敏感的方法，用于评估 NF-+B 在一系列条件下的激活。该协议还利用定量逆转录PCR（RT-qPCR）来检测指示基因表达的相对mRNA水平。
Introduction
核因子-βB（NF-B）系列蛋白质是调节各种生物途径中基因表达的重要转录活化剂。NF-βB的激活诱导靶基因的转录，其中许多基因对免疫和炎症反应、细胞增殖、应激反应和癌症进展1、2都很重要。NF-βB在调解早期炎症结果以清除病原体方面起着不可或缺的作用。鉴于由NF-β-B激活调节的许多生物过程，其信号中断可能会对健康和疾病产生严重后果。NF-βB信号的功能突变的丧失与几种免疫缺陷表型有关，而功能突变的增益与几种癌症有关，包括B细胞淋巴瘤和乳腺癌3。此外，许多病原体已被证明通过表达毒性因子4、5、6、7直接调节NF-βB的激活状态。
NF-βB的激活被认为是许多可变刺激的结果，包括细菌产物，如脂多糖（LPS）、鞭霉蛋白和称为病原体相关分子模式（PAMPs）的肽类。这些PAMP由模式识别受体（PRRs）检测，如收费受体（TPR）和点头样受体（NLRs），导致NF-βB的激活和NF-βB依赖性炎症基因8的后续表达。除了PPP的PRR活化外，其他细菌产物，如细菌效应蛋白，可以诱导NF-βB的活化。有趣的是，细菌还表达有效蛋白，主动衰减NF-βB通路，增强其致病性，强调NF-βB作为免疫9的重要中介的重要性。
有五个不同的子单位，形成NF-βB二聚体;p50，p52，RelA（p65），RelB 和 crel。两个主要的NF-+B杂物是p50：RelA和p52：RelB二聚苯醚。激活的NF-βB二聚体结合各种目标基因的启动子和增强剂区域的DNA位点，称为βB位点。在正常的静息条件下，NF-βB与一系列称为I+B蛋白的抑制剂蛋白相互作用，保持不活性。在刺激时，I+B由I+B基纳斯（IKK）磷酸化，允许其被靶向成泛化，并随后降解。I+B 的降解通过揭示核定位信号激活 NF-+B。NF-βB然后转移到细胞核，在目标基因的启动位区域结合βB位点，促进转录10。因此，NF-βB的激活调节了NF-βB靶基因的mRNA表达，这种变化可以通过RNA定量测定，如RT-qPCR11。
存在几种方法，通常用于NF-βB活化的测量，包括电泳移动转移测定（EMSA）、核易位和基因报告器测定。EMSA用于检测核酸的蛋白质复合物。刺激细胞被分馏以分离核蛋白，包括转移的NF-βB，然后用含有NF-βB结合域的放射性标记核苷酸孵育。样品在凝胶上运行，并通过32个P标记核酸的自成像成像。如果NF-βB存在于蛋白质馏分中，它将结合核苷酸，核苷酸在凝胶中迁移较慢，并作为离散带出现。缺乏活性NF-βB（例如，未刺激控制细胞）的细胞的核部分不会产生带状，因为核苷酸会更快地迁移到凝胶的末端。此方法的一个主要缺点是，它在很大程度上是定量的二进制意义上的（即打开或关闭），并且不能充分捕获 NF-+B 绑定容量中有意义的差异。此外，这种方法不考虑对NF-βB靶基因12、13具有功能重要性的染色质结构。
与前一种方法类似，存在一种"非移位"测定法，其中多孔板涂有含有NF-βB结合序列的核苷酸。在对含有核蛋白质成分的细胞进行处理后，NF-βB将与结合在井上的核苷酸结合。然后加入抗NF-βB抗体，与结合的NF-βB相互作用，产生与NF-βB量成比例的色度信号，指示NF-βB的激活程度。这种方法优于EMSA，因为它不需要放射性标记的核酸，是定量的，相比之下。然而，这种方法的一个警告是，它再次不区分NF-βB靶基因14的染色质状态。
另一种可以检测NF-βB活化的方法是通过染色质免疫沉淀（ChIP），即DNA和相互作用的蛋白质与甲醛交联，免疫沉淀与特定的抗NF-β-B抗体。然后，通过PCR扩增或直接高通量测序，对特定的核苷酸片段进行纯化和识别。该方法产生的结果是NF-βB结合活性与靶基因的半定量结果。然而，结果高度依赖于每个步骤15的固定条件和纯化过程。
在核易位测定中，细胞被刺激诱导NF-βB激活，然后固定。抗p65抗体被添加到固定细胞。或者，p65 亚单位本身可以使用荧光肽（如绿色荧光绿色 （GFP））标记。在这两种情况下，免疫荧光将允许对p65的定位进行成像，以确定细胞分布。通过测量细胞和核局部蛋白的比例，研究者可以确定NF-βB的相对激活状态。这种方法的缺点是免疫荧光相对耗时，需要昂贵的抗体，并且需要相对更高的技术专长16。
报告基因是研究感兴趣的基因的调控和表达模式的常用工具。通常，报告基因是由一个感兴趣的基因的启动子序列构建的，该基因与一种易于检测的蛋白质的基因编码有关。具有酶活性、荧光或发光特性的蛋白质通常被选择用于测定和量化。因此，读出（例如，发光、荧光）作为检测基因表达的信号。然后，这些报告器构造可以引入到不同的细胞类型中，如上皮细胞或巨噬细胞。
该协议中描述的是使用克隆的HeLa细胞系（HeLa 57A），该细胞系通过含有免疫球蛋白β链促进器区域17的三个βB共识的荧光酶报告器进行稳稳的转染。荧光素酶的表达取决于NF-βB的激活，在细胞刺激后发生。使用荧光素酶测定试剂盒中提供的细胞乳液酶缓冲液，可轻松对刺激细胞进行分莱。然后，细胞莱沙的一部分与含有荧光素的荧光素酶测定缓冲液混合。路西法林是荧光素酶的基质，在荧光素酶存在的情况下生成光是必需的。将测定缓冲液与解液结合后，溶液将在称为发光的工艺中发出光。以流明表示的发光量与流沙中存在的荧光素酶量成正比，并用作 NF-βB 活化的量度。与未刺激的标准相比，对流明读数进行解释，以考虑基线 NF-+B 活性，信号本身稳定几分钟，以便进行可靠的测量。此外，HeLa 57A 细胞系通过 NF-βB 独立 β-乳糖酶报告器进行稳稳的转染。β-乳糖酶报告器是构成性的表达，β-乳糖酶活性可以测量，以控制细胞的存活性或细胞数17的变化。然后，可调整荧光酶值，以调整到β-乳糖酶值，并报告为在未刺激的控制细胞上增加的褶皱。
由于NF-βB是负责NF-βB依赖性靶基因表达增加的转录因子，因此控制NF-βB依赖性增加基因表达的后续实验是定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）。RT-qPCR是一种高度敏感的方法，通过这种方法，基因表达的变化可以量化在几个数量级。通过苯酚氯仿提取为RNA采集刺激和控制细胞。相分离后，RNA作为水层的主要成分被提取。然后，RNA被沉淀和洗涤，产生纯颗粒。然后，通过DNase处理，再重组并进一步清除污染物DNA。然后反向转录纯RNA，以创建互补DNA（cDNA）。然后，可以通过定量PCR技术分析该cDNA，其中对特定mRNA序列的丰度进行量化以确定基因表达。此技术不能阐明翻译控制、翻译后修饰、蛋白质丰度或蛋白质活性。然而，许多基因，尤其是那些参与亲炎过程的基因，通过NF-βB进行调控，其mRNA丰度表示其表达。
这里提出的方法采用一种快速、简单的方法，通过细胞莱沙的发光检测可以检测NF-βB的活化。NF-βB靶基因表达的RT-qPCR可用于量化特定基因的表达，以及验证NF-βB活化的功能活性。这种系统的主要优点是其简单性和速度，允许对调节 NF-+B 激活的一系列条件进行高吞吐量筛选。该协议适用于表达NF-βB：：乳酸酶报告器的其他细胞系，并已在稳稳转染RAW264.7细胞18中得到证明。处理样品所需的时间（从细胞溶解到产生发光信号）非常少，大约需要一个小时。NF-+B 的测量只需要基本的实验室设备，如不透明板、能够测量发光的板式读取器以及简单的数据分析软件（如电子表格程序）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 细胞传种和播种
- 在含有10mL的Dulbeco改性鹰培养基（DMEM）的75cm2烧瓶中保持HeLa 57A细胞，在5%的CO2培养箱中，在37°C下辅以5%热灭活胎儿牛血清（FBS）。
- 吸气细胞培养基，用1mL0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液洗涤。吸气胰蛋白酶，并替换为额外的1 mL。将烧瓶置于 37°C 培养箱中 4-5 分钟，让细胞从烧瓶中分离。
- 加入9 mL的细胞培养基，轻轻清洗瓶底几次，使细胞脱落，形成均匀悬浮液。
- 稀释HeLa 57A细胞1：6或1：8在新鲜的介质和种子到新的瓶。通道细胞在90%汇合或每三天一次时，将细胞保持至少25%的汇合。
- 在细胞刺激的前一天，胰腺化HeLa 57A细胞并悬浮在10mL的生长培养基中。使用血细胞计对悬浮细胞进行计数，并使用生长培养素将细胞稀释到50 mL锥形管中最终浓度为2.5 x 105细胞/mL。
- 将250 μL的细胞悬浮液（±6.25 x 104细胞）转移到48孔板的每个孔。定期盖上锥形管，确保均匀细胞悬浮液。轻轻敲击侧面的板，以确保细胞均匀地分布在孔中。
- 将板转移到37°C，在5%的CO2培养箱中，让细胞附着并生长过夜。
2. 细菌的制备
- 感染前两天，将沙门氏菌的条纹冷冻到LB琼脂板上，以产生单一菌落。将板转移到设定为 37 °C 的培养箱中，并允许一夜生长。
- 感染前一天，在无菌细菌培养管中加入3 mL的液化汤（LB），向介质中加入适当的抗生素。
- 使用无菌接种回路，从带条纹的细菌培养物中选取单个菌落，并将环接触 LB 介质。接种后盖住管子并丢弃回路。
- 将管子置于37°C、180 rpm 的摇动培养箱中，并允许一夜之间生长。
- 在感染当天，从培养箱中检索过夜的细菌培养物。
- 通过加入3 mL新鲜LB，在适当的时候含有抗生素，为亚培养准备管子。
- 将隔夜细菌培养物（100分之一稀释）的30μL转移到新鲜制备的介质中。将管子置于37°C的摇动培养箱中3小时。
- 3 h 孵育后，将 1 mL 无菌 LB 肉汤转移到塑料比色皿中，作为空白。将 900 μL 的 LB 转移到其他用于样品分析的比色皿中。
- 将 100 μL 的细菌亚培养物转移到含有 900 μL LB 的比色皿中，并上下移液器多次混合。对每次细菌悬浮液重复此操作。
- 打开分光光度计，以600nm（OD600）的波长测量细菌培养物的光密度（OD）。
- 在分光光度计中放置空白。记下方向，因为顶部应该有一个标记，指示该方向。
- 关闭盖子并按下分光光度计的空白按钮以获取背景吸光度。
- 以相同的方向将空白比色皿替换为样品比色皿，然后按"读取"。
- 记录这些样本的 OD600值。将值乘以 10 以考虑稀释系数。
- 用新鲜的LB稀释细菌亚培养，达到大约1.0的吸收值，这与1 x 109 cfu/mL大致相对应。在比色皿中稀释此悬浮液 1：10 并测量吸光度 - 应给出 ±0.1 的值。
- 在新管中，将适当体积的稀释亚培养量添加到新鲜 LB 中，以实现 1 x 108 cfu/mL 的悬浮液，用作接种液。
- 通过将 50 μL 的细菌悬浮液转移到含有 450 μL 无菌 PBS（10 倍稀释）的管中，直到最终稀释约 102 cfu/mL，制备接种的连续稀释剂。
- 将两个最低稀释剂的100 μL（102和103对应分别为10和100个菌落形成单位）转移到LB琼脂板，用细胞扩张器将悬浮液扩散，以获得单菌落。将这些板转移到37°C培养箱中，并在一夜之间孵育。
- 第二天计算菌落并计算初始接种的细菌浓度，以确定实际接种浓度。
3. 细胞感染
注：此时，细胞应处于约90%的汇合度。对于 48 孔板中的 HeLa 57A 细胞，每孔大约 1 x 105个细胞。细胞将感染10的多重感染（MOI），或106 cfu/well。
- 根据将用于每个孔的感染条件，标记板盖，每种条件以三次处理的方式完成。
- 将10μL的接种液加入适当的井中。在未感染的控制井中加入 10 μL 无菌 LB。
- 要同步感染时间，将板放在桌面离心机中，以 500 x g旋转 5 分钟，确保板平衡。
- 将受感染的细胞在37°C下转移到5%的CO2培养箱1小时。
- 将细胞培养基分置于37°C水浴中，以便下一步使用。
- 感染一小时后，从水浴中取出细胞培养基，并用70%乙醇擦拭外部。将组织培养板转移到生物安全柜。
- 使用无菌技术，从井中吸出培养基，用250μL的新鲜、温暖的细胞培养基。
- 在37°C下将板返回到5%的CO2培养箱，额外4小时。
- 从CO2培养箱中取出板，并从井中吸出介质。对于荧光酶分析，请继续执行步骤 4.1。对于RNA分离，继续步骤5.1。
4. 路西酶分析
- 向井中加入100 μL的1x细胞莱沙缓冲液。缓冲液可能需要首先稀释到工作浓度，具体取决于试剂。
- 将板转移到-80°C冷冻室，孵育至少30分钟，以确保有效的细胞解毒。
- 将含有冷冻细胞赖酸的板放在工作台上，根据制造商的建议解冻并制备荧光素酶基质试剂。
- 允许荧光素酶基质试剂与室温平衡。
- 打开板式读卡器并打开相应的读卡器程序。将机器设置为测量发光。
- 将每个样品的 10 μL 转移到不透明的 96 孔板的孔中。
- 使用多通道移液器将 50 μL 的 Luciferase 测定试剂添加到不透明板的每个孔中。
- 轻轻敲击侧面的板以混合水井，并确保底部表面覆盖液体。将板放在板式读卡器中并启动读数。
- 将发光值复制到电子表格程序中并绘制结果。
5. RNA分离
- 在每个井中加入500 μL的苯二恶亚酯，上下移液几次，以确保完全分解。
- 将内容物转移到标记的微离心管中。尽可能在冰上保存样品，以保持RNA质量。
- 将桌面离心机设置为 4°C，并将离心机保持在此温度下，直到协议的其余部分。
- 在每个样品管中，加入100μL的氯仿，盖紧盖子，摇动15秒，在室温下孵育10分钟。
- 在 12，000 x g下在 4 °C 下离心 15 分钟。在此期间，通过标记新管，为RNA纯化的下一步做好准备。
- 将上水相转移到含有250 μL异丙醇的新管中，小心不要干扰中下层或下层。
- 将未使用的产品存放在-80°C冷冻机中，也可用于蛋白质分析。如果以后需要RNA，残留水层也可以作为备用。
- 涡旋水层和异丙醇的混合物，让样品在室温下坐10分钟。
- 在4°C下将样品在12，000 x g下离心10分钟。
- 从离心机中取出管子。RNA沉淀在管的侧面和底部形成白色颗粒。打开管子，小心地取出上清液，倒入废物容器。
- 加入500μL的75%乙醇和涡旋，洗涤RNA颗粒。
- 在 4°C 下以 8，000 x g离心 5 分钟。
- 通过倒出去除上清液，然后用 75% 乙醇再次清洗颗粒。
- 在 4°C 下以 8，000 x g离心 5 分钟。
- 使用小体积移液器（例如，10-200 μL 体积），尽可能多吸气上清液，小心不要将任何液体推回管中，或用移液器尖端将颗粒移开。如果颗粒脱落，离心机将短暂停止，并再次尝试去除上清液。
- 空气干燥RNA颗粒。如果颗粒对于任何样品都可见，请定期（每 5 分钟）检查它们，看它们是否从白色变为透明，表明它们干燥。一旦颗粒开始变清，加入20μL的超纯RNase游水溶解RNA。
- 如果颗粒最初对任何样品不可见，只需在去除上清液后 5 分钟添加超纯水即可。
- 为了增加溶解度，通过移液器尖端将溶液传递几次，并在55-60°C下孵育10分钟。
6. RNA的DN酶处理
- 为了保持RNA的完整性，除非另有说明，否则将RNA样品储存在冰上。此时，可以从冰箱中取出 10x DNase 缓冲液，并允许在冰上解冻。
- 使用无绒布清洁所有样品分析表面，准备分光光度计进行样品分析。
- 在分析之前进行背景测量。为此，向传感器装载与用于溶解RNA颗粒的相同纯水的1.5 μL。按"读取空白"按钮生成背景读数。
- 使用无绒布擦拭仪器的样品装载表面。每次阅读示例后重复此步骤。
- 将1.5 μL的重新悬浮RNA加载到样品支架，然后选择"读取样品"。重复上述步骤，直到读取所有样本。
- 将 2.4 μL 的 10x DNase 缓冲液和 1 μL 的 DNase，每个样品在 1.5 mL 微离心管中组合，制备 DNase 主混合物。为两个额外的卷准备主组合。
- 通过轻拂管子几次混合主混音。将管短暂离心以收集管底的含量。将3.4μL的主混合物加入20μL的RNA样品中。与之前一样，通过轻拂和离心机将内容混合在一起。
- 将样品转移到37°C的热块中20分钟。从冷冻箱中取出DNase失活试剂，并在室温下解冻。
- 将样品放在热块上 20 分钟后，将样品转移到放在工作台上的管架上。
- 轻轻涡涡DNase灭活试剂的内容。将2.6 μL的DNase灭活化试剂转移到含有RNA的管中，然后轻拂管以产生均匀的混合物。
- 将样品在12，000 x g下离心1分钟。
- 小心地将上清液移至新的标记管中。
7. mRNA逆转录到cDNA
- 根据样品数量加上两个额外的样品，准备主混合物，以考虑移液造成的损失（表1）。使用1μgRNA，并将H2O加入50μL总体积。
| 试剂 | 体积 （μL） | 最终浓度 |
| MgCl2 （25mM） | 3.5 | 1.75 mM |
| 反向转录缓冲液 （10x） | 5 | 1x |
| dNTP 组合（10 μM，每个） | 2.5 | 500 纳米 |
| 随机六甲机 （100 μM） | 1.25 | 2.5 μM |
| 多片逆转录酶 （50 U/μL） | 1 | 1 U/μL |
| RN酶抑制剂 （20 U/μL） | 1.25 | 1.25 U/μL |
| RNA （1 μg） | 20 纳克/uL | |
| H2O | 最多 50 个 |
表1：逆转录主组合的组件和配方。
- 将样品盖紧并标记侧面的 PCR 管，因为盖上的标签稍后可能会从热循环器的加热盖上取下。通过涡旋混合。
- 将 PCR 管短暂离心，以收集样品到管底部。
- 将 PCR 管置于热循环器中，并在以下设置下运行样品：
25°C 10 分钟，48°C 30 分钟，95°C 5 分钟，然后保持在 10°C。 - 将含有新合成的cDNA的管转移到-20°C冷冻室，或立即用于qPCR分析。
8. RT-qPCR 分析的准备和装载板
- 开始之前，计划 384 孔 qPCR 板的设置，以便进行样品分析。
- 在冰上解冻引基和cDNA。
- 准备主组合（见表2），加上大约10%的额外，以解释通过移液造成的损失。
| 试剂 | 体积 （μL） |
| 10 μM F 底漆 | 1 |
| 10 μM R 引漆 | 1 |
| 超纯 H2O | 4 |
| 2x SYBR 绿色 | 10 |
表 2：qPCR 主组合的组件和配方。
- 使用中继器移液器将主混合和分配 8 μL 到 384 孔板的孔中。样品将分析重复为每个引物和cDNA样品组合。
- 使用 P10（或更小）移液器，将 2 μL 的 cDNA 转移到要分析的每个引液集的重复井中。更换每个井后的小塞，以避免交叉污染。
- 将粘合膜小心地涂在表面，确保覆盖所有孔，从而密封板。使用密封桨或滚轮按压薄膜以牢固密封。
- 将板放在离心机中，用空板作为平衡。将板在 500 x g下离心 5 分钟。
9. 运行用于 qPCR 分析的热循环器
- 打开计算机和实时 PCR 仪器。
- 打开RT-qPCR软件并选择新的实验。
- 在"设置"选项卡下，选择"实验属性"，其中可以设置运行参数。
- 定义实验名称，它将设置用于存储结果的文件名和设置。
- 对于"仪器选择"，选择将运行分析的当前连接的仪器。选择比较 CT （+Ct）运行方法。
- 选择SYBR绿色试剂作为要使用的荧光DNA染料，选择标准作为斜坡速度。
- 确保选中"包括熔体曲线"旁边的框。
- 在"定义"选项卡下，指定目标（即要扩增的基因）和样本（即实验条件）。
- 选择"分配"选项卡，将井标上适当的目标和样品，因为它们与 384 孔板的装载方案相对应。
- 选择"运行方法"。使用参数进行分析 （表 3）。
| 保持阶段 | PCR 级 | 熔融曲线级 | |||||
| 步骤 1 | 步骤 2 | 步骤 1 | 步骤 2 | 步骤 1 | 步骤 2 | 步骤 3 | |
| 临时 | 50 °C | 95 °C | 95 °C | 60 °C | 95 °C | 60 °C | 95 °C |
| 时间 | 2:00 | 10:00 | 0:15 | 1:00 | 0:15 | 1:00 | 0:15 |
| 数据采集 | 是的 | 是的 | |||||
| 循环数 | 1x | 40 倍 | 1x | ||||
表3：热循环器的循环参数。
- 将 384 孔板放入热循环器中并开始分析。
10. 使用增量-增量 Ct 方法分析 qPCR 结果 （2-+Ct）
- 分析 qPCR 反应产生的错误，以分析可能干扰下游分析的错误。系统会自动标记许多错误。
- 对于构造正确的引体，熔体曲线应只有一个峰值。从进一步分析中排除任何含有具有多个峰的熔体曲线的油井。
- 将 Ct 值导出到电子表格程序，以便使用 _Ct 方法分析数据。提供了建议的格式 （表 4）.最后一列是相对于控件样本的折叠表达式更改。
| 家政基因 （GAPDH） | 感兴趣的基因 （IL6） | ||||||||||
| Ct1 | Ct2 | 阿韦Ct | Ct1 | Ct2 | 阿韦Ct | *Ct | Ave _Ct ctrls | •Ct | 2°-（°Ct） | 地理美恩 | |
| 控制 1 | 15.33 | 15.37 | 15.35 | 26.81 | 26.91 | 26.86 | 11.51 | 10.51 | 1.00 | 0.50 | 1.00 |
| 控制 2 | 16.83 | 16.77 | 16.80 | 26.89 | 26.92 | 26.91 | 10.11 | 10.51 | -0.41 | 1.33 | |
| 控制 3 | 17.56 | 17.53 | 17.54 | 27.38 | 27.56 | 27.47 | 9.93 | 10.51 | -0.59 | 1.50 | |
| Sl1344 1 | 15.50 | 15.41 | 15.45 | 22.15 | 22.13 | 22.14 | 6.69 | 10.51 | -3.83 | 14.21 | 13.23 |
| SL1344 2 | 16.02 | 15.98 | 16.00 | 23.01 | 22.96 | 22.98 | 6.98 | 10.51 | -3.53 | 11.57 | |
| SL1344 3 | 17.27 | 17.30 | 17.28 | 23.99 | 23.98 | 23.98 | 6.70 | 10.51 | -3.82 | 14.09 | |
| sipA sopB sopE2 1 | 15.38 | 15.41 | 15.39 | 23.31 | 23.09 | 23.20 | 7.80 | 10.51 | -2.71 | 6.56 | 7.29 |
| sipA sopB sopE2 2 | 16.01 | 16.05 | 16.03 | 23.89 | 23.92 | 23.91 | 7.88 | 10.51 | -2.64 | 6.23 | |
| sipA sopB sopE2 3 | 16.78 | 16.78 | 16.78 | 24.02 | 24.06 | 24.04 | 7.27 | 10.51 | -3.25 | 9.49 | |
| sipA sopB sopE2 sopE 1 | 15.52 | 15.60 | 15.56 | 27.04 | 27.03 | 27.03 | 11.47 | 10.51 | 0.96 | 0.51 | 0.79 |
| sipA sopB sopE2 sopE 2 | 15.56 | 15.59 | 15.57 | 26.37 | 26.42 | 26.39 | 10.82 | 10.51 | 0.31 | 0.81 | |
| sipA sopB sopE2 sopE 3 | 15.91 | 15.92 | 15.91 | 26.24 | 26.12 | 26.18 | 10.27 | 10.51 | -0.25 | 1.19 | |
表 4：用于分析 qPCR 数据的格式。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
此处描述的测定侧重于使用NF-βB依赖性荧光酶报告器激活转录因子NF-βB，该重感酶可稳稳地转染成HeLa细胞系。激活的NF-βB转位到细胞核，其中结合目标基因的βB结合位点，包括亲炎细胞因子IL6和IL23。图1描述了NF-+B激活的概述。本研究使用革兰氏阴性细菌肠杆菌血清分型，作为NF-βB的活化剂和随后表达IL6（图2）。发病机制所需的主要毒性因子之一是允许S的III型分泌系统-1（T3SS-1）。Typhimurium 感染细胞并诱导 NF-βB 激活。T3SS-1的功能是将细菌蛋白（称为效应器）输送到宿主细胞中。在这里，效应蛋白针对许多细胞信号通路，以调解宿主上皮细胞的入侵。由 S诱导的 NF-+B 激活。Typhimurium主要依赖于T3SS-1效应蛋白SopE，SipA，SopB和SopE218。在这里，HeLa 57A细胞感染了野生S型。Typhimurium 菌株 SL1344 和两个突变菌株缺乏三个（SipA、 SopB、 SopE2）或四个（SipA、 SopE2、 SopE2）效应蛋白。图2是感染S的HeLa 57A细胞中NF-βB依赖性荧光酶活化（图2A）和IL6基因表达（图2B）的代表性实验。Typhimurium 菌株。感染野生型SL1344菌株诱导强荧光素酶信号，在感染SipA、SopB、SopE2三重突变体（SopE依赖反应）的细胞中降低，并降低至SipA、SopB、SopE2、SopE四重突变的对照水平。相对发光单位 （RLU） 与IL6表达水平相关 （图 2）。图 3显示了从 RT-qPCR 分析中生成的结果。
图1：NF-+B激活和下游读出的原理图。如上所述，NF-βB由抑制蛋白I+B+在细胞醇中保持非活性状态。内部和外部刺激都有助于IKK的活化，IKK磷酸化I+B+并导致其随后的蛋白酶降解。I_B+的降解揭示了NF-βB的核定位信号，从而促进易位。在细胞核中，活性NF-βB结合到目标基因的βB结合位点，促进其转录和表达。目标基因，如细胞因子IL6和IL23，通过RT-qPCR表达和量化。在HeLa 57A细胞中荧光素酶在NF-βB激活后表示，可通过发光测定进行量化。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：发光测定和RT-qPCR分析的代表性数据。S.HeLa 57A 细胞的Typhimurium感染。1 x 105 HeLa 57A 细胞感染了 106 cfu （MOI = 10） 的对数阶段S。Typhimurium 野生类型 SL1344，或缺乏 SipA、SopB 和 SopE2 的突变菌株，以及 SipA、SopB、SopE2 和 SopE。1小时后，介质被替换，孵育又持续了4个小时。（A） 细胞通过发光测定处理，以表达荧光素酶。（B） 提取RNA细胞，用于RT-qPCR分析.显示使用增量-增量Ct方法（2-μCt）的目标基因的相对表达。显示了三联井的均值和标准偏差。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：从RT-qPCR分析生成的汇总结果。（A） 从感染S的HeLa 57A细胞中扩增GAPDH的井的扩增图显示。打字人。（B） 含有GAPDH引漆的油井的熔融曲线图显示一个对应于约84°C的熔体峰值。（C） 含有IL-6引体的重复井。其中一口井显示第二个熔体峰，如黑色箭头表示，应排除在分析之外。请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
所述协议的主要贡献是，它提供了一种快速和简单的方法来检测细胞中的NF-βB激活，从而能够对影响NF-βB活化的多种刺激条件或药物进行高通量分析。在这里，我们描述了在沙门氏菌感染的HeLa细胞中NF-βB激活的协议。这些细胞可用于感染其他病原体，以及研究细菌感染对NF-βB活化的影响。此外，在HeLa 57A细胞中NF-βB依赖性荧光酶活化可用于筛选信号通路的活化剂或抑制剂，导致NF-βB激活。在这里，我们在48孔板中播种HeLa 57A细胞，但这些实验可以扩展到96孔甚至384孔的板，以便每个实验有更多的样本。HeLa 57A 细胞构成表达 LacZ，可作为使用 β-gal 测定法对细胞数和生存能力的内部控制进行测量。此处描述的协议适用于使用 NF-βB：：luciferase 报告器构造的稳态或瞬态转染的细胞系。RAW264.7巨噬细胞系已经用于这样的目的18。重要的是，此方法不区分五个不同的 NF-+B 子单位的不同同源/异构体的激活。不同的NF-β-B同质异构体复合物对启动子序列有不同的亲和力，以及不同的转录结果21。由于免疫球蛋白β链启动器区域与βB结合位点的低亲和力结合，使用此处描述的报告器，可能会错过特定NF-βB二聚体激活。
需要注意的是，适合刺激一个细胞系的条件可能并不直接适用于另一个细胞系。因此，强烈建议在每个测定系统中优化测定条件。感染时间、MOI、药物治疗持续时间、药物剂量和播种条件都是评估NF-βB活化时需要考虑的重要考虑因素。例如，RAW264.7巨噬细胞对沙门氏菌感染更敏感，需要不同的条件产生与HeLa 57A细胞18类似的发光信号。
在发光测量中，边缘井的值与同样受到刺激的其他井值有很大不同，这种情况并不少见。这通常是由于板上边缘孔的蒸发率较高，导致药物浓度增加。这可以通过在井间的空间中添加无血清介质、允许其使用的板、改变盖/板组合以减少蒸发，或者如果问题仍然存在，完全省略边缘孔来解决。
萤火虫荧光素酶以哺乳动物细胞的形式表达，其半寿命为几个小时，对于大多数记者测定22的目的，通常被认为是稳定的。与此处描述的更长的治疗持续时间可以可靠地进行。然而，这里使用的荧光素酶测定系统只在第一分钟产生稳定的信号，之后会迅速恶化。因此，在混合细胞溶解物和基质后，快速进行发光测量是非常重要的。
NF-βB是包括细胞因子和化学因子（即Il6和Il23）在内的大量基因的转录因子。测量NF-βB依赖性荧光酶活性并不一定意味着这些细胞因子和化学素被表达。该方法可以补充现有的分子定量技术，作为影响NF-βB活性的条件的表征的潜在第一屏幕，然后可以通过RT-qPCR进行功能验证。NF-βB 活化的功能验证也可通过西方斑点分析或特定于感兴趣的蛋白质的功能测定在 mRNA 定量可能不合适的情况下进行。白素素β（Il1b）就是这种情况，这种基因的转录是由NF-βB结合诱导的，但蛋白质产物需要翻译后修饰才能形成成熟产物23，24。
此处描述的特定 RNA 分离协议并不是唯一可用于 RT-qPCR 分析的RNA分离方案，其他首选方法（如市售试剂盒）也可以使用。需要注意的是，RNA的质量对工艺非常重要，因此RNA应尽可能保存在冰上，以防止降解。在 RT-qPCR 反应中运行重复反应以确定 PCR 反应是否一致非常重要，因为加载 384 孔板时，此类小体积的移液通常会导致错误。内务基因的Ct值在样品之间应一致，与此的偏差可能表明在逆转录过程中清洁步骤效率低下或RNA浓度差异，可能会影响最终结果。在每个 qPCR 实验后检查熔体曲线也很重要。一个峰值的存在表明qPCR引源正在扩增单个基因。多条曲线表明存在脱靶基因扩增或存在引体二聚体。在这两种情况下，熔融曲线中存在的多个峰表明应重新设计引体以确保特异性。由于存在很大的变化空间，每一步都进行良好技术的练习和完善对于生成准确且可重现的结果至关重要。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
Keestra-Gounder 实验室的研究由 NIH NIAID 提供编号为 R21AI122092 的资助，美国糖尿病协会获得第 1-18-JDF-035 奖的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive film | VWR International | 60941-070 | |
| Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-500 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11665092 | |
| DNAse treatment kit | Qiagen | 79254 | |
| dNTPs | Promega | U1511 | |
| Ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818100 | molecular grade |
| FBS | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| HeLa 57A cells | Ref # 15 | ||
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP26181 | |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | BP906-5 | |
| LB agar | Fisher Bioreagents | BP1425-500 | |
| Lysogeny broth | Fisher Bioreagents | BP1426-500 | |
| MgCl2 | Fisher Chemical | ||
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Scientific | spectrophotometer | |
| Promega luciferase assay system | Promega | E1501 | Cell lysis buffer & luciferin substrate |
| Random Hexamers | Thermo Scientific | SO142 | |
| Real-time GAPDH forward primer | 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3' |
||
| Real-time GAPDH reverse primer | 5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3' |
||
| Real-time IL-23 forward primer | 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3' |
||
| Real-time IL-23 reverse primer | 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3' | ||
| Real-time IL-6 forward primer | 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3' | ||
| Real-time IL-6 reverse primer | 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3' |
||
| Reverse Transcriptase | Applied Biosystems | 4308228 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| RT buffer | Promega | A3561 | |
| SL1344 | Ref # 17 | ||
| SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SYBR green | Applied Biosystems | 4309155 | 2x mastermix |
| Tri-reagent | Molecular Research Center | TR 118 | guanidine thiocyanate |
| Trypsin -EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| Ultrapure water | Fisher Bioreagents | BP248450 | |
| Well plate for PCR | VWR International | 89218-294 | 384-well plate |
References
- Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C.
- Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (3-4), 478-486 (2006).
- Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), a001651 (2009).
- Hargett, D., Rice, S., Bachenheimer, S. L. Herpes simplex virus type 1 ICP27-dependent activation of NF-kappaB. Journal of Virology. 80 (21), 10565-10578 (2006).
- Zaragoza, C., et al. Viral protease cleavage of inhibitor of kappaBalpha triggers host cell apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 103 (50), 19051-19056 (2006).
- Gao, X., et al. Bacterial effector binding to ribosomal protein s3 subverts NF-kappaB function. PLOS Pathogens. 5 (12), e1000708 (2009).
- Kravchenko, V. V., et al. Modulation of gene expression via disruption of NF-kappaB signaling by a bacterial small molecule. Science. 321 (5886), 259-263 (2008).
- Kawai, T., Akira, S. Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors. Trends in Molecular Medicine. 13 (11), 460-469 (2007).
- Pinaud, L., Sansonetti, P. J., Phalipon, A. Host Cell Targeting by Enteropathogenic Bacteria T3SS Effectors. Trends in Microbiology. 26 (4), 266-283 (2018).
- Karin, M. How NF-kappaB is activated: the role of the IkappaB kinase (IKK) complex. Oncogene. , (1999).
- Berti, R., et al. Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 22 (9), 1068-1079 (2002).
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
- Holden, N. S., Tacon, C. E. Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 63 (1), 7-14 (2011).
- Renard, P., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Research. 29 (4), E21 (2001).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39 (5), 715-725 (2005).
- Ernst, O., Vayttaden, S. J., Fraser, I. D. C. Measurement of NF-kappaB Activation in TLR-Activated Macrophages. Methods in Molecular Biology. 1714, 67-78 (2018).
- Rodriguez, M. S., Thompson, J., Hay, R. T., Dargemont, C. Nuclear retention of IkappaBalpha protects it from signal-induced degradation and inhibits nuclear factor kappaB transcriptional activation. Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 9108-9115 (1999).
- Mendez, J. M., Kolora, L. D., Lemon, J. S., Dupree, S. L., Keestra-Gounder, A. M. Activation of the endoplasmic reticulum stress response impacts the NOD1 signaling pathway. Infection and Immunity. , (2019).
- Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. D. Aromatic-Dependent Salmonella-Typhimurium Are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines. Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).
- Keestra, A. M., et al. Manipulation of small Rho GTPases is a pathogen-induced process detected by NOD1. Nature. 496 (7444), 233-237 (2013).
- Wong, D., et al. Extensive characterization of NF-kappaB binding uncovers non-canonical motifs and advances the interpretation of genetic functional traits. Genome Biology. 12 (7), R70 (2011).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nature Methods. 8 (10), 879-884 (2011).
- Cogswell, J. P., et al. NF-kappa B regulates IL-1 beta transcription through a consensus NF-kappa B binding site and a nonconsensus CRE-like site. Journal of Immunology. 153 (2), 712-723 (1994).
- Thornberry, N. A., et al. A Novel Heterodimeric Cysteine Protease Is Required for Interleukin-1-Beta Processing in Monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
