Dieses Protokoll ermöglicht eine zeitaufgelöste Beschreibung des bakteriellen Wachstums unter Stressbedingungen auf der Einzelzell- und Zellpopulationsebene.
Die Analyse der bakteriellen Fähigkeit, unter Stressbedingungen zu wachsen und zu überleben, ist für eine Vielzahl von mikrobiologischen Studien unerlässlich. Es ist relevant, die Reaktion von Bakterienzellen auf stressinduzierende Behandlungen wie die Exposition gegenüber Antibiotika oder anderen antimikrobiellen Verbindungen, Bestrahlung, nicht-physiologischen pH,, Temperatur oder Salzkonzentration zu charakterisieren. Verschiedene Stressbehandlungen können verschiedene zelluläre Prozesse stören, einschließlich Zellteilung, DNA-Replikation, Proteinsynthese, Membranintegrität oder Zellzyklusregulation. Diese Effekte sind in der Regel mit bestimmten Phänotypen auf der zellulären Skala verbunden. Daher erfordert das Verständnis des Ausmaßes und der Kausalität von stressinduzierten Wachstums- oder Lebensfähigkeitsdefiziten eine sorgfältige Analyse mehrerer Parameter, sowohl auf der Einzelzelle als auch auf der Populationsebene. Die hier vorgestellte experimentelle Strategie kombiniert traditionelle optische Dichteüberwachung und Beschichtungstests mit einzelzelligen Analysetechniken wie Durchflusszytometrie und Echtzeitmikroskopie in lebenden Zellen. Dieses multiskalige Framework ermöglicht eine zeitaufgelöste Beschreibung der Auswirkungen von Stressbedingungen auf das Schicksal einer Bakterienpopulation.
Der allgemeine Zweck dieses Protokolls ist es, das Verhalten von Bakterienzellen zu analysieren, die Stressbehandlungen in der Population und auf einzelligen Ebenen ausgesetzt sind. Bakterielles Wachstum und Lebensfähigkeit werden traditionell auf Populationsebene mittels optischer Dichteüberwachung (OD600nm), einem Proxy der bakteriellen Zellmassensynthese, oder durch Beschichtung von Assays zur Bestimmung der Konzentration lebensfähiger Zellen in der Kultur (Koloniebildeinheit pro Milliliter, KBE/ml) behandelt. Unter normalen (unbelasteten) Wachstumsbedingungen sind OD600nm- und KBE/ml-Messungen streng korreliert, da die bakterielle Verdopplungszeit direkt von der Zellmassenzunahme1,2abhängt. Diese Korrelation wird jedoch häufig unter Bedingungen gestört, die die Zellmassensynthese3, Zellteilung4, oder die Zelllyse auslösen. Ein einfaches Beispiel sind Stressbehandlungen, die die Zellteilung hemmen, die zur Bildung fadenförmiger Bakterienzellen5,6führen. Filamente Zellen verlaufen normal, weil die Zellmassensynthese nicht beeinflusst ist, aber sie sind nicht in der Lage, sich in lebensfähige Zellen zu teilen. Die optische Kulturdichte wird folglich im Laufe der Zeit mit einer normalen Rate zunehmen, aber nicht die Konzentration lebensfähiger Zellen, die durch Beschichtungstests (CFU/mL) bestimmt werden. In diesem Fall sind, wie in vielen anderen, optische Dichte- und Beschichtungsmessungen informativ, liefern aber kein umfassendes Verständnis des beobachteten stressinduzierten Effekts. Diese Ensemble-Assays müssen mit einzelligen Analysetechniken kombiniert werden, um eine tiefgehende Charakterisierung von stressinduzierten Wachstumsmängeln zu ermöglichen.
Hier wird ein Verfahren beschrieben, das vier komplementäre experimentelle Ansätze kombiniert: (1) traditionelle Beschichtungstests und grundlegende überwachung der optischen Dichte zur Überwachung der Zelllebensfähigkeit bzw. zellmassensynthese; (2) Durchflusszytometrie zur Bewertung der Zellgröße und der DNA-Gehaltsparameter für eine große Anzahl von Zellen; (3) Mikroskopie-Snapshot-Bildgebung zur Analyse der Zellmorphologie; und (4) Zeitraffer-Einzelbildgebung in mikrofluidischen Kammern zur Untersuchung der zeitlichen Dynamik des Zellschicksals. Dieses multiskalige Framework ermöglicht es, die globalen Auswirkungen auf das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit im Lichte des Verhaltens einzelner Zellen zu interpretieren. Dieses Verfahren kann angewendet werden, um die Reaktion verschiedener Bakterienarten auf praktisch jeden Stress von Interesse zu entschlüsseln, einschließlich Wachstum unter bestimmten Bedingungen (z. B. Wachstumsmedium, pH-Wert, Temperatur, Salzkonzentration) oder Exposition gegenüber Antibiotika oder anderen antimikrobiellen Verbindungen.
Es ist wichtig, während des Eingriffs auf den Wachstumszustand der Zellen zu achten. Wachsen Sie die Zellen über mehrere Generationen, bevor Sie eine vollständige exponentielle Phase erreichen. Für den Erfolg dieser Methode ist es wichtig, dass alle Zellproben gleichzeitig gesammelt werden, und es ist am besten, nur eine behandelte und eine unbehandelte Kultur gleichzeitig zu analysieren. Zellproben für die Mikroskopie-Bildgebung müssen während des gesamten Verfahrens auf der Versuchstemperatur aufbewahrt werden. Es ist dann wichtig, die Mikroskopkammer und die mikrofluidische Kammer vor Beginn des Experiments vorzuheizen. Wenn Zellproben für die Durchflusszytometrie nicht leicht analysiert werden können, können sie bis zu 6 h auf Eis gehalten werden. Inkubation auf Eis wird das Wachstum und die morphologische Veränderung der Zellen begrenzen. Alternativ könnte der Benutzer die Verwendung der Fixierung der Zellen in Ethanol 75% in Betracht ziehen, was normalerweise für die Durchflusszytometrie10empfohlen wird. Wenn das Protokoll erfordert, waschen Sie die Spannungsinduktivität von dem Medium, Zentrifuge und Pipettenzellen sehr sorgfältig, um zu vermeiden, dass die potenziellen aberranten Zellen beschädigt werden.
Sowohl die Durchflusszytometrie als auch die Snapshot-Analyse bieten Zugriff auf Zellgrößen- und DNA-Inhaltsparameter, wobei Snapshots zusätzliche Beobachtungen der Zellmorphologie bieten. DNA-Färbung mit DAPI10 (4′,6-Diamidino-2-Phenylindole) oder anderen stabilen DNA-Farbstoffen kann durchgeführt werden, wenn keine fluoreszierende Fusion zur Verfügung steht, um die Nukleoide im Betreffenden Organismus zu beobachten. Wenn eine Flusszytometrieanalyse nicht durchgeführt werden kann, ist es wichtig, eine große Anzahl von Zellen per Mikroskopie abzubilden und zu analysieren.
Mikroskopie-Bildgebung kann auch mit Stämmen durchgeführt werden, die fluoreszierende Fusionen zu Proteinen tragen, die an bestimmten Interessenspfaden beteiligt sind. Dies würde dazu beitragen, die Auswirkungen von Stress auf eine Vielzahl von zellulären Prozessen wie Replikation, Transkription, Zellwandsynthese oder Zellteilung aufzuzeigen. Die Methode kann auf eine Reihe von Bakterienarten angewendet werden, wobei die einzige Voraussetzung darin besteht, dass der mikrofluidische Apparat mit der Morphologie der Zellen kompatibel sein muss. Standard-Mikrofluidplatten eignen sich für stabförmige Bakterien mit einer Zellbreite zwischen 0,7 und 4,5 m. Allerdings müssen Koks, Ovokokken oder andere Bakterienstämme mit besonderen Formen getestet werden. Wenn mikrofluidische Experimente aufgrund der Nichtverfügbarkeit der Geräte oder inkompatibler Bakterienstämme nicht durchgeführt werden können, kann eine Zeitraffer-Bildgebung auf Agarose-Dias für eine maximale Dauer von 2h durchgeführt werden.
Der Gesamtvorteil dieser multiskalen Analyse besteht darin, eine globale Vision der Wirkung der Stressinduktion auf mehrere Aspekte der bakteriellen Wachstumsfähigkeit (d. h. Massensynthese, Zelllebensfähigkeit, Zellmorphologie, Membranintegrität, DNA-Gehalt) und die Art und Weise diese entwickeln sich mit der Zeit in einer Bakterienpopulation, die unter Stressbedingungen wächst. Es ermöglicht auch die Analyse der Wiederherstellung des normalen Wachstums auf der Ebene der einzelnen Zellen und der Bevölkerung. Der Ansatz gilt für eine Vielzahl von Bakterienarten und für praktisch jede Art von Stressbehandlung, wie die Exposition gegenüber Antibiotika oder anderen antimikrobiellen Verbindungen, die Analyse des Einflusses der Interaktion mit anderen Organismen bei Mehreren Arten Populationen oder die Wirkung genetischer Mutation.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken F. Cornet für die Bereitstellung der hupA-mCherry Sorte, A. Dedieu für technische Hilfe bei zytometrie und A. Ducret für die Hilfe bei MicrobeJ. Förderung: C. Lesterlin würdigt Inserm- und CNRS-Institutionen sowie das ATIP-Avenir-Programm, die Schlumberger Stiftung für Bildung und Forschung (FSER 2019), die ANR-Förderung für plasMed-Forschungsprogramm (ANR-18-CE35-0008) sowie FINOVI für die Finanzierung von J. Cayron; La Ligue contre le cancer für die Finanzierung der Durchflusszytometerausrüstung. Autorenbeiträge: C.L. und J.C. entwarfen das Verfahren und schrieben das Papier; J.C. führte die Experimente durch und analysierte die Daten.
Agarose | BioRad | 1613100 | Certified molecular biology agarose |
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | ThermoFisher scientific | A24858 | Cytometer |
CellASIC ONIX Microfluidic System | Merck Millipore | CAX2-S0000 | Microfluidic system |
CellASIC ONIX2 FG | Merck Millipore | ONIX2 1.0.1 | Microfluidic software |
CellASIC ONIX2 Manifold Basic | Merck Millipore | CAX2-MBC20 | Manifold system |
CytoOne 96-well plate with lid | Starlab | CC7672-7596 | Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader |
E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion | Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655 | ||
Fiji | ImageJ | https://fiji.sc/ | Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication |
Gene Frame | Thermo Scientific | AB-0578 | Blue frame (125 μL, 1,7 x 2,8 cm) |
Luria-Broth agarose medium | MP Biomedicals | 3002232 | Growth medium for plating assay |
MicrobeJ | Imagej/Fiji plugin | https://www.microbej.com/ | Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters |
Microfluidic Plates CellASIC ONIX | Merck Millipore | B04A-03-5PK | Plate for Microfluidic system |
Microscope Nikon eclipse Ti | Nikon | Fluorescence microscope | |
MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM) | Teknova | M2105 | Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 μm |
SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S34854 | DNA fluorescent dye |
TECAN Infinite M1000 | TECAN | 30034301 | Automated plate reader |