Este protocolo permite una descripción del crecimiento bacteriano en condiciones de estrés en los niveles de población de una sola célula y célula.
El análisis de la capacidad bacteriana para crecer y sobrevivir en condiciones de estrés es esencial para una amplia gama de estudios de microbiología. Es relevante caracterizar la respuesta de las células bacterianas a tratamientos que inducen el estrés, como la exposición a antibióticos u otros compuestos antimicrobianos, irradiación, pH no fisiológico, temperatura o concentración de sal. Diferentes tratamientos de estrés pueden perturbar diferentes procesos celulares, incluyendo la división celular, replicación del ADN, síntesis de proteínas, integridad de la membrana, o regulación del ciclo celular. Estos efectos se asocian generalmente con fenotipos específicos a escala celular. Por lo tanto, comprender el alcance y la causalidad de las deficiencias de crecimiento o viabilidad inducidas por el estrés requiere un análisis cuidadoso de varios parámetros, tanto a nivel de una sola célula como a nivel de población. La estrategia experimental presentada aquí combina el monitoreo tradicional de la densidad óptica y los ensayos de chapado con técnicas de análisis de una sola célula, como la citometría de flujo y la imagen por microscopía en tiempo real en células vivas. Este marco multiescala permite una descripción del impacto de las condiciones de estrés en el destino de una población bacteriana.
El propósito general de este protocolo es analizar el comportamiento de las células bacterianas expuestas a tratamientos de estrés en la población y a nivel de una sola célula. Tradicionalmente, el crecimiento bacteriano y la viabilidad se abordan a nivel de población mediante el monitoreo de densidad óptica (OD600nm),que es un proxy de síntesis de masa celular bacteriana, o mediante ensayos de chapado para determinar la concentración de células viables en el cultivo (unidad formadora de colonias por mililitro, CFU/ml). En condiciones normales de crecimiento (sin tensión), las mediciones de OD600nm y CFU/ml están estrictamente correlacionadas porque el tiempo de duplicación bacteriana depende directamente del aumento de la masa celular1,2. Sin embargo, esta correlación a menudo se interrumpe en condiciones que afectan la síntesis de masa celular3, división celular4, o que desencadenan la lisis celular. Un ejemplo simple es proporcionado por tratamientos de estrés que inhiben la división celular, que resultan en la formación de células bacterianas filamentosas5,6. Las células filamentosas se alargan normalmente porque la síntesis de masa celular no se ve afectada, pero son incapaces de dividirse en células viables. En consecuencia, la densidad óptica de cultivo aumentará con el tiempo a un ritmo normal, pero no la concentración de células viables determinadapor mediante ensayos de chapado (CFU/ml). En este caso, como en muchos otros, las mediciones de densidad óptica y chapado son informativas, pero no proporcionan una comprensión completa del efecto observado inducido por el estrés. Estos ensayos de conjunto deben combinarse con técnicas de análisis de una sola célula para permitir una caracterización en profundidad de las deficiencias de crecimiento inducidas por el estrés.
Aquí, se describe un procedimiento que combina cuatro enfoques experimentales complementarios: (1) ensayos de chapado tradicionales y monitoreo de densidad óptica básica para monitorear la viabilidad celular y la síntesis de masa celular, respectivamente; (2) citometría de flujo para evaluar el tamaño de la célula y los parámetros de contenido de ADN en un gran número de células; (3) imágenes instantáneas de microscopía para analizar la morfología celular; y (4) imágenes de una sola célula de lapso de tiempo en cámaras microfluídicas para el examen de la dinámica temporal del destino celular. Este marco multiescala permite interpretar los efectos globales sobre el crecimiento celular y la viabilidad a la luz del comportamiento de las células individuales. Este procedimiento se puede aplicar para descifrar la respuesta de diversas especies bacterianas a prácticamente cualquier estrés de interés, incluido el crecimiento en condiciones particulares (es decir, medio de crecimiento, pH, temperatura, concentración de sal) o exposición a antibióticos u otros compuestos antimicrobianos.
Es esencial prestar atención al estado de crecimiento de las células durante el procedimiento. Crecer las células durante varias generaciones antes de alcanzar una fase exponencial completa. Para el éxito de este método, es importante que todas las muestras de células se recopilen simultáneamente, y es mejor analizar solo un cultivo tratado y un cultivo no tratado al mismo tiempo. Las muestras celulares para imágenes por microscopía deben mantenerse a la temperatura experimental durante todo el procedimiento. Entonces es esencial precalentar la cámara del microscopio y la cámara microfluídica antes del comienzo del experimento. Si las muestras celulares de citometría de flujo no se pueden analizar fácilmente, se pueden mantener en hielo hasta 6 h. La incubación en hielo limitará el crecimiento y la modificación morfológica de las células. Alternativamente, el usuario podría considerar el uso de la fijación de las células en etanol 75%, que generalmente se recomienda para la citometría de flujo10. Si el protocolo requiere lavar el inductor de tensión desde el medio, las células centrífugas y pipetas con mucho cuidado para evitar dañar las células aberrantes potenciales.
Tanto la citometría de flujo como el análisis de instantáneas dan acceso al tamaño de la célula y a los parámetros de contenido de ADN, con instantáneas que proporcionan una observación adicional de la morfología celular. Se puede realizar la tinción de ADN con DAPI10 (4′,6-diamidino-2-phenylindole) u otros colorantes de ADN estables si no hay fusión fluorescente disponible para observar los nucleoides en el organismo de interés. Si no se puede realizar el análisis de citometría de flujo, es importante crear una imagen y analizar un gran número de células mediante microscopía.
Las imágenes por microscopía también se pueden realizar utilizando cepas que transportan fusiones fluorescentes a proteínas implicadas en vías específicas de interés. Esto ayudaría a revelar el efecto del estrés en una variedad de procesos celulares como replicación, transcripción, síntesis de la pared celular, o división celular. El método puede aplicarse a una serie de especies bacterianas, el único requisito es que el aparato microfluídico debe ser compatible con la morfología de las células. Las placas microfluídicas estándar son convenientes para bacterias en forma de varilla con un ancho de célula entre 0,7 y 4,5 m. Sin embargo, los cocci, los ovococci u otras cepas bacterianas con formas peculiares deben ser probados. Alternativamente, si no se pueden realizar experimentos microfluídicos debido a la falta de disponibilidad del equipo o cepas bacterianas incompatibles, la toma de imágenes de lapso de tiempo se puede realizar en diapositivas montadas en agarosa para una duración máxima de 2h.
La ventaja general de este análisis multiescala es proporcionar una visión global del efecto de la inducción de estrés en varios aspectos de la capacidad de crecimiento bacteriano (es decir, síntesis de masa, viabilidad celular, morfología celular, integridad de la membrana, contenido de ADN) y la forma en que estos evolucionan con el tiempo en una población bacteriana que crece bajo condiciones de estrés. También permite analizar la restauración del crecimiento normal a nivel de una sola célula y a nivel de población. El enfoque es aplicable a una amplia gama de especies bacterianas y a prácticamente cualquier tipo de tratamiento contra el estrés, como la exposición a antibióticos u otros compuestos antimicrobianos, análisis de la influencia de la interacción con otros organismos en múltiples especies poblaciones, o el efecto de la mutación genética.
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen a F. Cornet por proporcionar la cepa hupA-mCherry, A. Dedieu por asistencia técnica con citometría, y A. Ducret por su ayuda con MicrobeJ. Financiación: C. Lesterlin reconoce las instituciones Inserm y CNRS, así como el programa ATIP-Avenir, la Fundación Schlumberger para la Educación y la Investigación (FSER 2019), la financiación de la ANR para el programa de investigación PlasMed (ANR-18-CE35-0008), así como FINOVI para la financiación de J. Cayron; Cáncer La Ligue contre le para la financiación del equipo del citómetro de flujo. Contribuciones del autor: C.L. y J.C. diseñaron el procedimiento y escribieron el documento; J.C. realizó los experimentos y analizó los datos.
Agarose | BioRad | 1613100 | Certified molecular biology agarose |
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | ThermoFisher scientific | A24858 | Cytometer |
CellASIC ONIX Microfluidic System | Merck Millipore | CAX2-S0000 | Microfluidic system |
CellASIC ONIX2 FG | Merck Millipore | ONIX2 1.0.1 | Microfluidic software |
CellASIC ONIX2 Manifold Basic | Merck Millipore | CAX2-MBC20 | Manifold system |
CytoOne 96-well plate with lid | Starlab | CC7672-7596 | Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader |
E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion | Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655 | ||
Fiji | ImageJ | https://fiji.sc/ | Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication |
Gene Frame | Thermo Scientific | AB-0578 | Blue frame (125 μL, 1,7 x 2,8 cm) |
Luria-Broth agarose medium | MP Biomedicals | 3002232 | Growth medium for plating assay |
MicrobeJ | Imagej/Fiji plugin | https://www.microbej.com/ | Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters |
Microfluidic Plates CellASIC ONIX | Merck Millipore | B04A-03-5PK | Plate for Microfluidic system |
Microscope Nikon eclipse Ti | Nikon | Fluorescence microscope | |
MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM) | Teknova | M2105 | Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 μm |
SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S34854 | DNA fluorescent dye |
TECAN Infinite M1000 | TECAN | 30034301 | Automated plate reader |