Summary
פרוטוקול זה מאפשר תיאור בזמן הפתרון של גידול חיידקי בתנאי לחץ בתא בודד ואת רמות האוכלוסייה התא.
Abstract
ניתוח היכולת החיידקית לצמוח ולשרוד תחת תנאי לחץ חיוני למגוון רחב של לימודי מיקרוביולוגיה. זה רלוונטי כדי לאפיין את התגובה של תאים חיידקיים לטיפולים לגרימת מתח כגון חשיפה לאנטיביוטיקה או תרכובות מיקרוביאלית אחרים, הקרנה, לא פיזיולוגי pH, טמפרטורה, או ריכוז מלחים. טיפולי סטרס שונים עלולים להפריע לתהליכים סלולריים שונים, כולל חלוקת תאים, שכפול דנ א, סינתזה של חלבונים, שלמות ממברנה או רגולציה של מחזור התא. תופעות אלה משויכות בדרך כלל עם פנוטיפים ספציפיים בקנה מידה הסלולר. לכן, הבנת המידה והסיבתיות של הצמיחה והליקויים המושרה במתח מחייבים ניתוח קפדני של מספר פרמטרים, הן בתא יחיד והן ברמות האוכלוסיה. האסטרטגיה הניסיונית המוצגת כאן משלבת ניטור אופטי מסורתי וציפוי מספר בטכניקות ניתוח תא בודד כגון הזרמת cy, והדמיה של מיקרוסקופ בזמן אמת בתאים חיים. זו מסגרת בקנה מידה רב מאפשר תיאור הזמן נפתרה של ההשפעה של תנאי הלחץ על גורלם של אוכלוסיה חיידקית.
Introduction
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לנתח את אופן הפעולה של תאים חיידקיים חשופים לטיפולי סטרס באוכלוסיה וברמות תא בודד. גידול חיידקי והכדאיות מטופלות באופן מסורתי ברמת האוכלוסייה באמצעות ניטור צפיפות אופטית (OD600nm), אשר הוא פרוקסי של סינתזה של תא חיידקי המסה, או על ידי ציפוי בחני לקבוע את הריכוז של תאים קיימא בתרבות (המושבה היחידה היחידה למילימטר, cfu/mL). תחת נורמלי (הדגיש) תנאים הגוברת,OD 600nm ו cfu/mL מדידות מתואמים בהחלט כי זמן ההכפלה חיידקי תלוי ישירות על המסה התא להגדיל1,2. עם זאת, מתאם זה משתבש לעתים קרובות בתנאים המשפיעים על סינתזה המסה תא3, תא חילוק4, או הגורם לפירוק התא. דוגמה פשוטה מסופק על ידי טיפולי הלחץ כי לעכב את חלוקת התא, אשר כתוצאה היווצרות של תאים חיידקיים filamentous5,6. תאים filamentous האריך בדרך כלל בגלל סינתזה המסה התא אינו מושפע, אבל הם לא יכולים לחלק לתאים קיימא. הצפיפות האופטית של התרבות תהיה להגדיל עם הזמן בקצב נורמלי אבל לא את הריכוז של תאים קיימא נקבע על ידי ציפוי (CFU/mL). במקרה זה, כמו רבים אחרים, צפיפות אופטית מדידות הציפוי הם אינפורמטיביים, אבל לא לספק הבנה מקיפה של האפקט המושרה הלחץ הבחין. אלה האנסמבל אומר צריך להיות משולב עם שיטות ניתוח תא יחיד כדי לאפשר אפיון מעמיק של מחסור בלחץ הגדילה.
כאן, הליך המשלב ארבע גישות נסיוניות משלימות מתוארת: (1) ציפוי מסורתי מעקב וצפיפות אופטית בסיסית כדי לפקח על הכדאיות הסלולרית וסינתזה המסה של התא, בהתאמה; (2) הזרימה cy, לנסות להעריך את גודל התא ואת הפרמטרים של תוכן ה-DNA על מספר גדול של תאים; (3) הדמיה של תצלומי מיקרוסקופיה לניתוח מורפולוגיה של תאים; ו (4) לשגות הזמן הדמיה תא יחיד בתאי microflu, לבדיקת הדינמיקה הטמפורלית של גורל התא. מסגרת זו רבת היקף מאפשרת לפרש את ההשפעות הגלובליות על צמיחת תאים ויכולת הקיום באור התנהגות של תאים בודדים. הליך זה יכול להיות מיושם כדי לפענח את התגובה של מינים חיידקיים מגוונים כמעט כל מתח של עניין, כולל צמיחה בתנאים מסוימים (כלומר, הצמיחה בינונית, pH, טמפרטורה, ריכוז מלח), או חשיפה לאנטיביוטיקה או אחרים תרכובות מיקרוביאלית.
Protocol
1. תרבית תאים, השראה והליכי דגימה
הערה: השתמש בכלי זכוכית סטרילי לתרבות, בעצות הפיפטה ובמדיום הגדילה שסוננו ב-0.22 יקרומטר כדי להימנע מחלקיקים ברקע. כאן, תרביות תאים מגודלים בינונית נמוכה מוגדרת מדיום עשיר (ראה טבלת חומרים)7,8.
- פס את הלחץ החיידקי של עניין מתוך מלאי גליצרול קפוא על לוריא ציר (LB) הצלחת (עם אנטיביוטיקה סלקטיבית אם נדרש) ו דגירה ב 37 ° c לילה (17 h).
הערה: הניסוי לדוגמה המוצג כאן משתמש es, coli MG1655 Hupa-mcherry. זן זה מייצר את מתויג באופן פלואורויחידות יחידת α של חלבון הקשורים HU נוקלאואיד, ובכך לאפשר הדמיה מיקרוסקופ אור של כרומוזום בתאים חיים9. - איחסן 5 מ ל בינוני עם מושבה אחת וגדל ב 37 ° c עם טלטול ב 140 סיבוב לדקה (rpm) לילה (17 h). מבחנות (≥ 50 mL) או קוטר גדול (≥ 2 ס מ) צינורות בדיקה יש להשתמש כדי להבטיח מתכלה משביע רצון של התרבות הנסערת.
- למחרת בבוקר למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר (OD600nm) ולדלל את התרבות לתוך צינור מבחן המכיל מדיום טרי ל-OD600nm של 0.01. הנפח הכולל של התרבות צריך להיות מותאם בהתאם למספר נקודות הזמן שנותחו במהלך הניסוי.
- לטעון מדגם μL 200 של התרבות לתוך מיקרופלייט (0.2 mL לכל טוב של נפח עבודה עם תחתון שקוף ברור) ולמקם אותו בקורא לוחית אוטומטית (ראה טבלת חומרים) עבור OD מעקב600nm במהלך הדגירה ב 37 ° c.
- מודדקת את צינור הבדיקה מחוסן ב 37 ° צ' עם טלטול (140 rpm) כדי OD600nm = 0.2, המתאים שלב מעריכי מלא במדיום עשיר.
הערה: חשוב לגדל את התאים לפחות 4-5 דורות לפני השגת הצמיחה האקספוננציאלית המתאימה. הנרשת הראשונית המשמשת בשלב 1.3 (OD600nm = 0.01) צריכה להיות מותאמת במקרה של צמיחה במדיום העני (כלומר, כאשר השלב האקספוננציאלי הוא הגיע מתחת OD 0.2), או אם עוד דורות מבוקשים (למשל, עבור מחקרים פיזיולוגיים ספציפיים או לטיפולים מורחבים הלחץ). - ב-OD600nm = 0.2, קחו את דגימות התרבות הבאות המתאימות לנקודת הזמן t0 (תאים הגדלים באופן מעריכי לפני אינדוקציה לחץ): (1) מדגם μl 150 שייטען באופן מיידי במנגנון המיקרו-פלואידיג להדמיה מיקרוסקופית (ראה סעיף 2); (2) דוגמה 200 μL עבור הדילול והציפוי (ראה סעיף 3); (3) המדגם 250 μL לשים על הקרח עבור הניתוח cy, מנסה לזרום (סעיף 4); (4) דוגמת 10 μL שהופקדה מיד על שקופית שנטענה על-ידי הדמיה של תמונת מיקרוסקופ (ראה סעיף 5).
- לחשוף את תרבות התא שנותר במבחנה לטיפול הלחץ הספציפי שאתה רוצה לחקור את הדגירה ב 37 ° c עם טלטול (140 rpm).
הערה: התרבות הצומחת בקורא לוחית אוטומטי עבור ניטור OD600nm צריך גם להיות נתון לטיפול בלחץ. - בנקודות הזמן הרלוונטיות לאחר הטיפול בלחץ (t1, t2, t3, וכו '), לקחת את דגימות התא הבאות מן התרבות הדגיש: (1) מדגם 200 μl עבור הדילול והציפוי (ראה סעיף 2); (2) דוגמה 250 μL לשים על הקרח עבור הניתוח cy, מנסה לזרום (סעיף 3); (4) דוגמת 10 μL שהופקדה מיד על שקופית שנטענה על-ידי הדמיה של תמונת מיקרוסקופ (ראה סעיף 4).
הערה: לכל טיפול הגורם למתחים יש יעילות המהווה מינון ותלות בזמן. לכן, ייתכן שיהיה צורך להריץ בדיקות ראשוניות כדי לקבוע את המינון ואת משך הטיפול שישמשו לקבלת תוצאות אופטימליות. ניתן לעשות זאת על-ידי ביצוע ניטור OD באמצעות קורא לוחית אוטומטי (העלול להיות משויך עם ציפוי שאומר) של תרבות התא שטופלו עם מגוון של מינונים וזמני חשיפה. בניסוי המוצג כאן, התרבות התאית טופלה עם החטיבה התא-מעכב אנטיביוטיקה cephalexin (.) בריכוז 5 μg/mL עבור 60 דקות. Cephalexin היה לאחר מכן שטף את התאים על-ידי שפופרת של 15 מ ל באמצעות צנטריפוגה (475 g, 5 דקות), הסרת supernatant, להשעות את הגלולה התא בנפח שווה של מדיום טרי על ידי ליטוף עדין, והעברת לתוך צינור נקי. התאים שנשטפו היו מודבטים ב 37 ° צ' עם טלטול (140 rpm) כדי לאפשר התאוששות. המדגם נלקח ב t60 (60 דקות לאחר התוספת cephalexin המתאים "cephalexin-60min-שטופלו" מדגם), t120 (60 דקות לאחר הכביסה), ו t180 (120 דקות לאחר הכביסה).
2. שיטת הציפוי
הערה: שיטת הציפוי מאפשרת למדוד את ריכוז התאים המסוגלים ליצור CFU בדגימות התרבות. הליך זה חושף את הקצב שבו תא אחד מתחלק לשני תאים קיימא ומאפשר לזהות מעצרים חלוקת תאים (למשל, להגדיל את הזמן דור חיידקי של פירוק התא).
- הכינו דילול טורי של 10 מקפלים עד 10-7 של 200 μl של דגימת התרבות במדיום טרי. צלחת 100 μL של הדילול המתאים על לוחות LB שאינם סלקטיבית כדי להשיג בין 3 ל 300 מושבות לאחר הדגירה הלילה ב 37 ° c.
הערה: הדילול הסדרתי במדיום הצח חייב להתבצע במהירות כדי להגביל את החלוקה החיידקית. לחילופין, החוקרים עשויים לשקול שימוש בתמיסה מלוחים ללא מקור פחמן כדי למנוע חלוקת תאים במהלך תהליך הדילול. - למחרת, לספור את מספר המושבות כדי לקבוע את הריכוז של תאים קיימא (CFU/mL) בכל דגימת תרבות. העלילה CFU/mL כפונקציה של זמן עבור תרבויות תאים מטופל ומטופל.
3. הזרמה הסיטרין
הערה: הסעיף הבא מתאר את הכנת דגימות התא לניתוח cy, לצורך זרימה. טכניקת ניתוח זו חושפת את התפלגות גודל התא ותוכן ה-DNA עבור מספר רב של תאים. במידת האפשר, מומלץ לעבד באופן מיידי את הדגימות של הסיילנסה הזורמים. לחילופין, ניתן לשמור דגימות על הקרח (עד 6 שעות) ומנותח בו זמנית בסוף היום, לאחר שנערכו הדמיה של הציפוי והמיקרוסקופיה.
- לדלל את 250 μL של דגימת התרבות כדי להשיג 250 μL בריכוז של ~ 15,000 תאים/μL (מתאים OD600nm ~ 0.06) במדיום טרי ב 4 ° c.
הערה: דגירה על הקרח תגביל את הצמיחה ואת שינוי מורפולוגית של התאים. לחילופין, המשתמש עשוי לשקול ביצוע קיבעון של התאים ב-75% אתנול, כפי שמומלץ בדרך כלל עבור הזרימה cy, try10. - עבור כתמים DNA, לערבב את המדגם חיידקי עם 10 μg/mL פתרון של צבע פלורסנט DNA (יחס 1:1) ו דגירה בחושך עבור 15 דקות לפני ניתוח המדגם.
- להעביר את המדגם לתוך cytometer זרם עם ~ 120,000 תאים/דקה קצב הזרימה. רוכשים אור לפני הזריחה (FSC) ומפוזרים בצד (מתחת לפני המטה) כמו גם האות הפלואורסצנטית DNA לצבוע (FL-1) עם ההגדרות המתאימות.
- התווה את צפיפות התאים FSC ו-FL-1 לייצוג התפלגות גודל התא ותוכן ה-DNA באוכלוסיית התאים.
4. הדמיה מיקרוסקופית הבזק
הערה: החלק הבא מתאר את הכנת שקופיות מיקרוסקופ ורכישת תמונות לניתוח של תצלומי אוכלוסייה. הליך זה יספק מידע אודות מורפולוגיה של התאים (אורך התא, רוחב, צורה) ואת הארגון תאיים של ה-DNA נוקלאואיד.
- מחממים את תא המיקרוסקופ התרמי ב-37 ° c כדי לייצב את הטמפרטורה לפני תחילת התצפיות. תא זה מאפשר אפנון טמפרטורה של המיקרוסקופ אופטיקה ולדגום שלב במהלך ניסויים לשגות זמן.
- הכינו את השקופיות הטעונות כמתואר בלסטרלין ובדוברי7.
- הסירו את הסרט הפלסטי מהחלק התחתון של המסגרת הכחולה (ראו טבלת חומרים) והשאירו את הסרט הפלסטי החלול בצד השני. לתקוע את המסגרת הכחולה על שקופית זכוכית מיקרוסקופ.
- פיפטה ~ 150 μL של מומסת 1% הפתרון הבינוני ויוצקים בתוך תא המסגרת הכחולה. לכסות במהירות עם שמיכות נקי כדי להסיר את עודפי הנוזלים ולחכות כמה דקות עבור משטח agarose כדי לגבש בטמפרטורת החדר.
- כאשר דגימת התא מוכנה, הסר את הכיסויים ואת הסרט הפלסטי מהמסגרת הכחולה. יוצקים 10 μL של דגימת תאים על כרית agarose להטות את השקופית זכוכית בעדינות כדי להפיץ את ה-droplet. כאשר כל הנוזל כבר adsorbed, לתקוע שמיכות נקי על המסגרת הכחולה כדי לאטום את המדגם. שקופית המיקרוסקופיה. מוכנה כעת למיקרוסקופ
- מניחים את השקופית על הבמה במיקרוסקופ ולבצע רכישת תמונה באמצעות אור המשודר (עם מטרת ניגודיות שלב) עם עירור מקור אור באורכי גל המתאים (560 nm עבור mCherry).
- בחר שדות תצוגה המכילים תאים מבודדים כדי להקל על זיהוי תאים אוטומטי במהלך ניתוח תמונה. ודא כי לפחות 300 תאים מתתמים כדי לאפשר ניתוח סטטיסטי יציב של אוכלוסיית התא.
5. מיקרופלואידיקה-זמן לשגות הדמיה מיקרוסקופית
הערה: החלק הבא מסביר את הכנת לוחיות המיקרו-פלואידיג (ראה טבלת חומרים), טעינת תאים, תוכנית microfluidic ורכישת תמונות בזמן. הליך דימות זה חושף את אופן הפעולה של תאים בודדים בזמן אמת.
- הסירו את פתרון השימור מלוחית המיקרו-פלואידיג והחליפו אותו במדיום טרי שחומם מראש ל-37 ° c, כפי שמתואר במדריך למשתמש של תוכנת microfluidic.
- אטום את הצלחת המיקרופלואידיג למערכת הסעפת ולחץ על כפתור הקרקע .
- מניחים את הצלחת microflu, עם מערכת סעפת על הבמה במיקרוסקופ ומחממים ב 37 ° c עבור ~ 2 h לפני תחילת רכישת המיקרוסקופיה.
הערה: שלב זה לחימום מראש הוא קריטי כדי למנוע את התרחבות של התא microflu, אשר היה לשנות את המיקוד של המיקרוסקופ במהלך ניסוי זמן הקפיצה ולהתפשר על רכישת תמונה. - . אטום את צלחת המיקרופלואידיג החלף את המדיום מ 8 עם 150 μL של מדגם התרבות ולהחליף את המדיום מ-1 עד 5 על ידי המדיום הרצוי עם או בלי מגיב ממריץ את המתח.
- הציבו את הצלחת המיקרופלואידים. והניחו אותו על הבמה
- על התוכנה microfluidic (ראה טבלת חומרים) להפעיל את הליך טעינת התא. בדוק כי הטעינה של התאים הוא משביע רצון על ידי התבוננות מתחת למיקרוסקופ באור משודר. הפעל את הליך טעינת התא פעם שנייה אם צפיפות התא בחדר אינה מספיקה.
- בצע מיקוד קפדני במצב אור משודר ובחר מספר שדות תצוגה המראה חיידקים מבודדים. חשוב לבחור שדות שאינם צפופים מדי כדי להיות מסוגל לפקח על התפתחותם של תאים מבודדים לאורך זמן (~ 10 לל20 תאים לכל 100 יקרומטר2 מומלץ). פעולה זו תסייע גם לזיהוי תאים במהלך ניתוח תמונה.
- בתוכנה microflu, לחץ על לחצן צור פרוטוקול. לתכנת את ההזרקה של מדיום הצמיחה עבור 1-2 שווי זמן דור כדי לאפשר לתאים להסתגל (אופציונלי). ואז לתכנת את ההזרקה של המדיום לגרימת מתח במהלך 10 דקות ב 2 psi, ואחריו הזרקה ב 1 psi למשך המבוקש של טיפול הלחץ. אם אתה מתכוון לנתח את ההתאוששות של התאים לאחר הלחץ, לתכנת את ההזרקה של מדיום גידול טרי למשך המבוקש.
הערה: בניסוי המוצג כאן, cephalexin הוזרק עבור 10 דקות ב 2 psi, ואחריו 50 דקות ב 1 psi. אז, בינוני גדילה טרי הוזרק ב 2 psi עבור 10 דקות, ואחריו 3 h ב 1 psi. - לבצע הדמיה מיקרוסקופית במצב פקיעה זמן עם מסגרת אחת כל 10 דקות באמצעות ניגודיות הפאזה באור משודר ו-560 ננומטר מקור אור לאות מטעם mCherry אם נדרש.
הערה: חשוב להתחיל רכישת תמונה מיקרוסקופית באותו זמן כמו התחלת הפרוטוקול הזרקת microfluidic.
6. ניתוח תמונה
הערה: סעיף זה מתאר בקצרה את שלבי המפתח של עיבוד וניתוח של תמונות מיקרוסקופית והערות זמן. פתיחה והדמיה של תמונות מיקרוסקופית מתבצעת עם ImageJ/פיג ' י הקוד הפתוח (https://fiji.sc/)11. ניתוח תמונה כמותי מבוצע באמצעות ImageJ/התוכנה קוד פתוח ביחד עם תוסף MicrobeJ חינם12 (https://microbej.com). פרוטוקול זה משתמש בגירסה MicrobeJ 5.13 I.
- פתח את תוכנת פיג'י ואת תוסף MicrobeJ.
- לניתוח תצלומי בזק, שחרר את כל התמונות המתאימות לשקופית מיקרוסקופ אחת (מדגם אחד) לתוך סרגל הטעינה MicrobeJ כדי לשרשר תמונות ולשמור את הקובץ ערימות תמונה שהתקבלו. עבור נתונים בזמן פקיעה, פשוט לשחרר את ערימת התמונה לתוך פס הטעינה של MicrobeJ.
- הפעל את הזיהוי האוטומטי של קווי המתאר של התאים בהתבסס על פילוח של תמונת חדות הפאזה, ואם רלוונטי, של הנוקלאונואידים המבוססים על פילוח של אות הקרינה הפלואורסצנטית ה-DNA המוכתם. בדוק את הדיוק של זיהוי התא באופן חזותי והשתמש בכלי העריכה MicrobeJ לתיקון במידת הצורך. שמור את קובץ התוצאות שהתקבל.
הערה: ההגדרות המשמשות לזיהוי תאים של E. coli מסומנות בטבלת החומרים (ראה הערות/תיאור עמודה של microbej). למינים בקטריאליים אחרים (במיוחד עבור חיידקים שאינם בצורת מוט), המשתמש חייב למקד את ההגדרות לפני האיתור (ראה MicrobeJ הדרכה). עבור תמונות מעידה בזמן, הפעלת זיהוי אוטומטי למחצה של התאים באמצעות כלי העריכה MicrobeJ עשוי להיות מועדף כדי לאפשר התמקדות בגורלם של תאים בודדים (ראה MicrobeJ הדרכה). - לחץ על resultj סמל כדי להשלים את הניתוח ולקבל את חלון resultj . ניתן להפיק סוגים שונים רבים של תרשימי פלט מנקודה זו. התוויית היסטגרמות מנורמלות של צורת התאים/אורך ומספר נוקלאואיד ממוצע לכל תא.
Representative Results
ההליך תיאר שימש כדי לנתח את ההתנהגות של esK12 chia התאים החיידק במהלך חשיפה ארעית cephalexin, אנטיביוטיקה כי במיוחד מעכב את חלוקת התא (איור 1A)13. מאמץ של hupa-mcherry E. coli המייצרת את החלבון המסומן fluorescently הקשורים ל-DNA כרומוזום שימש כדי לחקור את הדינמיקה של הכרומוזום לאורך הטיפול הזה8,9. התאים מעריכית הגוברת Hupa-mCherry E. coli נותחו לפני (t0) ו 60 דקות לאחר הדגירה עם cephalexin (t60). לאחר מכן, האנטיביוטיקה נשטפה משם ואת ההתאוששות של אוכלוסיית התאים אחרי 1 h (t120) ו 2 h (t180) נותחו (איור 1B).
איור 1: נוהל ניתוח של תגובה חיידקית לטיפולי סטרס. (א) סכמטי השיטה. (ב) קריקטורה המדגימה את המבנה התא במהלך הצמיחה הרגילה בינונית עשירה במהלך חשיפה ארעית Cephalexin (קפח.), מ נוסף ב (t0) ואחרי cephalexin לשטוף מ (t60) אל (t180). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
האבולוציה המקבילה של OD ו-CFU/mL היא אינדיקטור ראשון המסייע להבין את ההשפעה של טיפולי הסטרס. שני פרמטרים אלה הם בקורלציה מוחלטת במהלך הצמיחה בלתי מודאג, אך לעתים קרובות בלתי מצמידים ולהתפתח באופן עצמאי תחת לחץ. תרביות תאים גדל בנוכחותם של cephalexin הציגו דומה OD600nm כמו התרבויות הבלתי הדגיש (איור 2א), מראה כי התרופה לא השפיעה על סינתזה המסה התא. עם זאת, הריכוז של תאים קיימא לא גדל כאשר cephalexin היה נוכח עקב עיכוב קפדני של חלוקת התא (איור 2ב). תאים החלו להתחלק שוב כאשר cephalexin הוסר ובסופו של דבר הגיע לריכוז שווה ערך לתרבות הבלתי לחוצה (t180). תוצאות אלה משקפות את האפקט בקטיוסטטי של cephalexin, אשר משרה עיכוב הפיך באופן מלא של חלוקת התא. מתחים שונים יגרמו לביטול שונה של עקומות OD ו-CFU/mL, בהתאם להשפעה הנגרמת (למשל, שינוי של מורפולוגיה התא כגון filamentation או בולטות, מוות תאים עם או בלי הליזה). רשימה לא ממצה של תוצאות התוצאה האפשרית מעיד על אפקטים שונים המושרה לחץ מוצג באיור 2ג.
איור 2: ניטור הצמיחה חיידקים של תאים מטופלים ו cephalexin התייחסו ברמת האוכלוסייה. (A) מעקבאחר צפיפות אופטית (OD600nm/mL). (ב) ריכוז של תא בר קיימא (Cfu/mL) בתוך התרבויות מטופל ו cephalexin-60min מטופלים. קווי שגיאה מציינים את סטיית התקן עבור שלישיה ניסיונית. (ג) תרשימים של תוצאות אפשריות והשפעות מצוקה משויכות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
ניתוח תא יחיד חיוני לפענוח מדויק של תגובת הלחץ הנצפתה ברמת האוכלוסייה. הזרמת cy, מאפשרת לבדוק את גודל התא ותוכן ה-DNA של מספר אלפי תאים14,15 (איור 3). חשיפה לcephalexin עוררה את העלייה המקבילה של גודל התא ותוכן ה-DNA (t60). כאשר cephalexin הוסר, גודל תא האוכלוסייה ואת תוכן ה-DNA ירד בהדרגה כדי להיות דומה האוכלוסייה הבלתי הדגיש ב t180. תוצאות אלה מראים כי cephalexin לא מנע שכפול DNA ועוררה היווצרות של תאים filamentous שהכיל מספר מקבילות כרומוזום. החוטים האלה מחולקים לתאים עם גודל תא רגיל ותוכן ה-DNA כאשר התרופה נשטפה משם. זרם cy, התוצאות יהיה שונה מאוד עבור מדגיש כי לעכב סינתזה DNA, אשר להוביל היווצרות של תאים filamentous המכילים רק אחד ללא שכפול כרומוזום. במקרה כזה, גודל התא יגדל באופן דומה אך לא יהיה משויך לעלייה בתוכן ה-DNA.
איור 3: הנציגה המייצגת cytometry ניתוח של תאים מטופלים ו cephalexin-60min מטופל. (א) התפלגותגודל התא היסטורגרמות (fsc-H). (ב) תוכן ה-DNA היסטגרמות (FL1-SYTO9). n = 120,000 תאים שנותחו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
הדמיה מיקרוסקופית תמונה שימש כדי לבחון את מורפולוגיה התא ואת הארגון התאיים של ה-DNA המוצג על ידי לוקליזציה HU-mCherry (איור 4א). Cephalexin עוררה היווצרות של תאים ארוכים עם רוחב התא נורמלי ללא septa חילוק. אלה חוטים חלקה הכיל באופן קבוע במרווחים DNA מבנים בשם נוקלאונואידים, ומאשרת כי cephalexin לא השפיע על שכפול כרומוזום והפרדה. ניתוח תמונה כמותית אישר במידה רבה את גודל התא ואת להגדיל את תוכן ה-DNA שנצפו בעבר עם הזרימה cy, (איור 4B, C). תוצאות יהיה שונה מאוד עבור מדגיש כי לגרום DNA-נזק, אשר להוביל היווצרות של תאים filamentous שבו השכפול ממשיך אבל הפרדה היא לקויה. במקרה זה, גודל התא ותוכן ה-DNA יגדל באופן דומה, אבל התאים היו מעגן מסה אחת לא מובנה של ה-DNA. תמונות תמונה יכול גם לחשוף סוג אחר של צורות תא חריג או נוכחות של מיני, אנוקלאט, או תאים למטה (תאים רפאים).
איור 4: הניתוח מיקרומיקרוסקופיה של תאים לא מטופלים ומטופלים של cephalexin-60min. (א) תמונות מיקרוסקופית מייצגות המציגותאת ניגודיות הפאזה (אפור) ואות HU-מדובדבן (אדום). (ב) התפלגות אורך התא היסטורגרמות. קנה מידה של בר = 5 μm. (ג) היסטגרמות ממספר הנוקלאואיד לכל תא. בין 800 ל-2,000 תאים נותחו עבור כל דוגמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
מיקרוסקופ זמן לפקיעה הקשורים מנגנון מיקרופלואידיג16 עזר לקבוע את פנוטיפים שנצפו בעבר ומספק תובנות נוספות לגבי התפתחות וסיבתיות של מחסור בגידול. תמונותבזמן הקפיצה (איור 5A והסרט 1) אישר כי התא התארכות (סינתזה המסה התא), שכפול כרומוזום והפרדה לא היו מעוכבים על ידי חשיפה לcephalexin. בנוסף, הוא חשף את תהליך ההחלמה כאשר cephalexin הוסר. ניתוח של שושלת התאים הfilamous הראה כי חלוקת התא מופעלת מחדש ~ 20 דקות לאחר שטיפת התרופה (איור 5ב). התאים המחולקים כתוצאה מכך היו קיימא, כי הם בתורו מחולקים, בסופו של דבר המוביל היווצרות של 33 תאים המציגות בגודל נורמלי ותוכן ה-DNA. מותר לבצע חישוב של זמן דור כולל של ~ 31 דקות על 180 מינימום של הניסוי, הדומה לזמן הדור המחושב עבור האוכלוסיה הבלתי מתוחה ממדידות CFU/mL (~ 33 דקות).
איור 5: מיקרוסקופ זמן ניתוח לשגות של cephalexin-60min תאים מטופלים. (א) תמונות מיקרוסקופית מייצגות המציגותאת ניגודיות הפאזה (אפור) ואות HU-מדובדבן (אדום). תא filamentous הנמצא תחת פיקוח מצוין על-ידי החלוקה לרמות הלבנה, ותאים מחולקים בצבעים שונים. סרגל בקנה מידה = 5 μm. (ב) ייצוג סכמטי של שושלת התאים הfilamentous המתאימה פאנל (א) ולסרט 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
סרט 1: סרט מיקרופלואידיג של E. coli הו-מדובדבן מטופלים עם cephalexin. Cephalexin הוזרק לאחר 60 דקות, ואחריו הזרקה של מדיום RDM טריים עבור 3 h. הזמן המצוין צהוב (1 מסגרת כל 10 דקות). קנה מידה של בר = 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
Discussion
חיוני לשים לב למצב הגדילה של התאים במהלך ההליך. לגדל את התאים במשך כמה דורות לפני שהגיע שלב אקספוננציאלי מלא. להצלחת שיטה זו, חשוב שכל דגימות התאים ייאספו בו, ומוטב לנתח רק מטופל אחד ותרבות לא מטופלת אחת בו. דגימות תאים עבור הדמיה מיקרוסקופית חייבים להישמר בטמפרטורה הניסיונית לאורך כל התהליך. לאחר מכן הכרחי לחממים את תא המיקרוסקופ ואת חדר המיקרו-פלואידיג לפני תחילת הניסוי. אם דגימות התא עבור cy, להזרים לזרום לא ניתן לנתח בקלות, הם יכולים להישמר על הקרח עד 6 ח. דגירה על הקרח תגביל את הצמיחה ואת השינוי מורפולוגית של התאים. לחילופין, המשתמש עשוי לשקול להשתמש קיבעון של התאים באתנול 75%, אשר מומלץ בדרך כלל עבור cy, לזרום הציטונסה10. אם הפרוטוקול דורש שטיפת לחץ השראה מן המדיום, הצנטריפוגה ותאי הפיפטה בזהירות רבה כדי למנוע פגיעה בתאים החריגה הפוטנציאליים.
שתי הזרימה cy, וניתוח תצלומי בזק מעניקים גישה לגודל התא ולפרמטרים של תוכן ה-DNA, עם תמונות המספקות התבוננות נוספת של מורפולוגיה התא. מכתים דנ א עם DAPI10 (4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול) או אחרים צבעי DNA יציבה ניתן לבצע אם אין פיוז'ן פלורסנט זמין להתבונן הנוקלאונואידים באורגניזם הריבית. אם לא ניתן לבצע ניתוח הזרמת cy, חשוב לצלם ולנתח מספר גדול של תאים באמצעות מיקרוסקופ.
הדמיה מיקרוסקופית ניתן גם לבצע באמצעות זנים נושאת פלורסנט fusions לחלבונים המעורבים מסלולים ספציפיים של עניין. זה יעזור לחשוף את ההשפעה של הלחץ על מגוון של תהליכים סלולריים כגון שכפול, תמלול, סינתזה של קיר התא, או מחלקת תאים. ניתן להחיל את השיטה על מגוון של מינים חיידקיים, הדרישה היחידה שמנגנון microfluidic חייב להיות תואם את המבנה של התאים. לוחות מיקרופלואידיג סטנדרטיים הם נוחים עבור חיידקים בצורת מוט עם רוחב תא בין 0.7 יקרומטר ו 4.5 יקרומטר. עם זאת, cocci, ovococci, או זנים חיידקיים אחרים עם צורות מוזר צריך להיבדק. לחילופין, אם לא ניתן לבצע ניסויים microflu, בגלל חוסר הזמינות של הציוד או זנים חיידקיים בלתי תואמים, הדמיה בזמן ההדמיה ניתן לבצע על השקופיות רכוב agarose למשך מקסימום של 2h.
היתרון הכולל של ניתוח רב ממדי זה הוא לספק חזון גלובלי של ההשפעה של אינדוקציה הלחץ על מספר היבטים של יכולת הצמיחה חיידקי (כלומר, סינתזה המוני, הכדאיות התא, מורפולוגיה התא, שלמות הממברנה, תוכן ה-DNA) ואת הדרך אלה להתפתח עם הזמן באוכלוסייה חיידקים גדל תחת תנאי הלחץ. היא גם מאפשרת לנתח את השיקום של הצמיחה הנורמלית ברמה של תא אחד ורמת האוכלוסייה. הגישה ישימה למגוון רחב של מינים חיידקיים וכמעט כל סוג של טיפול בלחץ, כגון חשיפה לאנטיביוטיקה או תרכובות מיקרוביאלית אחרות, ניתוח ההשפעה של אינטראקציה עם אורגניזמים אחרים בריבוי מינים אוכלוסיות, או השפעה של מוטציה גנטית.
Disclosures
המחברים הכריזו שאין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מודים ל-F. Cornet על מתן מאמץ של Hupa-mCherry , א. דארדיה לקבלת סיוע טכני עם cy, ו-A. Ducret לקבלת עזרה עם MicrobeJ. מימון: ג. Lesterlin מכיר מוסדות Inserm ו-CNRS כמו גם תוכנית ATIP-אבייר, קרן שלמברג לחינוך ומחקר (FSER 2019), מימון ANR לתוכנית מחקר פלסטלינה (ANR-18-CE35-0008) כמו גם FINOVI עבור מימון ל-J. Cayron; La ligue דשנה סרטן עבור מימון של ציוד cytometer זרימה. מחבר תרומות: C.L. ו-J.C. עיצב את ההליך וכתב את הנייר; J.C. ביצעו את הניסויים וניתחו את הנתונים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | BioRad | 1613100 | Certified molecular biology agarose |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | ThermoFisher scientific | A24858 | Cytometer |
| CellASIC ONIX Microfluidic System | Merck Millipore | CAX2-S0000 | Microfluidic system |
| CellASIC ONIX2 FG | Merck Millipore | ONIX2 1.0.1 | Microfluidic software |
| CellASIC ONIX2 Manifold Basic | Merck Millipore | CAX2-MBC20 | Manifold system |
| CytoOne 96-well plate with lid | Starlab | CC7672-7596 | Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader |
| E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion | Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655 | ||
| Fiji | ImageJ | https://fiji.sc/ | Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication |
| Gene Frame | Thermo Scientific | AB-0578 | Blue frame (125 μL, 1,7 x 2,8 cm) |
| Luria-Broth agarose medium | MP Biomedicals | 3002232 | Growth medium for plating assay |
| MicrobeJ | Imagej/Fiji plugin | https://www.microbej.com/ | Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters |
| Microfluidic Plates CellASIC ONIX | Merck Millipore | B04A-03-5PK | Plate for Microfluidic system |
| Microscope Nikon eclipse Ti | Nikon | Fluorescence microscope | |
| MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM) | Teknova | M2105 | Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 μm |
| SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S34854 | DNA fluorescent dye |
| TECAN Infinite M1000 | TECAN | 30034301 | Automated plate reader |
References
- Donachie, W. D., Begg, K. J., Vicente, M. Cell length, cell growth and cell division. Nature. 264 (5584), 328-333 (1976).
- Donachie, W. D., Blakely, G. W. Coupling the initiation of chromosome replication to cell size in Escherichia coli. Current Opinion in Microbiology. 6 (2), 146-150 (2003).
- Patterson, D., Gillespie, D. Effect of Elevated Temperatures on Protein Synthesis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 112 (3), 1177 (1972).
- Begg, K. J., Donachie, W. D. Cell shape and division in Escherichia coli: experiments with shape and division mutants. Journal of Bacteriology. 163 (2), 615-622 (1985).
- Van De Putte, P., Van Dillewijn, J., Roersch, A. The Selection of Mutants of Escherichia Coli with Impaired Cell Division at Elevated Temperature. Mutation Research. 106, 121-128 (1964).
- Walker, A. R. Initial characterization of temperature-sensitive cell division mutants of Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 47 (5), 1074-1079 (1972).
- Lesterlin, C., Duabrry, N.
- Stracy, M., et al. Live-cell superresolution microscopy reveals the organization of RNA polymerase in the bacterial nucleoid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (32), E4390-E4399 (2015).
- Fisher, J. K., et al. Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells. Cell. 153 (4), 882-895 (2013).
- Lesterlin, C., Pages, C., Dubarry, N., Dasgupta, S., Cornet, F. Asymmetry of chromosome Replichores renders the DNA translocase activity of FtsK essential for cell division and cell shape maintenance in Escherichia coli. PLoS genetics. 4 (12), e1000288 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji - an Open Source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), (2019).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. 1 (7), 16077 (2016).
- Rolinson, G. N. Effect of beta-lactam antibiotics on bacterial cell growth rate. Journal of General Microbiology. 120 (2), 317-323 (1980).
- Boye, E., Løbner-Olesen, A.
- Rieseberg, M., Kasper, C., Reardon, K. F., Scheper, T.
- Nolivos, S., et al. Role of AcrAB-TolC multidrug efflux pump in drug-resistance acquisition by plasmid transfer. Science. 364 (6442), 778-782 (2019).
- Chao, Y., Zhang, T. Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy. Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).
