Summary
Denne protokollen tillater en tid-løst beskrivelse av bakteriell vekst under stress forhold på enkelt celle og cellen befolkning nivåer.
Abstract
Analyse av bakteriell evne til å vokse og overleve under stress forhold er avgjørende for et bredt spekter av mikrobiologi studier. Det er relevant å karakterisere responsen av bakterielle celler til stress-inducing behandlinger som eksponering for antibiotika eller andre antimikrobielle forbindelser, bestråling, ikke-Fysiologiske pH, temperatur, eller saltkonsentrasjon. Ulike stress behandlinger kan forstyrre ulike cellulære prosesser, inkludert celledeling, DNA-replikering, proteinsyntese, membran integritet eller celle syklus regulering. Disse effektene er vanligvis forbundet med bestemte fenotyper på mobilnettet skala. Derfor krever forståelse av omfanget og årsakssammenheng av stress-indusert vekst eller levedyktighet mangler en grundig analyse av flere parametre, både på single-celle og på befolkningsnivå. Den eksperimentelle strategien som presenteres her kombinerer tradisjonell optisk tetthet overvåking og plating analyser med enkelt celle analyse teknikker som flyt flowcytometri og sanntid mikroskopi Imaging i levende celler. Dette multiscale rammeverket tillater en tids løst beskrivelse av virkningen av stress forhold på skjebnen til en bakteriell befolkning.
Introduction
Det overordnede formålet med denne protokollen er å analysere atferden til bakterielle celler utsatt for stress behandlinger på befolkningen og på enkelt cellenivå. Bakteriell vekst og levedyktighet er tradisjonelt adressert på befolkningsnivå ved hjelp av optisk tetthet overvåking (OD600nm), som er en proxy av bakteriell cellemasse syntese, eller av plating analyser for å bestemme konsentrasjonen av levedyktige celler i kulturen (koloni forming enhet per MILLILITER, CFU/ml). Under normale (trykklette) vekstforhold, OD600nm og CFU/ml målinger er strengt korrelert fordi bakteriell dobling tid avhenger direkte på celle massen økning1,2. Imidlertid er denne sammenhengen ofte forstyrret under forhold som påvirker celle massen syntese3, celle divisjon4, eller som utløser cellelyse. Et enkelt eksempel er levert av stress behandlinger som hemmer celledeling, noe som resulterer i dannelsen av trådformede bakterielle celler5,6. Trådformede celler forlenge normalt fordi cellen masse syntese er upåvirket, men de er ikke i stand til å dele inn i levedyktige celler. Kulturen optisk tetthet vil følgelig øke over tid i en normal hastighet, men ikke konsentrasjonen av levedyktige celler bestemmes av plating analyser (CFU/mL). I dette tilfellet, som i mange andre, optisk tetthet og plating målinger er informative, men ikke klarer å gi en helhetlig forståelse av den observerte stress-indusert effekt. Disse ensemble analysene må kombineres med én celle analyse teknikker for å tillate en inngående karakterisering av stress-indusert vekst mangler.
Her beskrives en prosedyre som kombinerer fire komplementære eksperimentelle tilnærminger: (1) tradisjonell plating analyser og grunnleggende optisk tetthet overvåking for å overvåke celle levedyktighet og cellemasse syntese, henholdsvis; (2) Flow flowcytometri å evaluere Cellestørrelse og DNA-innhold parametere på et stort antall celler; (3) mikroskopi Snapshot Imaging å analysere celle morfologi; og (4) tidsforløp én celle Imaging i mikrovæskebasert kamre for undersøkelse av den timelige dynamikken i cellen skjebne. Dette multi-skala rammeverk kan tolke den globale effekter på cellevekst og levedyktighet i lys av atferden til enkeltceller. Denne prosedyren kan brukes til å dechiffrere responsen av ulike bakteriearter til nesten alle stress av interesse, inkludert vekst under spesielle forhold (dvs. vekstmedium, pH, temperatur, saltkonsentrasjon), eller eksponering for antibiotika eller andre antimikrobielle forbindelser.
Protocol
1. cellekultur, stress-induksjon, og prøvetaking prosedyre
Merk: Bruk sterile kultur glass, pipette tips og vekstmedium filtrert på 0,22 μm for å unngå bakgrunns partikler. Her dyrkes cellekulturer i lave autofluorescence rike definerte medium (se tabell over materialer)7,8.
- Strek bakteriell stamme av interesse fra en frossen glyserol lager på en Luria-buljong (LB) agarose plate (med selektiv antibiotika hvis nødvendig) og ruge ved 37 ° c over natten (17 h).
Merk: eksempel eksperimentet som presenteres her bruker Escherichia coli MG1655 hupA-mCherry. Denne belastningen produserer fluorescensmerkete merket delenhet α av HU nucleoid tilhørende protein, og dermed gir lys mikroskopi visualisering av kromosom i levende celler9. - Vaksinere 5 mL medium med en enkelt koloni og vokse ved 37 ° c med risting ved 140 rotasjon per minutt (rpm) over natten (17 h). Flasker (≥ 50 mL) eller store diameter (≥ 2 cm) reagensrør må brukes for å sikre tilfredsstillende lufting av den urolige kulturen.
- Neste morgen måle optisk tetthet på 600 NM (OD600nm) og fortynne kulturen i et reagensrør som inneholder friskt medium til en OD600nm av 0,01. Det totale volumet av kulturen må justeres avhengig av antall tid poeng som skal analyseres under eksperimentet.
- Last en 200 μL prøve av kulturen inn i en mikroplate (0,2 mL per brønn av arbeidsvolum med en klar gjennomsiktig bunn) og plasser den i en automatisert plate leser (se tabell over materialer) for OD600nm overvåking under Inkubasjons ved 37 ° c.
- Ruge det inokulert test røret ved 37 ° c med risting (140 RPM) til OD600nm = 0,2, tilsvarende full eksponentiell fase i rikt medium.
Merk: det er viktig å dyrke cellene i minst 4 − 5 generasjoner før du oppnår riktig eksponentiell vekst. Den innledende inokulum som ble brukt i trinn 1,3 (OD600nm = 0,01) må tilpasses i tilfelle av vekst i fattigere medium (dvs. hvor eksponentiell fase er nådd under OD 0,2), eller hvis flere generasjoner er ønsket (for eksempel for spesifikke fysiologiske studier eller til utvidet stress behandlinger). - Ved OD600nm = 0,2, ta følgende kultur prøver tilsvarende til t0 tid punkt (eksponentielt voksende celler før stress induksjon): (1) en 150 μL prøve å bli umiddelbart lagt i mikrovæskebasert apparat for time-lapse mikroskopi Imaging (se pkt. 2); (2) en 200 μL prøve for fortynning og plating analysen (se pkt. 3); (3) en 250 μL prøve som skal settes på is for strømnings flowcytometri analyse (avsnitt 4); (4) en 10 μL prøve skal umiddelbart avsettes på en agarose-montert lysbilde for mikroskopi Snapshot Imaging (se avsnitt 5).
- Utsett celle kulturen som gjenstår i test røret til den spesifikke stress behandlingen du ønsker å undersøke og ruge ved 37 ° c med risting (140 RPM).
Merk: kulturen vokser i den automatiserte plate leser for OD600nm overvåking bør også utsettes for stress behandling. - På relevante tidspunkt etter stress behandling (t1, t2, t3, osv.), ta følgende celleprøver fra stresset kultur: (1) en 200 μL prøve for fortynning og plating analysen (se pkt. 2); (2) en 250 μL prøve som skal settes på is for strømnings flowcytometri analyse (avsnitt 3); (4) en 10 μL prøve skal umiddelbart avsettes på en agarose-montert lysbilde for mikroskopi Snapshot Imaging (se avsnitt 4).
Merk: hver stress-inducing behandling har en virkningsgrad som er dose-og tidsavhengig. Derfor kan det være nødvendig å kjøre foreløpige tester for å bestemme dosen og varigheten av behandlingen som skal brukes for optimale resultater. Dette kan gjøres ved å utføre OD overvåking ved hjelp av en automatisert plate leser (potensielt assosiert med plating analyser) av en cellekultur behandlet med en rekke doser og eksponeringstider. I eksperimentet presenteres her, celle kulturen ble behandlet med cellen divisjon-hemme antibiotika Cephalexin (Ceph.) ved 5 μg/mL endelig konsentrasjon for 60 min. Cephalexin ble deretter vasket bort av pelleting cellene i en 15 mL rør ved hjelp av sentrifugering (475 g, 5 min), fjerne supernatanten, blanding cellen pellet i et likt volum av friskt medium av milde pipettering, og overføring til en ren tube. De vasket cellene ble inkubert ved 37 ° c med risting (140 RPM) for å tillate utvinning. Prøven ble tatt på t60 (60 min etter Cephalexin tillegg tilsvarende til ' Cephalexin-60min-behandlet ' Sample), t120 (60 min etter vask), og t180 (120 min etter vask).
2. plating analysen
Merk: plating analysen gir mulighet for å måle konsentrasjonen av celler i stand til å generere en CFU i kulturen prøvene. Denne prosedyren avslører hastigheten som en celle deler i to levedyktige celler og gjør det mulig å oppdage celledeling arrestasjoner (f. eks, økning av bakteriell generasjon tid cellelyse).
- Forbered 10-fold seriell fortynninger opp til 10-7 av 200 μL av kultur prøve i friskt medium. Plate 100 μL av riktig fortynning på ikke-selektive LB agarose plater for å oppnå mellom 3 − 300 kolonier etter natten inkubasjons ved 37 ° c.
Merk: seriell fortynning i friskt medium må utføres raskt for å begrense bakterie divisjoner. Alternativt kan forskerne vurdere å bruke en saltoppløsning uten en karbon kilde for å hindre celle divisjoner under fortynning prosessen. - Neste dag, telle antall kolonier for å bestemme konsentrasjonen av levedyktige celler (CFU/mL) i hver kultur prøven. Plotte CFU/mL som en funksjon av tid for ubehandlet og behandlet cellekulturer.
3. Flow flowcytometri
Merk: følgende avsnitt beskriver utarbeidelse av celleprøver for Flow flowcytometri analyse. Denne analyse teknikken avslører fordelingen av Cellestørrelse og DNA-innhold for et stort antall celler. Når det er mulig, anbefales det å behandle flyt flowcytometri prøvene umiddelbart. Alternativt kan prøvene holdes på is (for opp til 6 h) og analyseres samtidig på slutten av dagen, når plating og mikroskopi Imaging er utført.
- Fortynne 250 μL av kultur prøve for å oppnå 250 μL ved en konsentrasjon på ~ 15 000 celler/μL (tilsvarende en OD600nm ~ 0,06) i friskt medium ved 4 ° c.
Merk: Inkubasjons på isen vil begrense vekst og morfologiske modifikasjon av cellene. Alternativt kan brukeren vurdere å utføre fiksering av cellene i 75% etanol, som vanligvis anbefales for Flow flowcytometri10. - For DNA farging, bland bakteriell prøve med en 10 μg/mL løsning av DNA fluorescerende fargestoff (ratio 1:1) og ruge i mørket i 15 minutter før analysere prøven.
- Pass prøven i strømnings flowcytometer med en ~ 120 000 celler/min strømningshastighet. Erverve Forward-spredte (FSC) og side-spredte (SSC) lys samt DNA fluorescerende fargestoff fluorescens signal (FL-1) med de riktige innstillingene.
- Plot The FSC og FL-1 celle tetthet histogrammer å representere fordelingen av Cellestørrelse og DNA-innhold i cellen befolkningen.
4. øyeblikksbilde mikroskopi avbildning
Merk: følgende del beskriver utarbeidelse av mikroskopi lysbilder og bilde oppkjøpet for befolkningen Snapshot analyse. Denne prosedyren vil gi informasjon om morfologi av cellene (celle lengde, bredde, form) og intracellulære organisering av nucleoid DNA.
- Varm opp det thermostated mikroskop kammeret ved 37 ° c for å stabilisere temperaturen før observasjonene starter. Dette kammeret tillater temperatur modulering av mikroskop optikk og prøven scenen under time-lapse eksperimenter.
- Klargjør de agarose lysbildene som beskrevet i Lesterlin og Dubarry7.
- Fjern plastfilmen fra bunnen av den blå rammen (se tabell over materialer), slik at den uthult plastfilmen på den andre siden. Stick den blå rammen på et mikroskop glass lysbilde.
- Pipette ~ 150 μL av smeltet 1% agarose medium løsning og hell innenfor den blå rammen kupé. Dekk raskt med en ren dekkglass for å fjerne overflødig væske og vent noen minutter på at agarose puten stivner ved romtemperatur.
- Når Celleprøven er klar, fjerner du dekkglass og plastfilmen fra den blå rammen. Hell 10 μL av celleprøve på agarose puten og vipp glass skyve forsiktig for å spre dråpe. Når all væsken er adsorberes, stikker du en ren dekkglass på den blå rammen for å forsegle prøven. Den mikroskopi raset er nå klar for mikroskopi.
- Plasser lysbildet på scenen for mikroskopet og utfør bilde anskaffelse ved hjelp av overført lys (med mål for fase kontrast) og med lys kilde eksitasjon på de aktuelle bølgelengdene (560 NM for mCherry).
- Velg visningsfelt som inneholder isolerte celler for å forenkle automatisk celle registrering under bildeanalyse. Sørg for at minst 300 celler er avbildet for å tillate robust statistisk analyse av cellen befolkningen.
5. materialer tid-lapse mikroskopi tenkelig
Merk: følgende del forklarer utarbeidelse av mikrovæskebasert platene (se tabell over materialer), celle lasting, materialer program, og time-lapse image oppkjøp. Denne bildebehandlings prosedyren viser atferden til enkeltceller i sanntid.
- Fjern bevarings løsningen fra mikrovæskebasert platen og Bytt den ut med friskt medium forvarmet til 37 ° c, som beskrevet i brukerveiledningen for mikrovæskebasert-programvaren.
- Forsegle mikrovæskebasert platen til manifold systemet og klikk på priming knappen.
- Plasser mikrovæskebasert plate med manifold system på mikroskopet scenen og varm ved 37 ° c for ~ 2 h før du starter mikroskopi oppkjøpet.
Merk: Dette forvarming trinnet er avgjørende for å unngå utvidelse av mikrovæskebasert kammeret, noe som ville endre fokus for mikroskopet under tidsforløp eksperimentet og kompromiss bilde oppkjøpet. - Forsegle mikrovæskebasert plate. Bytt medium fra brønn 8 med 150 μL av kultur prøve og Bytt ut mediet fra brønn 1 til 5 ved ønsket medium med eller uten stress-inducing reagens.
- Forsegle mikrovæskebasert plate og plassere den på mikroskopet scenen.
- På mikrovæskebasert programvare (se tabell over materialer) kjøre celle lasting prosedyren. Kontroller at lastingen av cellene er tilfredsstillende ved å se under mikroskopet i overført lys. Kjør celle lasting prosedyren en gang hvis celle tettheten i kammeret er utilstrekkelig.
- Utfør nøye fokus i overført lys modus og velg flere visningsfelt som viser isolerte bakterier. Det er viktig å velge felt som ikke er overfylte for å kunne overvåke veksten av isolerte celler over tid (~ 10 − 20 celler per 100 μm2 anbefales). Dette vil også lette celle deteksjon under bildeanalyse.
- Klikk på Opprett en protokoll-knappen på mikrovæskebasert programvare. Program injeksjon av vekstmedium for 1 − 2 generasjonstid ekvivalenter å tillate for cellene å tilpasse (valgfritt). Deretter programmere injeksjon av stress-inducing medium i løpet av 10 min ved 2 PSI, etterfulgt av injeksjon på 1 PSI for ønsket varighet av stress behandling. Hvis du har tenkt å analysere utvinningen av cellene etter stress, programmere injeksjon av frisk vekstmedium for ønsket varighet.
Merk: i eksperimentet presenteres her, Cephalexin ble injisert i 10 min ved 2 PSI, etterfulgt av 50 min på 1 PSI. Deretter ble frisk vekstmedium injisert ved 2 PSI i 10 min, etterfulgt av 3 t på 1 PSI. - Utfør mikroskopi Imaging i time-lapse modus med 1 ramme hver 10 min bruker fase kontrast i overført lys og en 560 NM eksitasjon lyskilde for mCherry signalet hvis nødvendig.
Merk: det er viktig å begynne med mikroskopisk bildeoppkjøp samtidig som starten av mikrovæskebasert injeksjon protokollen.
6. bildeanalyse
Merk: denne delen beskriver kort de viktigste trinnene for behandling og analyse av øyeblikksbilder og tidsforløp mikroskopi avbildninger. Åpning og visualisering av mikroskopi bilder er gjort med åpen kilde ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/)11. Kvantitativ bildeanalyse utføres ved hjelp av åpen kilde ImageJ/Fiji programvare sammen med den frie MicrobeJ plugin12 (https://microbej.com). Denne protokollen bruker MicrobeJ 5.13 I-versjon.
- Åpne Fiji programvare og MicrobeJ plugin.
- For Snapshot analyse, drop alle bilder som tilsvarer ett mikroskop lysbilde (ett utvalg) i MicrobeJ lasting bar å sammenkoble bilder og lagre den oppnådde bildet stabler filen. For tid-lapse data, rettferdig miste bildet stabel inn i lessing stang av MicrobeJ.
- Kjør Automatisert påvisning av cellene skisserer basert på segmentering av fase kontrast bilde og, hvis relevant, av nucleoids basert på segmentering av farget DNA fluorescens signal. Kontroller nøyaktigheten av celle deteksjon visuelt og bruke MicrobeJ redigeringsverktøy for korrigering hvis nødvendig. Lagre resultatfilen som er innhentet.
Merk: innstillingene som brukes for påvisning av E. coli celler er angitt i tabellen av materialer (se kommentarer/beskrivelse kolonne av MicrobeJ). For andre bakterielle arter (spesielt for ikke-Rod-form bakterier), må brukeren avgrense innstillingene før deteksjon (se MicrobeJ tutorial). For tidsforløpbilder, kjører en semi-automatisert deteksjon av cellene ved hjelp av MicrobeJ redigering verktøyet kan foretrekkes å tillate fokusering på skjebnen til enkelte celler (se MicrobeJ tutorial). - Klikk på ikonet ResultJ å fullføre analysen og få ResultJ vinduet. Mange forskjellige typer output grafer kan genereres fra det punktet. Plot normalisert histogrammer av celle form/lengde og gjennomsnittlig nucleoid tall per celle.
Representative Results
Prosedyren beskrevet ble brukt til å analysere atferden til Escherichia coli K12 celler under transient eksponering for Cephalexin, et antibiotikum som spesifikt hemmer Cell Division (figur 1A)13. Den hupA-mCherry E. coli stamme som produserer fluorescensmerkete merket Hu protein knyttet til kromosom DNA ble brukt til å undersøke dynamikken i kromosom gjennom denne behandlingen8,9. Den eksponentielt voksende hupA-MCherry E. coli celler ble analysert før (t0) og 60 min etter inkubasjons med Cephalexin (t60). Deretter ble antibiotika vasket bort og utvinningen av cellen befolkning etter 1 h (t120) og 2 h (t180) ble analysert (figur 1B).
Figur 1: prosedyre for analyse av bakteriell respons på stress behandlinger. (A) skjematisk av metoden. (B) Cartoon illustrerer cellen morfologi under normal vekst i rikt medium og under forbigående eksponering for Cephalexin (Ceph.), fra tillegg til (t0) og etter Cephalexin vasking fra (t60) til (t180). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Den parallelle utviklingen av OD og CFU/mL er en første indikator som bidrar til å forstå effekten av stress behandlinger. Disse to parametrene er strengt korrelert under Uaffisert vekst, men er ofte lokomotivet og utvikles uavhengig under stress. Cell kulturer vokser i nærvær av Cephalexin utstilt lignende OD600nm øker som trykklette kulturer (figur 2A), viser at stoffet ikke påvirker celle massen syntese. Men konsentrasjonen av levedyktige celler ikke øke når Cephalexin var tilstede på grunn av streng hemming av celledeling (figur 2B). Celler begynte å dele igjen når Cephalexin ble fjernet og til slutt nådde en konsentrasjon som tilsvarer den trykklette kulturen på (t180). Disse resultatene reflekterer den bakteriostatisk effekten av Cephalexin, som induserer en fullt reversibel hemming av celledeling. Ulike påkjenninger vil resultere i ulike frakobling av OD og CFU/mL kurver, avhengig av effekten indusert (f. eks modifisering av cellen morfologi som filamentation eller svulmende, celle død med eller uten lyse). En ufullstendig liste over mulige resultat resultater indikasjon på ulike stress-indusert effekter er presentert i figur 2C.
Figur 2: bakteriell vekst overvåking av ubehandlet og Cephalexin-behandlet celler på befolkningsnivå. (A) overvåking av optisk TETTHET (OD600nm/ml). (B) konsentrasjon av levedyktig celle (CFU/ml) innenfor ubehandlet og Cephalexin-60min-behandlede kulturer. Feilfelt angir standardavviket for en eksperimentell tre eksemplarer. (C) skjematisk mulige resultater og tilhørende stress effekter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
En-celle analyse er viktig å nøyaktig tolke stress responsen observert på befolkningsnivå. Flow flowcytometri tillater undersøkelse av Cellestørrelse og DNA-innhold av flere tusen celler14,15 (Figur 3). Eksponering for Cephalexin provoserte parallell økning av Cellestørrelse og DNA-innhold (t60). Når Cephalexin ble fjernet, befolknings Cellestørrelse og DNA-innhold gradvis redusert til å bli lik den trykklette befolkningen på t180. Disse resultatene viser at Cephalexin ikke hemmer DNA-replikering og provoserte dannelsen av trådformede celler som inneholdt flere kromosom ekvivalenter. Disse filamenter delt inn i celler med normal Cellestørrelse og DNA-innhold når stoffet ble vasket bort. Flow flowcytometri resultater vil være svært forskjellig for påkjenninger som hemmer DNA-syntese, noe som fører til dannelsen av trådformede celler som inneholder bare en ikke-replikerer kromosom. I så fall vil Cellestørrelse øke tilsvarende, men vil ikke bli assosiert med økning i DNA-innhold.
Figur 3: representativ flyt flowcytometri analyse av ubehandlede og Cephalexin-60min-behandlede celler. (A) Cellestørrelse distribusjon histogrammer (FSC-H). (B) DNA-innhold histogrammer (FL1-SYTO9). n = 120 000 celler analysert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Snapshot mikroskopi Imaging ble brukt til å undersøke cellen morfologi og intracellulære organisering av DNA vist av HU-mCherry lokalisering (Figur 4A). Cephalexin provoserte dannelsen av lange celler med normal cellebredde og ingen divisjon septa. Disse glatte filamenter inneholdt regelmessig linjeavstand DNA strukturer kalt nucleoids, bekrefter at Cephalexin ikke påvirker kromosom replikering og segregering. Kvantitativ bildeanalyse i stor grad bekreftet Cellestørrelse og DNA-innhold øker tidligere observert med Flow flowcytometri (Figur 4B, C). Resultatene ville være svært forskjellig for påkjenninger som induserer DNA-skade, noe som fører til dannelsen av trådformede celler der replikering fortsetter, men segregering er svekket. I så fall vil Cellestørrelse og DNA-innhold øke på samme måte, men cellene ville havne en enkelt ustrukturert masse av DNA. Snapshot-bilder kan også avsløre andre typer avvikende celle figurer eller tilstedeværelsen av mini-, anucleate-eller lysert-celler (spøkelses celler).
Figur 4: mikroskopi øyeblikksbilde analyse av ubehandlede og Cephalexin-60min-behandlede celler. (A) representative mikroskopi bilder som viser fase kontrast (grå) og Hu-mCherry signal (rød). (B) celle lengde distribusjon histogrammer. Scale bar = 5 μm. (C) histogrammer av antall nucleoid per celle. Mellom 800 og 2 000 celler ble analysert for hver prøve. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Time-lapse mikroskopi knyttet til mikrovæskebasert apparater16 bidratt til å bestemme fenotyper tidligere observert og gir ytterligere innsikt om utvikling og årsakssammenheng av vekst mangel. Tidsforløpbilder (figur 5A og film 1) bekreftet at celle forlengelse (cellemasse syntese), og kromosom replikering og segregering ikke ble hemmet av eksponering for Cephalexin. I tillegg avslørte prosessen med utvinning når Cephalexin ble fjernet. Analyse av trådformede celle avstamning viste at celledeling starter på nytt ~ 20 min etter å ha vasket bort stoffet (figur 5B). Den resulterende delte celler var levedyktig, fordi de i sin tur delt, til slutt fører til dannelsen av 33 celler som viser normal størrelse og DNA-innhold. Dette tillot beregning av en samlet generasjon tid på ~ 31 min over 180 min av eksperimentet, som ligner på generering tid beregnet for trykklette befolkningen fra CFU/mL målinger (~ 33 min).
Figur 5: mikroskopi tidsforløp analyse av Cephalexin-60min-behandlede celler. (A) representative mikroskopi bilder som viser fase kontrast (grå) og Hu-mCherry signal (rød). Den overvåkede trådformede cellen indikeres av hvit omrisset og delte celler med forskjellige farger. Scale bar = 5 μm. (B) skjematisk fremstilling av trådformede celle avstamning tilsvarende panel (A) og til film 1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1: mikrovæskebasert film av E. coli Hu-mCherry behandlet med Cephalexin. Cephalexin ble injisert etter 60 min, etterfulgt av injeksjon av fersk RDM medium for 3 h. tid angitt i gult (1 ramme hver 10 min). Scale bar = 5 μm. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).
Discussion
Det er viktig å ta hensyn til vekst tilstanden i cellene under prosedyren. Vokse cellene over flere generasjoner før de når en full eksponentiell fase. For suksessen med denne metoden, er det viktig at alle celler prøvene er samlet samtidig, og det er best å analysere bare én behandlet og en ubehandlet kultur på samme tid. Celleprøver for mikroskopi avbildning må opprettholdes ved eksperimentell temperatur gjennom hele prosedyren. Det er da viktig å forvarming av mikroskopet kammeret og mikrovæskebasert kammer før begynnelsen av eksperimentet. Hvis celleprøver for strømnings flowcytometri ikke kan analyseres lett, kan de holdes på isen for opp til 6 h. Inkubasjons på isen vil begrense vekst og morfologiske modifikasjon av cellene. Alternativt kan brukeren vurdere å bruke fiksering av cellene i etanol 75%, som vanligvis anbefales for Flow flowcytometri10. Hvis protokollen krever vask stresset spole fra mediet, sentrifuger og pipette celler svært nøye for å unngå å skade de potensielle avvikende celler.
Både Flow flowcytometri og Snapshot analyse gir tilgang til Cellestørrelse og DNA-innhold parametere, med øyeblikksbilder gir ekstra observasjon av cellen morfologi. DNA farging med DAPI10 (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) eller andre stabile DNA fargestoffer kan utføres hvis ingen fluorescerende fusjon er tilgjengelig for å observere nucleoids i organismen av interesse. Hvis flyt flowcytometri analyse ikke kan utføres, er det viktig å avbilde og analysere et stort antall celler ved mikroskopi.
Mikroskopi avbildning kan også utføres ved hjelp av stammer som frakter fluorescerende fusjoner til proteiner som er involvert i bestemte veier av interesse. Dette vil bidra til å avdekke effekten av stress på en rekke cellulære prosesser som for eksempel replikering, transkripsjon, celle veggen syntese, eller celledeling. Metoden kan brukes på en rekke bakterielle arter, det eneste kravet er at mikrovæskebasert apparatet må være kompatibel med morfologi av cellene. Standard mikrovæskebasert plater er praktisk for stang-form bakterier med en cellebredde mellom 0,7 μm og 4,5 μm. Men, cocci, ovococci, eller andre bakterielle stammer med særegne former må testes. Alternativt, hvis mikrovæskebasert eksperimenter ikke kan utføres på grunn av utilgjengelighet av utstyret eller inkompatible bakterielle stammer, kan tidsforløp Imaging utføres på agarose-monterte lysbilder for en maksimal varighet på 2h.
Den samlede fordelen med denne multi-skala analyse er å gi en global visjon av effekten av stress induksjon på flere aspekter av bakteriell vekst evne (dvs., masse syntese, celle levedyktighet, celle morfologi, membran integritet, DNA-innhold) og måten disse utvikler seg med tiden i en bakteriell befolkning vokser under stress forhold. Den gjør det også mulig å analysere restaurering av normal vekst på enkelt cellenivå og befolkningsnivå. Tilnærmingen gjelder for et bredt spekter av bakterielle arter og til nesten alle slags stress behandling, for eksempel eksponering for antibiotika eller andre antimikrobielle forbindelser, analyse av påvirkning av interaksjon med andre organismer i multispecies populasjoner, eller effekten av genetisk mutasjon.
Disclosures
Forfatterne erklærte ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker F. kjeks for å gi hupA-mCherry belastning, A. Dedieu for teknisk assistanse med flowcytometri, og a. Ducret for hjelp med MicrobeJ. Finansiering: C. Lesterlin erkjenner INSERM og CNRS institusjoner så vel som ATIP-Avenir programmet, Schlumberger stiftelsen for utdanning og forskning (FSER 2019), den ANR finansiering for PlasMed forskningsprogram (ANR-18-CE35-0008) samt FINOVI for finansiering til J. Cayron; La Ligue contre Le kreft for finansiering av flyten flowcytometer utstyr. Forfatter bidrag: CL og JC utformet prosedyren og skrev avisen; JC utførte eksperimenter og analysert dataene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | BioRad | 1613100 | Certified molecular biology agarose |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | ThermoFisher scientific | A24858 | Cytometer |
| CellASIC ONIX Microfluidic System | Merck Millipore | CAX2-S0000 | Microfluidic system |
| CellASIC ONIX2 FG | Merck Millipore | ONIX2 1.0.1 | Microfluidic software |
| CellASIC ONIX2 Manifold Basic | Merck Millipore | CAX2-MBC20 | Manifold system |
| CytoOne 96-well plate with lid | Starlab | CC7672-7596 | Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader |
| E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion | Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655 | ||
| Fiji | ImageJ | https://fiji.sc/ | Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication |
| Gene Frame | Thermo Scientific | AB-0578 | Blue frame (125 μL, 1,7 x 2,8 cm) |
| Luria-Broth agarose medium | MP Biomedicals | 3002232 | Growth medium for plating assay |
| MicrobeJ | Imagej/Fiji plugin | https://www.microbej.com/ | Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters |
| Microfluidic Plates CellASIC ONIX | Merck Millipore | B04A-03-5PK | Plate for Microfluidic system |
| Microscope Nikon eclipse Ti | Nikon | Fluorescence microscope | |
| MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM) | Teknova | M2105 | Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 μm |
| SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S34854 | DNA fluorescent dye |
| TECAN Infinite M1000 | TECAN | 30034301 | Automated plate reader |
References
- Donachie, W. D., Begg, K. J., Vicente, M. Cell length, cell growth and cell division. Nature. 264 (5584), 328-333 (1976).
- Donachie, W. D., Blakely, G. W. Coupling the initiation of chromosome replication to cell size in Escherichia coli. Current Opinion in Microbiology. 6 (2), 146-150 (2003).
- Patterson, D., Gillespie, D. Effect of Elevated Temperatures on Protein Synthesis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 112 (3), 1177 (1972).
- Begg, K. J., Donachie, W. D. Cell shape and division in Escherichia coli: experiments with shape and division mutants. Journal of Bacteriology. 163 (2), 615-622 (1985).
- Van De Putte, P., Van Dillewijn, J., Roersch, A. The Selection of Mutants of Escherichia Coli with Impaired Cell Division at Elevated Temperature. Mutation Research. 106, 121-128 (1964).
- Walker, A. R. Initial characterization of temperature-sensitive cell division mutants of Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 47 (5), 1074-1079 (1972).
- Lesterlin, C., Duabrry, N.
- Stracy, M., et al. Live-cell superresolution microscopy reveals the organization of RNA polymerase in the bacterial nucleoid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (32), E4390-E4399 (2015).
- Fisher, J. K., et al. Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells. Cell. 153 (4), 882-895 (2013).
- Lesterlin, C., Pages, C., Dubarry, N., Dasgupta, S., Cornet, F. Asymmetry of chromosome Replichores renders the DNA translocase activity of FtsK essential for cell division and cell shape maintenance in Escherichia coli. PLoS genetics. 4 (12), e1000288 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji - an Open Source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), (2019).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. 1 (7), 16077 (2016).
- Rolinson, G. N. Effect of beta-lactam antibiotics on bacterial cell growth rate. Journal of General Microbiology. 120 (2), 317-323 (1980).
- Boye, E., Løbner-Olesen, A.
- Rieseberg, M., Kasper, C., Reardon, K. F., Scheper, T.
- Nolivos, S., et al. Role of AcrAB-TolC multidrug efflux pump in drug-resistance acquisition by plasmid transfer. Science. 364 (6442), 778-782 (2019).
- Chao, Y., Zhang, T. Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy. Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).
