Denne protokollen tillater en tid-løst beskrivelse av bakteriell vekst under stress forhold på enkelt celle og cellen befolkning nivåer.
Analyse av bakteriell evne til å vokse og overleve under stress forhold er avgjørende for et bredt spekter av mikrobiologi studier. Det er relevant å karakterisere responsen av bakterielle celler til stress-inducing behandlinger som eksponering for antibiotika eller andre antimikrobielle forbindelser, bestråling, ikke-Fysiologiske pH, temperatur, eller saltkonsentrasjon. Ulike stress behandlinger kan forstyrre ulike cellulære prosesser, inkludert celledeling, DNA-replikering, proteinsyntese, membran integritet eller celle syklus regulering. Disse effektene er vanligvis forbundet med bestemte fenotyper på mobilnettet skala. Derfor krever forståelse av omfanget og årsakssammenheng av stress-indusert vekst eller levedyktighet mangler en grundig analyse av flere parametre, både på single-celle og på befolkningsnivå. Den eksperimentelle strategien som presenteres her kombinerer tradisjonell optisk tetthet overvåking og plating analyser med enkelt celle analyse teknikker som flyt flowcytometri og sanntid mikroskopi Imaging i levende celler. Dette multiscale rammeverket tillater en tids løst beskrivelse av virkningen av stress forhold på skjebnen til en bakteriell befolkning.
Det overordnede formålet med denne protokollen er å analysere atferden til bakterielle celler utsatt for stress behandlinger på befolkningen og på enkelt cellenivå. Bakteriell vekst og levedyktighet er tradisjonelt adressert på befolkningsnivå ved hjelp av optisk tetthet overvåking (OD600nm), som er en proxy av bakteriell cellemasse syntese, eller av plating analyser for å bestemme konsentrasjonen av levedyktige celler i kulturen (koloni forming enhet per MILLILITER, CFU/ml). Under normale (trykklette) vekstforhold, OD600nm og CFU/ml målinger er strengt korrelert fordi bakteriell dobling tid avhenger direkte på celle massen økning1,2. Imidlertid er denne sammenhengen ofte forstyrret under forhold som påvirker celle massen syntese3, celle divisjon4, eller som utløser cellelyse. Et enkelt eksempel er levert av stress behandlinger som hemmer celledeling, noe som resulterer i dannelsen av trådformede bakterielle celler5,6. Trådformede celler forlenge normalt fordi cellen masse syntese er upåvirket, men de er ikke i stand til å dele inn i levedyktige celler. Kulturen optisk tetthet vil følgelig øke over tid i en normal hastighet, men ikke konsentrasjonen av levedyktige celler bestemmes av plating analyser (CFU/mL). I dette tilfellet, som i mange andre, optisk tetthet og plating målinger er informative, men ikke klarer å gi en helhetlig forståelse av den observerte stress-indusert effekt. Disse ensemble analysene må kombineres med én celle analyse teknikker for å tillate en inngående karakterisering av stress-indusert vekst mangler.
Her beskrives en prosedyre som kombinerer fire komplementære eksperimentelle tilnærminger: (1) tradisjonell plating analyser og grunnleggende optisk tetthet overvåking for å overvåke celle levedyktighet og cellemasse syntese, henholdsvis; (2) Flow flowcytometri å evaluere Cellestørrelse og DNA-innhold parametere på et stort antall celler; (3) mikroskopi Snapshot Imaging å analysere celle morfologi; og (4) tidsforløp én celle Imaging i mikrovæskebasert kamre for undersøkelse av den timelige dynamikken i cellen skjebne. Dette multi-skala rammeverk kan tolke den globale effekter på cellevekst og levedyktighet i lys av atferden til enkeltceller. Denne prosedyren kan brukes til å dechiffrere responsen av ulike bakteriearter til nesten alle stress av interesse, inkludert vekst under spesielle forhold (dvs. vekstmedium, pH, temperatur, saltkonsentrasjon), eller eksponering for antibiotika eller andre antimikrobielle forbindelser.
Det er viktig å ta hensyn til vekst tilstanden i cellene under prosedyren. Vokse cellene over flere generasjoner før de når en full eksponentiell fase. For suksessen med denne metoden, er det viktig at alle celler prøvene er samlet samtidig, og det er best å analysere bare én behandlet og en ubehandlet kultur på samme tid. Celleprøver for mikroskopi avbildning må opprettholdes ved eksperimentell temperatur gjennom hele prosedyren. Det er da viktig å forvarming av mikroskopet kammeret og mikrovæskebasert kammer før begynnelsen av eksperimentet. Hvis celleprøver for strømnings flowcytometri ikke kan analyseres lett, kan de holdes på isen for opp til 6 h. Inkubasjons på isen vil begrense vekst og morfologiske modifikasjon av cellene. Alternativt kan brukeren vurdere å bruke fiksering av cellene i etanol 75%, som vanligvis anbefales for Flow flowcytometri10. Hvis protokollen krever vask stresset spole fra mediet, sentrifuger og pipette celler svært nøye for å unngå å skade de potensielle avvikende celler.
Både Flow flowcytometri og Snapshot analyse gir tilgang til Cellestørrelse og DNA-innhold parametere, med øyeblikksbilder gir ekstra observasjon av cellen morfologi. DNA farging med DAPI10 (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole) eller andre stabile DNA fargestoffer kan utføres hvis ingen fluorescerende fusjon er tilgjengelig for å observere nucleoids i organismen av interesse. Hvis flyt flowcytometri analyse ikke kan utføres, er det viktig å avbilde og analysere et stort antall celler ved mikroskopi.
Mikroskopi avbildning kan også utføres ved hjelp av stammer som frakter fluorescerende fusjoner til proteiner som er involvert i bestemte veier av interesse. Dette vil bidra til å avdekke effekten av stress på en rekke cellulære prosesser som for eksempel replikering, transkripsjon, celle veggen syntese, eller celledeling. Metoden kan brukes på en rekke bakterielle arter, det eneste kravet er at mikrovæskebasert apparatet må være kompatibel med morfologi av cellene. Standard mikrovæskebasert plater er praktisk for stang-form bakterier med en cellebredde mellom 0,7 μm og 4,5 μm. Men, cocci, ovococci, eller andre bakterielle stammer med særegne former må testes. Alternativt, hvis mikrovæskebasert eksperimenter ikke kan utføres på grunn av utilgjengelighet av utstyret eller inkompatible bakterielle stammer, kan tidsforløp Imaging utføres på agarose-monterte lysbilder for en maksimal varighet på 2h.
Den samlede fordelen med denne multi-skala analyse er å gi en global visjon av effekten av stress induksjon på flere aspekter av bakteriell vekst evne (dvs., masse syntese, celle levedyktighet, celle morfologi, membran integritet, DNA-innhold) og måten disse utvikler seg med tiden i en bakteriell befolkning vokser under stress forhold. Den gjør det også mulig å analysere restaurering av normal vekst på enkelt cellenivå og befolkningsnivå. Tilnærmingen gjelder for et bredt spekter av bakterielle arter og til nesten alle slags stress behandling, for eksempel eksponering for antibiotika eller andre antimikrobielle forbindelser, analyse av påvirkning av interaksjon med andre organismer i multispecies populasjoner, eller effekten av genetisk mutasjon.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker F. kjeks for å gi hupA-mCherry belastning, A. Dedieu for teknisk assistanse med flowcytometri, og a. Ducret for hjelp med MicrobeJ. Finansiering: C. Lesterlin erkjenner INSERM og CNRS institusjoner så vel som ATIP-Avenir programmet, Schlumberger stiftelsen for utdanning og forskning (FSER 2019), den ANR finansiering for PlasMed forskningsprogram (ANR-18-CE35-0008) samt FINOVI for finansiering til J. Cayron; La Ligue contre Le kreft for finansiering av flyten flowcytometer utstyr. Forfatter bidrag: CL og JC utformet prosedyren og skrev avisen; JC utførte eksperimenter og analysert dataene.
Agarose | BioRad | 1613100 | Certified molecular biology agarose |
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | ThermoFisher scientific | A24858 | Cytometer |
CellASIC ONIX Microfluidic System | Merck Millipore | CAX2-S0000 | Microfluidic system |
CellASIC ONIX2 FG | Merck Millipore | ONIX2 1.0.1 | Microfluidic software |
CellASIC ONIX2 Manifold Basic | Merck Millipore | CAX2-MBC20 | Manifold system |
CytoOne 96-well plate with lid | Starlab | CC7672-7596 | Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader |
E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion | Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655 | ||
Fiji | ImageJ | https://fiji.sc/ | Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication |
Gene Frame | Thermo Scientific | AB-0578 | Blue frame (125 μL, 1,7 x 2,8 cm) |
Luria-Broth agarose medium | MP Biomedicals | 3002232 | Growth medium for plating assay |
MicrobeJ | Imagej/Fiji plugin | https://www.microbej.com/ | Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters |
Microfluidic Plates CellASIC ONIX | Merck Millipore | B04A-03-5PK | Plate for Microfluidic system |
Microscope Nikon eclipse Ti | Nikon | Fluorescence microscope | |
MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM) | Teknova | M2105 | Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 μm |
SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S34854 | DNA fluorescent dye |
TECAN Infinite M1000 | TECAN | 30034301 | Automated plate reader |