Summary
ここでは、臨界期の視覚可塑性の神経機構と特定遺伝子の影響を研究するための重要な方法である単眼視欠損および眼優位可塑性解析のための詳細なプロトコルを紹介します。ビジュアル開発。
Abstract
単眼視欠乏は、一次視覚皮質応答可塑性を誘導する優れた実験的パラダイムである。一般に、刺激に対する眼の対眼に対する皮質の応答は、マウスの主要視覚皮質(V1)の両眼セグメントにおける眼の眼の応答よりもはるかに強い。哺乳類の臨界期に、対側眼を縫合すると、V1細胞の対側眼刺激に対する応答性が急速に失われる。トランスジェニック技術の開発が続く中、トランスジェニックマウスを実験モデルとして用いて、特定の遺伝子が眼優位(OD)可塑性に及ぼす影響を調べる研究が増えています。本研究では、単眼視欠乏に関する詳細なプロトコルを紹介し、マウスV1におけるOD可塑性の変化を計算する。臨界期の4日間の単眼欠損(MD)の後、各ニューロンの向きの調整曲線を測定し、V1の層4ニューロンのチューニング曲線を、眼の両側と眼の両側の刺激との間で比較する。反側バイアス指数(CBI)は、各細胞の眼のODスコアを使用して、OD可塑性の程度を示すために計算することができる。この実験技術は、臨界期におけるOD可塑性の神経機構を研究し、神経発達における特定の遺伝子の役割を調査する上で重要である。大きな制限は、急性研究が異なる時間に同じマウスの神経可塑性の変化を調査できないことです。
Introduction
単眼視欠乏は、V1可塑性を調べる優れた実験パラダイムである。神経発達における視覚体験の重要性を研究するために、デビッド・フーベルとTorsten Wiesel1,2様々な時点で、様々な期間のために片目で正常な視力の子猫を奪った。その後、奪われた目と奪われた目に対するV1の応答強度の変化を観察した。彼らの結果は、最初の3ヶ月間に閉じられていた目に反応するニューロンの数が異常に少ないことを示した。しかし、子猫のニューロンからの反応は、1年間閉じられた正常な成虫の猫の目のものとすべての点で同じままであり、子猫は回復しませんでした。成虫猫のMDは、OD可塑性を誘導することはできません。したがって、視覚経験がV1配線に及ぼす影響は、短く明確に定義された開発段階で強く、その前後に同じ刺激の影響が少ない。視覚入力に対する感受性の増加のこのような段階は、視覚皮質における臨界期として知られている。
マウスは夜行性動物であるが、マウスV1の個々のニューロンは、猫3、4、5に見られるニューロンと同様の特性を有する。近年、トランスジェニック技術の急速な発展に伴い、視覚神経科学における研究の増加は、実験モデル6、7、8としてマウスを使用している。マウスの視覚研究では、神経科学者は突然変異体とノックアウトマウスラインを使用し、マウスの遺伝的構成を制御することができます。マウスV1はODカラムを欠いているが、V1双眼ゾーンの単一ニューロンは有意なOD特性を示す。例えば、ほとんどの細胞は、ipsilateral刺激よりも対側刺激に対してより強く反応する。臨界期中に片目を一時的に閉じ、OD指数分布9,10,11の有意な変化を誘発する。したがって、MDは、神経発達障害に関与する遺伝子が生体内の皮質可塑性にどのように影響するかを調べるためのOD可塑性モデルを確立するために使用することができる。
ここでは、MDの実験方法を紹介し、単眼視欠乏時のOD可塑性の変化を解析する一般的な方法(電気生理学的記録)を提案する。この方法は、20年以上20年以上の12年、13年、14、15、16年のために多くの研究室で広く使用されています。OD可塑性の測定にも用いられる他の方法があり、慢性視覚誘発電位(VEP)記録17、および固有光学イメージング(IOI)18などがある。この鋭い方法の重要な利点は、それが従うのが容易であり、結果が非常に信頼性が高いということです。
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Protocol
このプロトコルでは、雄C57Bl/6マウスは、四川省医学アカデミーと四川省人民病院実験動物研究所から得られた。すべての動物のケアと実験手順は、中国の電子科学技術大学の動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. マウスの出生後28日目の単眼剥奪(MD)
- 手術用具、縫合針(直径0.25mm、ひも径0.07mm)と綿棒をアルミニウムボックスに入れ、120°Cで0.5時間オートクレーブします。乾燥オーブンで外科用具を乾燥させる。
- 2%のアガロース溶液を調製し、固化を避けるために75°Cの水浴に入れます。
- マウスを麻酔するために酸素と混合イソファフルランを使用してください(2%誘導と1.2-1.5%のメンテナンス)。ステレオタキシック装置でマウスを固定し、熱調節装置を使用してマウスの体温を37 °Cに保ち、低体温を防ぎます。
- 両眼に石油系眼軟膏の薄い層を塗布します。
- 解剖顕微鏡の下で照明を用いて、片目に眼瞼を縫合する。まぶた2xの両側(図1A)を通して針を通し、約4針を作ります。
- スレッドを 2 ~ 3 倍ノットし、スレッドをトリムします。結び目に3μLの瞬間乾燥接着剤を塗布して安定性を高める。その後、余分な縫合糸をカットします。
- ブプレノルフィン(1 mg/kg)の腹腔内注射をマウスに与える。
- マウスを加熱パッドに移し、体温を37°Cに保ち、低体温を予防し、意識を取り戻すまで監視します。
- マウスが完全に目を覚ましているときは、別の保持ケージに入れます。
- 毎日まぶたをチェックして、閉じて感染していない状態を確認します。まぶたが見つかった場合は、マウスを除外します。
- 電気生理学的記録の前に、マウスを麻酔するために酸素と混合イセフルランを使用してください(2%の誘導および1.2-1.5%の維持)。
- 目のはさみでステッチを取り外し、眼球を露出します。目の蓋を慎重にトリミングします。
- レンズ溶液で目を洗い流し、顕微鏡で目を確認して明快さを確認してください。角膜の不透明性または感染の兆候を有するマウスを除外する。
2. 4日目の単眼脱退後のマウスV1双眼鏡領域の開頭術
- マウスを麻酔した後、つま先のピンチに対する応答の欠如によって麻酔の深さをチェックします。
- ステレオタキシー装置にマウスを置き、固定します。耳のバーと歯の棒の高さを調整して、脳を平らに安定に保ちます。
- 体温を維持するために加熱パッドを使用してください。
- 目の表面に石油系の目の軟膏を塗り、湿らせておきます。
- マウスの頭の毛を取り除き、皮膚を露出させます。ヨウ素と70%エタノール3倍の交互のスクラブで皮膚をこすります。
- 耳の間に皮膚の8×8mmの領域を切開して頭蓋骨を露出させ、頭皮組織を取り除きます。次に、30%過酸化水素で上に付いた結合組織を除去する。
- 小脳の上の頭蓋骨に1×1mmの穴を開けます。穴に小さな骨ネジを参考に貼り付けます。
- V1双眼領域の直径1mmの小さな開頭術を、逆半球から奪われた眼へ(図1B、A-P:λ -0.51-λ +1.67mm;M-L: -2.6 – -3.0 mm;D-V: 0– 1 mm)。脳を傷つけることなく、慎重に頭蓋骨の断片を取り除きます。
- 40°Cで75μLのアガロースで露出した皮質表面を覆い、乾燥を防ぎます。
- 立体タックスフレームにタングステン電極を固定します。露出した皮質の表面にタングステン電極を垂直に置き、V1の両眼領域は、記録された細胞が両眼に反応することを確認する。
- 綿棒を使用して目のゲルを取り除き、シリコンオイルを2時間ごとに目に塗布します。
3. 視覚刺激と電気生理学的記録
- 透明でないプラスチック板で片目をマスクします。マウスの目から液晶モニターを23cmに置きます。
- マウスが完全に麻酔されたとき、麻酔を0.5~0.8%に減らします。
- 油式マイクロマニピュレーターを使用して、微小電極電極をゆっくりと進めます。高い信号対ノイズ比が観測され、電極が層4に進んだ時に止めてください(図1C、深さ約250~450μm)。増幅率が1,000、フィルタが300~100Hz、サンプルレートが40Hzであることを確認します。
- LEDモニタ上にフルフィールド移動の大二乗格子(図1D、12方向、100%コントラスト、一時的な周波数の2つのHz、空間周波数の度合いあたり0.04サイクル)を提示します。
- イプシ側眼と反眼を別々に刺激することによって細胞の応答を測定する。現在の合計は3~5倍です。
- 各浸透で5〜8個の細胞の応答を測定します。各マウスで4~6回の貫入を行います。
- 記録後、イソファフルランの流量を5%以上に調整し、イソファフルラン曝露を1分間継続し、次いで頸椎転位を行う。
注:V1双眼鏡ゾーンでは、別々の貫通が200μm以上離れていました。
4. オフラインスパイクソートとデータ分析
- 未加工の信号がしきい値レベルを超えたときにスパイクを検出します。キャプチャしたスパイクを最初の正または負のピークに揃えます。ソフトウェアを使用して、異なるセルからのスパイクを検出します。
- 2 つのカーソルを設定します: 1 つは正向きで、もう 1 つは負のたわみ用です。スパイクテンプレートを設定します(図2A)。異なるクラスのスパイク間で最も大きな変化を伴うテンプレート領域を設定します。
- 主成分分析を使用して、それらをクラスターに分割します。クラスタリング方法は、研究室によって異なる場合があります。
- K-means アルゴリズムを使用して境界のスパイクを分類します。
- 向きをスパイク発射速度と相関させ、ipsilater および反側眼の向きの調整曲線をプロットします。
- 単一ユニットの OD インデックスを計算します。
ここでRcontraとRipsiは、それぞれ、対側眼とイプシレーター眼に対する細胞の最適応答であり、Rスポンは細胞の自発的な活性である。 - OD スコアを次のように 1 ~ 7 に割り当てます: -1 ~ -0.75 = 1。−0.75 から−0.45 = 2;−0.45 から−0.15 = 3;−0.15~ 0.15 = 4;0.15 から 0.45 = 5;0.45 から 0.75 = 6;0.75 から 1 = 7 にします。
- 反側バイアス指数(CBI)を計算します。
ここで、Nはセル番号、nxは OD スコアが x に等しいセル番号と等しくなります。
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Representative Results
ここで説明する実験結果は、重要な期間(P19-P32)の間に奪われたマウスと奪われたマウスからのMDおよびOD可塑性の測定を成功させる。図1は、MDの4日後にイプシラナル眼と反眼の応答を比較するための双眼ゾーンをV1から層4で単一ユニット記録を行う方法を示す。図 2は、ipsilater および contralateral 目を刺激するためのスパイクの並べ替えと方位調整の測定を示しています。スパイクの並べ替えでは、スパイク テンプレートは、スパイクの主成分の重みをクラスタリングすることによって確立されました。(図2A、B)に例として、セル01およびセル02はスパイクソーティングによって分類された。単一ユニットの方位調曲線は、眼の眼と眼の側方の刺激によって測定した。図 2C,Dは、MD を受けたマウスと受け取らなかったマウスの 2 つのサンプル セルの向き調整曲線を示しています。我々の結果は、MDが行われた4日後にマウス内の対側眼および眼の眼を刺激することによって、焼成速度が比較的近いことを示した(図2C)。しかし、対眼を刺激した発火速度は、無奪マウスでの眼のイプシラジカルを刺激した場合よりもはるかに強かった(図2D)。図3Aは、MDを受けたマウス(MDの4日後のP28)のすべてのユニットのODスコアとCBIインデックスの分布を示しています。図 3B は、すべてのユニットの OD スコアと、非奪い C57/BL6 マウス (P26、MD なし) からの CBI インデックスを示しています。CBI インデックスは、MD マウスの場合は 0.38、MD を使用しない別のマウスの場合は 0.67 です。
この結果は、刺激に対する対側眼に対するV1ニューロンの応答が、非奪われたマウスの双眼セグメントにおける眼の応答よりもはるかに強いことを示している。しかし、臨界期のMDの4日後、大部分のニューロンの対眼への刺激に対する応答は、眼の眼の眼に対する応答よりも比較的近かったか弱かった。したがって、臨界期のV1ニューロンは有意なOD可塑性を有する。MDは、反側眼と眼球を刺激することによって細胞の応答の相対的な強さを変化させる。
図1:視覚剥奪実験の概略図(A)まぶたを縫合するための模式図。針はまぶた2xを通過し、次に2-3ノットが作られる。図 1 ~ 4 は、針が瞼を通過する位置を示します。(B) 麻酔されたヘッド固定マウスでの記録回路図。V1 の拡大表示は灰色の円で表示され、双眼鏡ゾーンは濃い灰色で示されます。双眼鏡ゾーン内の記録サイトは小さな円で表示されます。(C) マウス脳のコロナ平面と記録部位がV1の層4に示されている。(D) 異なる向きの視覚刺激のイラスト。各測定では12の異なるオリエンテーションが完全に使用されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:データ分析手順の図(A) スパイクは商用ソフトウェアを使用してソートされました (資料の一覧を参照)。緑色の波形は、フィルタされた信号(0.3~10 kHz)を示しています。2 つのセルを、フィルター処理されたデータから並べ替えました。(B)スパイク選別による単一の微小電極上でのスパイク活性の分離の例。スパイクの並べ替え方法は、分析の主要な構成要素です。(C)単眼を奪われたマウス(セル01およびセル02)における対側(赤い実線)およびイプシカル(赤い点線)刺激に応答するために、2つの細胞からの向きの調整。(D) 非奪いマウス(セル03およびセル04)における対側(青い実線)および眼刺激に応答する2つの細胞からの向き調整。誤差範囲は、各測定値の平均値(SEM)の標準誤差を示します。黒い線は自発的な活動を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:MDによるODインデックスのシフト我々は、眼と眼の眼を個別に刺激することによって、対側脳の双眼帯からの細胞の応答を記録した。計算し、単一ユニットの OD インデックスを追加しました。(A) P28-P32からMDを受けたC57/BL6マウスから記録された38個のニューロンのODスコアの分布。(B) 非奪われたC57/BL6マウスからの38個のニューロンのODスコアの分布。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
MDと測定の可塑性を単一ユニット記録で詳細に説明します。このプロトコルは視覚神経科学で広く使用されています。MDプロトコルは複雑ではありませんが、慎重に従わなければならないいくつかの重要な外科的処置があります。まず、ステッチの品質を確保する2つの重要な詳細があります。縫合は、縫合がまぶたの内側部分に集中している場合に十分に安定である。さらに、結び目の頭部に3μLの接着剤を塗布して、目を開け直さないように結び目の安定性を高める。第二に、創傷治癒を改善し、不快感を軽減するためにいくつかの重要なステップを取る必要があります。縫合方法はプロトコルにとって非常に重要です。以前の研究では、単純な連続縫合パターンは、より良い創傷治癒と短い縫合時間19、20の利点を有することが証明されている。大きな傷を引き起こすのを避け、不快感を軽減するために、糸は薄く、安定している必要があります。直径約0.25mmの縫合針は縫合に適しており、2~3ノットが必要です。
録音に注意を払う必要があるいくつかの重要なポイントもあります。麻酔濃度の制御は、電気生理学的記録において重要な要素である。麻酔動物では、実験は非常に制御が容易であり、結果は非常に安定しており、信頼性が高いです。多くの以前の研究は、麻酔薬としてウレタンを使用しました.しかし、マウスの麻酔の深さを制御するためにウレタンを使用することは困難です。低いレベルでは、マウスは完全に麻酔されておらず、より高いレベルではマウスは死に起こりやすい。イソファフルランは、マウス研究における麻酔薬としてより適切である。1%以上のイソファラン21を受けているマウスの新皮質で良好な神経活動を得ることはほとんど不可能であるが、ほとんどのV1ニューロンはイソファランの低レベルで良好な視覚誘発活性を有する。したがって、イソファフルランのより高い濃度から始める(1%)マウスを麻酔し、イソファフルラン(0.5~0.8%)を減らすマウスが完全に麻酔されたとき。また、奪われた目と奪われた目からの交互の測定は、実験結果の正確さを保証することができます。電極が動く可能性があり、長期間の記録中に細胞の応答の強度が変化する可能性があるため、一方の目の応答を何度も測定してからもう一方の目を測定することは適切ではありません。さらに、このプロトコルは、V1の主要な視床受側層である層4のニューロンを標的とする。しかし、主に開眼増強によって媒介されるOD可塑性を示す古いマウスでは、臨界期間を超えて可塑性を保持する層2または3に記録する方が良い。したがって、記録中の皮層層を決定することが重要である。
この方法にはまだいくつかの制限があります。比較的正確なCBIインデックスを計算するには、記録するサンプルが少なすぎるため、4~6個以上のユニットが必要です。しかし、1つのマウスから30以上の高品質のユニットを得ることは容易ではありません。より良い方法は、単一の測定で十分な単位を提供できるマルチユニット記録を使用することです。また、VEP記録やIOIも、OD可塑性17、18を測定するために使用することができます。単一ユニット記録は個々のニューロンの活動を伴い、VEPは電極近くのニューロンの和の活動を記録することを含む。しかし、データを記録する単一ユニットはニューロン間の同期に関する情報を生み出さないが、VEP振幅はニューロン22間の時間的同期に依存する。逆転格子はVEP測定によく使用されます。最も一般的に使用される反転周波数は 3 ~ 4 Hz です。ただし、正確な値は、グレーティングを提示するときのコンピュータのリフレッシュ レートによって決定されます。OD可塑性は、奪われた眼と奪われた眼によって誘発されるVEP振幅の平均を比較することによって測定される。IOI技術は、反面刺激およびipsi膜刺激によって誘発される血中酸素濃度依存性シグナルを効果的に検出することができる。これは、V1の広い領域のOD可塑性を示す可能性があります。
要約すると、単一ユニット記録およびIOIは急性麻酔実験に適している。今後は、MDおよびODの可塑性測定が実験手法として神経可塑性の研究に広く用いられます。
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Disclosures
著者らは、彼らが競合する財政的利益を持っていないと宣言する。
Acknowledgments
この研究は、中国国立自然科学財団(81571770、81771925、81861128001)によって支持されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 502 glue | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | AWG97028 | |
| Acquizition card | National Instument | PCI-6250 | |
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Amplifier | A-M system | Model 1800 | |
| Atropine | Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd | A135946-5 | |
| Brain Stereotaxic Apparatus | RWD Life Science Co.,Ltd | 68001 | |
| Cohan-Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Contact Lenses Solutions | Beijing Dr. Lun Eye Care Products Co., Ltd. | GM17064 | |
| Cotton swabs | Henan Guangderun Medical Instruments Co.,Ltd | ||
| Fine needle holder | SuZhou Stronger Medical Instruments Co.,Ltd | CZQ1370 | |
| Forcep | 66 Vision Tech Co., Ltd. | 53320A | |
| Forcep | 66 Vision Tech Co., Ltd. | 53072 | |
| Forcep | 66 Vision Tech Co., Ltd. | #5 | |
| Heating pad | Stryker | TP 700 T | |
| Illuminator | Motic China Group Co., Ltd. | MLC-150C | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-22 | |
| LCD monitor | Philips (China) Investment Co., Ltd. | 39PHF3251/T3 | |
| Microscope | SOPTOP | SZMT1 | |
| Noninvasive Vital Signs Monitor | Mouseox | ||
| Oil hydraulic micromanipulator | NARISHIGE International Ltd. | PC-5N06022 | |
| Petrolatum Eye Gel | Dezhou Yile Disinfection Technology Co., Ltd. | 17C801 | |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK | Spike2 Version 9 | |
| Surgical scissors | 66 Vision Tech Co., Ltd. | 54010 | |
| Surgical scissors | 66 Vision Tech Co., Ltd. | 54002 | |
| Suture Needle | Ningbo Medical Co.,Ltd | 3/8 arc 2.5*8 | |
| Tungsten Electrode | FHC, Inc | L504-01B | |
| Xylocaine | Huaqing |
References
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