Summary
Aqui, apresentamos protocolos detalhados para privação visual monocular e análise de plasticidade de dominação ocular, que são métodos importantes para estudar os mecanismos neurais da plasticidade visual durante o período crítico e os efeitos de genes específicos em desenvolvimento visual.
Abstract
A privação visual monocular é um excelente paradigma experimental para induzir a plasticidade de resposta cortical visual primária. Em geral, a resposta do córtex ao olho contralateral a um estímulo é muito mais forte do que a resposta do olho ipsilateral no segmento binóculo do córtex visual primário do camundongo (V1). Durante o período crítico dos mamíferos, suturar o olho contralateral resultará em uma rápida perda de capacidade de resposta das células V1 para estimulação ocular contralateral. Com o desenvolvimento contínuo de tecnologias transgênicas, cada vez mais estudos estão usando camundongos transgênicos como modelos experimentais para examinar os efeitos de genes específicos na plasticidade de dominação ocular (OD). Neste estudo, introduzimos protocolos detalhados para privação visual monocular e calculamos a mudança na plasticidade od no mouse V1. Após a privação monocular (MD) por 4 dias durante o período crítico, as curvas de ajuste de orientação de cada neurônio são medidas, e as curvas de ajuste da camada quatro neurônios em V1 são comparadas entre a estimulação dos olhos ipsilaterais e contralaterais. O índice de viés contralateral (ICB) pode ser calculado usando o escore ocular de OD de cada célula para indicar o grau de plasticidade od. Esta técnica experimental é importante para estudar os mecanismos neurais da plasticidade da OD durante o período crítico e para o levantamento dos papéis de genes específicos no desenvolvimento neural. A maior limitação é que o estudo agudo não pode investigar a mudança na plasticidade neural do mesmo camundongo em um momento diferente.
Introduction
A privação visual monocular é um excelente paradigma experimental para examinar a plasticidade V1. Para estudar a importância da experiência visual no desenvolvimento neural, David Hubel e Torsten Wiesel1,2 gatinhos privados de visão normal em um olho em vários pontos de tempo e por períodos variados de tempo. Eles então observaram as mudanças na intensidade de resposta em V1 para os olhos privados e não privados. Seus resultados mostraram um número anormalmente baixo de neurônios reagindo ao olho que havia sido suturado fechado nos primeiros três meses. No entanto, as respostas dos neurônios nos gatinhos permaneceram idênticas em todos os aspectos aos olhos de um gato adulto normal que foi suturado fechado por um ano, e os gatinhos não se recuperaram. MD em gatos adultos não pode induzir plasticidade od. Portanto, o impacto da experiência visual na fiação V1 é forte durante uma breve e bem definida fase de desenvolvimento, antes e depois da qual os mesmos estímulos têm menos influência. Tal fase de maior suscetibilidade à entrada visual é conhecida como o período crítico no córtex visual.
Embora o camundongo seja um animal noturno, neurônios individuais no camundongo V1 têm propriedades semelhantes aos neurônios encontrados em gatos3,4,5. Nos últimos anos, com o rápido desenvolvimento da tecnologia transgênica, um número crescente de estudos em neurociência visual tem usado camundongos como modelo experimental6,7,8. Em estudos visuais de camundongos, neurocientistas usam mutantes e linhas de ratos de nocaute, que permitem o controle sobre a composição genética dos camundongos. Embora os camundongos V1 não tenham colunas od, neurônios únicos na zona binocular V1 mostram propriedades significativas de OD. Por exemplo, a maioria das células responde mais fortemente à estimulação contralateral do que à estimulação ipsilateral. O fechamento temporário de um olho durante o período crítico induz uma mudança significativa na distribuição do índice OD9,10,11. Portanto, o MD pode ser usado para estabelecer um modelo de plasticidade de OD para investigar como genes envolvidos em distúrbios do desenvolvimento neural influenciam a plasticidade cortical in vivo.
Aqui, introduzimos um método experimental para MD e sugerimos um método comumente usado (gravação eletrofisiológica) para analisar a mudança na plasticidade od durante a privação visual monocular. O método tem sido amplamente utilizado em muitos laboratórios por mais de 20 anos12,13,14,15,16. Existem outros métodos utilizados na medição da plasticidade od também, como o potencial visual crônico evocado (VEP) registrando17, e imagen óptica intrínseca (IOI)18. A vantagem significativa deste método agudo é que é fácil de seguir, e os resultados são notavelmente confiáveis.
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Protocol
Neste protocolo, camundongos C57Bl/6 masculinos foram obtidos do Instituto de Animais De Laboratório da Academia de Ciências Médicas de Sichuan e do Hospital Popular Provincial de Sichuan. Todos os cuidados com animais e procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais, Universidade de Ciência Eletrônica e Tecnologia da China.
1. Privação monocular (DM) no dia pós-natal 28 em camundongos
- Coloque as ferramentas cirúrgicas, a agulha de sutura (0,25 mm de diâmetro, diâmetro da corda 0,07 mm) e os cotonetes de algodão em uma caixa de alumínio e autoclave-los a 120 °C por 0,5 h. Estique a capô com 75% de etanol. Seque as ferramentas cirúrgicas em um forno de secagem.
- Prepare uma solução de 2% de agarose, coloque-a em um banho de água a 75 °C para evitar solidificar.
- Use isoflurane misturado com oxigênio para anestesiar o camundongo (2% de indução e manutenção de 1,2-1,5%). Conserte o mouse no aparelho estereotaxic e use um dispositivo regulador de calor para manter a temperatura do corpo do rato em 37 °C e evitar hipotermia.
- Aplique uma fina camada de pomada ocular à base de petróleo em ambos os olhos.
- o microscópio anatômico com iluminação, sutura a pálpebra em um olho. Faça a agulha passar pelos dois lados da pálpebra 2x (Figura 1A) e faça cerca de quatro pontos.
- Aça o rosca 2-3x e depois corte o fio. Aplique 3 μL de cola de secagem instantânea no nó para aumentar sua estabilidade. Em seguida, corte o fio extra de sutura.
- Forneça uma injeção intraperitoneal de buprenorfina (1 mg/kg) ao camundongo.
- Transfira o rato para uma almofada de aquecimento para manter sua temperatura corporal a 37 °C e evitar hipotermia e monitorá-lo até recuperar a consciência.
- Quando o rato estiver totalmente acordado coloque-o em uma gaiola separada.
- Verifique as pálpebras diariamente para garantir que elas permaneçam fechadas e não infectadas. Exclua o mouse se uma abertura de pálpebras for encontrada.
- Antes da gravação eletrofisiológica, use isoflurane misturado com oxigênio para anestesiar o camundongo (2% de indução e manutenção de 1,2-1,5%).
- Remova os pontos com tesoura ocular para expor o globo ocular. Aparar cuidadosamente as pálpebras dos olhos.
- Lave o olho com a solução da lente e verifique o olho um microscópio para obter clareza. Exclua camundongos com opacidades córneas ou sinais de infecção.
2. Craniotomia na região binocular do rato V1 após privação monocular no 4º dia
- Depois de anestesiar o mouse, verifique a profundidade da anestesia pela falta de resposta a uma pitada de dedo do dedo do dedo do dodo do dedo do dodo do dedo.
- Coloque e conserte o mouse no aparelho estereotaxic. Ajuste a altura da barra de ouvido e a haste do dente para manter o cérebro plano e estável.
- Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo.
- Aplique uma pomada ocular à base de petróleo na superfície dos olhos para mantê-los úmidos.
- Remova o cabelo na cabeça do rato para expor sua pele. Esfregue a pele com esfregões alternados de iodo e 70% de etanol 3x.
- Incime uma área de 8 x 8 mm da pele entre as orelhas para expor o crânio e remover o tecido do couro cabeludo. Em seguida, remova o tecido conjuntivo sobreposto com 30% de peróxido de hidrogênio.
- Faça um buraco de 1 x 1 mm no crânio acima do cerebelo. Afixar um pequeno parafuso ósseo no buraco como referência.
- Realizar uma pequena craniotomia de 1 mm de diâmetro na região binocular V1 do hemisfério contralateral até o olho privado (Figura 1B, A-P: lambda -0,51-lambda +1,67 mm; M-L: -2,6- -3,0 mm; D-V: 0-1 mm). Remova cuidadosamente o fragmento do crânio sem machucar o cérebro.
- Cubra a superfície cortical exposta com 75 μL de 2% de agarose a 40 °C para evitar a secagem.
- Conserte um eletrodo de tungstênio na moldura estereotaxica. Coloque o eletrodo de tungstênio verticalmente na superfície do córtex exposto, a região binocular de V1, para garantir que as células que são registradas reajam aos dois olhos.
- Use cotonetes de algodão para remover o gel ocular e aplique óleo de silício no olho a cada 2 h.
3. Estimulação visual e gravação eletrofisiológica
- Mascarar o olho com placa de plástico não transparente. Posicione um monitor LCD a 23 cm do olho do mouse.
- Reduza a anestesia para 0,5-0,8% quando o mouse estiver totalmente anestesiado.
- Avance o eletrodo de microeletrodo lentamente com um micromanipulador hidráulico de óleo. Pare quando uma alta relação sinal-ruído é observada e o eletrodo for avançado para a camada 4 (Figura 1C, aproximadamente 250-450 μm de profundidade). Certifique-se de que o fator amplificador seja fixado em 1.000, o filtro de 300-100 Hz e a taxa de amostra a 40 Hz.
- Apresentar uma grade sinusoidal em campo completo (Figura 1D, 12 direções, 100% contraste, 2 Hz de frequência temporária, 0,04 ciclos por grau de frequência espacial) no monitor LED.
- Meça a resposta da célula estimulando o olho ipsilateral e contralateral separadamente. Presente de 3-5x total.
- Meça as respostas de cinco a oito células em cada penetração. Realize de quatro a seis penetrações em cada mouse.
- Após a gravação, ajuste a vazão de isoflurano para 5% ou mais, continue a exposição ao isoflurano por 1 min e, em seguida, realize a luxação cervical.
NOTA: Penetrações separadas foram espaçadas pelo menos 200 μm de distância na zona binocular V1.
4. Classificação de pico off-line e análise de dados
- Detecte picos quando o sinal bruto cruza um nível de limiar. Alinhar picos capturados no primeiro pico positivo ou negativo. Use software para detectar picos de diferentes células.
- Coloque dois cursores: um positivo e outro para deflexão negativa. Defina o modelo de pico(Figura 2A). Defina a área de modelo para isso com a variação mais significativa entre diferentes classes de picos.
- Use a análise principal do componente para separá-los em clusters. Os métodos de agrupamento podem variar entre diferentes laboratórios.
- Classifique o pico de um limite usando o algoritmo k-means.
- Correlacionar a orientação com a taxa de disparo de pico e traçar as curvas de ajuste de orientação para o olho ipsilateral e contralateral.
- Calcule o índice OD para a unidade única, que representa a relação de força de resposta contralateral/ipsilateral:
onde Rcontra e Ripsi são a resposta ideal da célula para o olho contralateral e ipsilateral, respectivamente, e Rspon é a atividade espontânea da célula. - Atribuir pontuação oD para 1-7 da seguinte forma: − 1 a −0,75 = 1; −0,75 a −0,45 = 2; −0,45 a −0,15 = 3; −0,15 a 0,15 = 4; 0,15 a 0,45 = 5; 0,45 a 0,75 = 6; e 0,75 a 1 = 7.
- Calcular o índice de viés contralateral (ICB):
onde N é o número da célula, e nx iguala o número da célula com pontuações od igual a x.
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Representative Results
Os resultados experimentais aqui descritos permitem medições bem sucedidas de plasticidade de MD e OD de um rato privado e não privado durante o período crítico (P19-P32). A Figura 1 mostra como realizar gravações de unidade única na camada 4 da V1 a zona binocular para comparar respostas no olho ipsilateral e contralateral 4 dias após o MD. A Figura 2 mostra as medidas de classificação e ajuste de orientação para estimular os olhos ipsilaterais e contralaterais. Para classificação de pico, o modelo de pico foi estabelecido agrupando os principais pesos componentes dos picos. Como exemplo na(Figura 2A,B),a célula 01 e a célula 02 foram classificadas por classificação de pico. As curvas de ajuste de orientação de unidades únicas foram medidas pela estimulação dos olhos ipsilaterais e contralaterais. A Figura 2C,D mostra as curvas de ajuste de orientação de quatro células amostrais, nas quais duas são do camundongo que foi submetida a MD e as outras do mouse que não o fizeram. Nossos resultados mostram que a taxa de disparo foi relativamente próxima estimulando o olho contralateral e ipsivo no mouse 4 dias após a realização do MD (Figura 2C). No entanto, a taxa de disparo obtida estimulando o olho contralateral foi muito mais forte do que a obtida estimulando o olho ipsilateral no camundongo não privado (Figura 2D). Figura 3A mostra a distribuição de pontuações de OD para todas as unidades e o índice CBI para um mouse submetido a MD (P28, 4 dias após MD). A Figura 3B mostra as pontuações de OD para todas as unidades e o índice CBI de um mouse C57/BL6 não privado (P26, sem DM). O índice CBI é de 0,38 para um mouse MD e 0,67 para outro sem MD.
Os resultados mostram que a resposta dos neurônios V1 ao olho contralateral a um estímulo foi muito mais forte do que a resposta do olho ipsilateral no segmento binóculo do camundongo não privado. No entanto, 4 dias após o DM no período crítico, a resposta da maioria dos neurônios à estimulação ao olho contralateral foi relativamente próxima ou mais fraca do que a resposta ao olho ipsilateral. Portanto, os neurônios V1 em períodos críticos têm plasticidade significativa de OD. O MD altera a força relativa da resposta da célula estimulando o olho contralateral e ipsilateral.
Figura 1: Esquemática do experimento de privação visual. (A)Um esquema para suturar a pálpebra. A agulha passa pela pálpebra 2x e depois 2-3 nós são feitos. Imagens 1-4 mostram a posição onde a agulha passa pela pálpebra. (B)Gravação esquemática em um mouse anestesiado e fixo na cabeça. Uma visão ampliada de V1 é exibida no círculo cinza, e a zona binocular é indicada com cinza escuro. Os locais de gravação dentro da zona binocular são mostrados com pequenos círculos. (C)O plano coronal do cérebro do rato e os locais de gravação são mostrados na camada 4 de V1. (D) Ilustrações do estímulo visual de diferentes orientações. Doze orientações diferentes foram totalmente utilizadas em cada medição. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Ilustrações do procedimento de análise de dados. (A) Os picos foram classificados usando um software comercial (ver Tabela de Materiais). A forma de onda em verde mostra o sinal filtrado (0,3-10 kHz). Duas células foram classificadas a partir dos dados filtrados. (B)Exemplo da separação da atividade de espetamento em um único microeletrodo por classificação de pico. O método de classificação de pico é um componente principal da análise. (C) Afinações de orientação de duas células para responder aos estímulos contralaterais (linha sólida vermelha) e ipsilateral (linha vermelha pontilhada) em um mouse monocular (célula 01 e célula 02). (D) Ajuste de orientação de duas células para responder aos estímulos oculares contralaterais (linha sólida azul) e ipsilateral (linha pontilhada azul) em um rato não privado (célula 03 e célula 04). A barra de erro indica o erro padrão da média (SEM) em cada medição. A linha preta indica atividade espontânea. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Mudança no índice OD por MD. Registramos a resposta da célula da zona binocular no cérebro contralateral, estimulando os olhos ipsilaterais e contralaterais individualmente. Calculamos e adicionamos o índice OD para as unidades únicas. (A) Distribuição de escores de OD para 38 neurônios registrados a partir de um mouse C57/BL6 que foi submetido a MD de P28-P32. (B)Distribuição de escores de OD para 38 neurônios de um rato C57/BL6 não privado. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
Apresentamos um protocolo detalhado para MD e medindo plasticidade od por gravação de unidade única. Este protocolo é amplamente utilizado na neurociência visual. Embora o protocolo de DM não seja complicado, existem alguns procedimentos cirúrgicos críticos que devem ser seguidos cuidadosamente. Primeiro, há dois detalhes importantes garantindo a qualidade da costura. A sutura é suficientemente estável se os pontos estiverem concentrados na porção medial da pálpebra. Além disso, 3 μL de cola é aplicado na cabeça do nó para aumentar a estabilidade do nó para evitar a reabertura dos olhos. Em segundo lugar, alguns passos-chave devem ser dados para melhorar a cicatrização da ferida e reduzir o desconforto. O método de sutura é muito importante para o protocolo. Estudos anteriores provaram que um simples padrão contínuo de sutura tem os benefícios de melhor cicatrização de feridas e menor tempo de sutura19,20. O fio deve ser fino e estável para evitar causar uma ferida grande e reduzir o desconforto. Uma agulha de sutura com um diâmetro de aproximadamente 0,25 mm é adequada para sutura e dois a três nós são necessários.
Há também alguns pontos-chave que precisam ser prestados atenção na gravação. O controle da concentração anestéstica é um fator importante nas gravações eletrofisiológicas. Em animais anestesiados, o experimento é muito fácil de controlar, e os resultados são altamente estáveis e confiáveis. Muitos estudos anteriores usavam uretano como anestésico. No entanto, é difícil usar uretano para controlar a profundidade da anestesia em camundongos. Em níveis mais baixos, os camundongos não são totalmente anestesiados, e em níveis mais altos, os camundongos são propensos à morte. Isoflurane é mais apropriado como anestésico em um estudo de camundongos. Embora seja quase impossível obter boa atividade neural no neocórtex de camundongos que estão recebendo mais de 1% de isofurane21, a maioria dos neurônios V1 tem boa atividade visual evocada em níveis mais baixos de isoflurano. Assim, comece com maior concentração de isoflurano (1%) anestesiar o camundongo e, em seguida, reduzir o isoflurano (0,5-0,8%) quando os ratos são completamente anestesiados. Além disso, medidas alternadas do olho carente e do olho não privado podem garantir a precisão dos resultados experimentais. Não é apropriado medir a resposta de um olho muitas vezes e depois medir o outro olho, porque o eletrodo pode se mover, e a intensidade da resposta da célula pode mudar durante gravações de longo prazo. Além disso, este protocolo tem como alvo neurônios na camada 4, que é a camada principal de talamo-receptor em V1. Mas em camundongos mais velhos, que exibem plasticidade od mediada principalmente pela potencialização olho aberto, é melhor registrar nas camadas 2 ou 3, que retêm a plasticidade além do período crítico. Por isso, é importante determinar o laminar cortical na gravação.
Ainda há algumas limitações nos métodos. Calcular um índice de ICB relativamente preciso requer penetrações de 4 a 6 e mais de 30 unidades porque o registro de poucas amostras levará a resultados imprecisos. Mas não é fácil obter mais de 30 unidades de alta qualidade de um único mouse. Um método melhor é usar o registro multiunitário, que pode fornecer unidades suficientes em uma única medição. Além disso, a gravação VEP e ioi também podem ser usadas para medir a plasticidadeod 17,18. O registro de uma única unidade envolve a atividade de neurônios individuais, enquanto o VEP envolve registrar a atividade da soma dos neurônios perto do eletrodo. Mas os dados de gravação de uma única unidade não produzem informações sobre sincronização entre os neurônios, enquanto as amplitudes vep dependem da sincronização temporal entre os neurônios22. Uma grade de reversão é frequentemente usada para medição VEP. A frequência de reversão mais utilizada é de 3 a 4 Hz. No entanto, o valor exato é determinado pela taxa de atualização do computador ao apresentar a grade. A plasticidade oD é medida comparando a média das amplitudes vep evocadas pelo olho privado e não privado. A técnica iOI pode detectar efetivamente o sinal dependente do nível de oxigênio sanguíneo evocado pela estimulação contralateral e ipsiva. Poderia mostrar a plasticidade od de uma grande área em V1.
Em resumo, a gravação de unidade única e ioi são adequadas para experimentos agudos de anestesia. No futuro, as medições de plasticidade de MD e OD em conjunto serão amplamente utilizadas no estudo da plasticidade neural como método experimental.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de CiênciaNatural da China (81571770, 81771925, 81861128001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 502 glue | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | AWG97028 | |
| Acquizition card | National Instument | PCI-6250 | |
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Amplifier | A-M system | Model 1800 | |
| Atropine | Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd | A135946-5 | |
| Brain Stereotaxic Apparatus | RWD Life Science Co.,Ltd | 68001 | |
| Cohan-Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Contact Lenses Solutions | Beijing Dr. Lun Eye Care Products Co., Ltd. | GM17064 | |
| Cotton swabs | Henan Guangderun Medical Instruments Co.,Ltd | ||
| Fine needle holder | SuZhou Stronger Medical Instruments Co.,Ltd | CZQ1370 | |
| Forcep | 66 Vision Tech Co., Ltd. | 53320A | |
| Forcep | 66 Vision Tech Co., Ltd. | 53072 | |
| Forcep | 66 Vision Tech Co., Ltd. | #5 | |
| Heating pad | Stryker | TP 700 T | |
| Illuminator | Motic China Group Co., Ltd. | MLC-150C | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-22 | |
| LCD monitor | Philips (China) Investment Co., Ltd. | 39PHF3251/T3 | |
| Microscope | SOPTOP | SZMT1 | |
| Noninvasive Vital Signs Monitor | Mouseox | ||
| Oil hydraulic micromanipulator | NARISHIGE International Ltd. | PC-5N06022 | |
| Petrolatum Eye Gel | Dezhou Yile Disinfection Technology Co., Ltd. | 17C801 | |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK | Spike2 Version 9 | |
| Surgical scissors | 66 Vision Tech Co., Ltd. | 54010 | |
| Surgical scissors | 66 Vision Tech Co., Ltd. | 54002 | |
| Suture Needle | Ningbo Medical Co.,Ltd | 3/8 arc 2.5*8 | |
| Tungsten Electrode | FHC, Inc | L504-01B | |
| Xylocaine | Huaqing |
References
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