Summary
Vi præsenterer en protokol ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri at identificere og kvantificere større cellulære lipider i Saccharomyces cerevisiae. Den beskrevne metode til en kvantitativ vurdering af større lipidklasser i en gærcelle er alsidig, robust og følsom.
Abstract
Lipider er strukturelt forskellige ampelagiske molekyler, der er uopløselige i vand. Lipider er væsentlige bidragydere til organiseringen og funktionen af biologiske membraner, energilagring og produktion, cellulære signalering, vesikulær transport af proteiner, organelle biogenese, og reguleret celledød. Fordi den spirende gær Saccharomyces cerevisiae er en encellet eukaryote modtagelig for grundige molekylære analyser, dens anvendelse som en model organisme hjalp afdække mekanismer, der forbinder lipid metabolisme og intracellulær transport til komplekse biologiske processer i eukaryote celler. Tilgængeligheden af en alsidig analysemetode til den robuste, følsomme og præcise kvantitative vurdering af større klasser af lipider i en gærcelle er afgørende for at få dyb indsigt i disse mekanismer. Her præsenterer vi en protokol til at bruge flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri (LC-MS/MS) til kvantitativ analyse af større cellulære lipider af S. cerevisiae. Den beskrevne LC-MS/MS-metode er alsidig og robust. Det gør det muligt at identificere og kvantificere mange arter (herunder forskellige isobariske eller isomeriske former) inden for hver af de 10 lipidklasser. Denne metode er følsom og gør det muligt at identificere og kvantificere visse lipidarter ved koncentrationer helt ned til 0,2 pmol/μL. Metoden er med succes blevet anvendt til vurdering af lipidomer af hele gærceller og deres rensede organeller. Brugen af alternative mobile fase tilsætningsstoffer til elektrospray ionisering massespektrometri i denne metode kan øge effektiviteten af ionisering for nogle lipid arter og kan derfor bruges til at forbedre deres identifikation og kvantificering.
Introduction
En mængde beviser tyder på, at lipider, en af de store klasser af biomolekyler, spiller væsentlige roller i mange vitale processer inden for en eukaryote celle. Disse processer omfatter samling af lipid bilag, der udgør plasmamembranen og membraner omkring cellulære organeller, transport af små molekyler på tværs af cellemembraner, reaktion på ændringer i det ekstracellulære miljø og intracellulære signal transduktion, produktion og lagring af energi, import og eksport af proteiner begrænset til forskellige organeller, vesikulær handel med proteiner i endomembranen system og protein sekretion, og flere former for reguleret celledød1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Den spirende gær S. cerevisiae, en encellulær eukaryote organisme, er med succes blevet brugt til at afdække nogle af demekanismer,der ligger til grund for de væsentlige roller lipider i disse vitale cellulære processer4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae er en værdifuld model organisme til afdækning af disse mekanismer, fordi det er modtagelige for omfattende biokemiske, genetiske, cellebiologiske, kemiske biologiske, system biologiske, og mikrofluidisk dissektion analyser21,22,23,24,25. Yderligere fremskridt i forståelsen mekanismer, hvorigennem lipid metabolisme og intracellulære transport bidrager til disse vitale cellulære processer kræver følsomme masse spektrometri teknologier til kvantitativ karakterisering af cellulære lipidome, forståelse af lipidom molekylære kompleksitet, og integrere kvantitative lipidomics i en tværfaglig platform af systemer biologi1,2,3,26, 27,28,29,30.
De nuværende metoder for massespektrometriassisterede kvantitative lipidomik i gærceller og celler fra andre eukaryote organismer er ikke tilstrækkeligt alsidige, robuste eller følsomme. Desuden er disse metoder, der anvendes i øjeblikket, ikke i stand til at skelne mellem forskellige isobariske eller isomeriske lipidarter fra hinanden. Her beskriver vi en alsidig, robust og følsom metode, der tillader brug af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri (LC-MS/MS) til kvantitativ analyse af større cellulære lipider af S. cerevisiae.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af sterile medier til dyrkning gær
- Der fremstilles 90 ml af et komplet YP-medie, der indeholder 1% (w/v) gærekstrakt og 2% (w/v) bactopeptone.
- Der fremstilles 90 ml af et syntetisk minimalt YNB-medium, der indeholder 0,67% (w/v) nitrogenbase uden aminosyrer, 20 mg/l L-histidin, 30 mg/l L-leucin, 30 mg/l L-lysin og 20 mg/l uracil.
- Opdel 90 ml af det komplette YP-medium ligeligt i to 250 ml Erlenmeyerkolber (dvs. 45 ml hver).
- Opdel 90 ml af det syntetiske minimale YNB-medium i to 250 ml Erlenmeyerkolber (dvs. 45 ml hver).
- Kolber med YP- og YNB-mediet autoklave ved 15 psi/121 °C i 45 minutter før brug.
2. Gær stamme
- Brug den vilde type STAMME BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).
3. Culturing gær i den komplette YP medium med glukose
- Autoklave en 20% (w/v) stamopløsning af glukose ved 15 psi/121 °C i 45 minutter før brug.
- Der tilsættes 5 ml steril 20% (w/v) stamopløsning til hver af de to Erlenmeyerkolber, der indeholder det sterile YP-medium, til en endelig koncentration på 2% glukose (w/v).
- Brug en mikrobiologisk løkke til at vaccinere celler af vildtypestammen BY4742 i hver af de to Erlenmeyerkolber, der indeholder YP-mediet med glukose.
- Cellerne dyrkes natten over ved 30 °C ved omdrejningved 200 omdrejninger i minuttet.
- Tag en aliquot af gær kultur. Brug et hæmocytometer til at bestemme det samlede antal gærceller pr. ml kultur.
4. Overførsel af gær til og dyrkning af dem i det syntetiske minimale YNB-medium med glukose
- Der tilsættes 5 ml steril 20% (w/v) stamopløsning til hver af de to Erlenmeyerkolber, der indeholder det sterile YNB-medium, til en endelig koncentration på 2% glukose (w/v).
- Brug en steril pipette til at overføre et volumen af natten gær kultur, der indeholder det samlede antal 5,0 x 107 celler i hver af de to Erlenmeyer kolber indeholder YNB medium med glukose.
- Cellerne indkulturer i mindst 24 timer (eller mere, hvis forsøget kræver det) ved 30 °C ved rotationsrystelser ved 200 omdrejninger i minuttet.
5. Fremstilling af reagenser, labware og udstyr til lipidekstraktion
- Forbered følgende: 1) høj kvalitet (> 99.9%) chloroform 2) høj kvalitet (> 99.9%) methanol 3) 28% (v/v) ammoniumhydroxidopløsning i nanorent vand; 4) glasperler (syrevasket, 425-600 μM); 5) en vortex med passende adapter; 6) 15 ml højhastighedsglascentrifugerør med polytetrafluorethylenforet hætteglas; 7) 17:1 og 2:1 blandinger af chloroform og methanol; 8) en chloroform/methanol (2:1) blanding med 0,1% ammoniumhydroxid (v/v) 9) ABC-opløsning (155 mM ammoniumbikarbonat, pH = 8,0) 10) en blanding af interne lipidstandarder fremstillet i en 2:1 blanding af chloroform og methanol som angivet i tabel 1 og 11) 2 ml glasprøvehætteglas med polytetrafluorethylenforet hætteglas til udvinding af cellulære lipider.
6. Fremstilling af reagenser, labware og udstyr til LC
- Forbered følgende: 1) acetonitril/2-propanol/nano-rent vand (65:35:5) blanding; 2) en vortex med passende adapter; 3) en ultralydssonicator; 4) glashætteglas med skær til en brøndplade; 5) et LC-system udstyret med en binær pumpe, degasser, og en autosampler; 6) en C18-bakfasesøjle (2,1 mm; 75 mm; porestørrelse 130 Å; pH-område på 1-11) koblet til et forkolonnesystem 7) blanding A: acetonitril/vand (60:40); og 8) blanding B: isopropanol/acetonitril (90:10).
7. Lipid ekstraktion fra gærceller
- Tag en aliquot af gær kultur. Brug et hæmocytometer, eller mål OD600 til at bestemme det samlede antal gærceller pr. ml kultur.
- Tag et volumen af gær kultur, der indeholder et samlet antal 5,0 x 107 celler (3,3 enheder OD600). Anbring denne kulturmængde i et forkølet 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Cellerne høstes ved centrifugering ved 16.000 x g i 1 min. ved 4 °C. Kassér supernatanten.
- Der tilsættes 1,5 ml iskoldt nanorent vand, og cellerne vaskes ved centrifugering ved 16.000 x g i 1 min. ved 4 °C. Kassér supernatanten.
- Der tilsættes 1,5 ml iskold ABC-opløsning, og cellerne vaskes ved centrifugering ved 16.000 x g i 1 min. ved 4 °C. Kassér supernatanten. Cellepelletkan opbevares ved -80 °C før lipidekstraktion.
- For at begynde lipidekstraktionen skal cellepelleten tø op på is.
- Resuspender cellepelletsen i 200 μL iskoldt nanorent vand. Cellen affjedre til en 15 ml højstyrke glas skrue top centrifuge rør med en polytetrafluorethylen foret hætte. Der tilsættes følgende til dette rør: 1) 25 μL af blandingen af interne lipidstandarder fremstillet i chloroform/methanol (2:1) blanding; 2) 100 μL af 425-600 μM syrevaskede glasperler; og 3) 600 μL chloroform/methanol (17:1) blanding.
- Vortex røret ved høj hastighed i 5 min ved stuetemperatur (RT) for at forstyrre cellerne.
- Vortex røret ved lav hastighed i 1 time på RT for at lette udvindingen af lipider.
- Prøven inkuberes i 15 minutter på is for at fremme proteinudfældning og adskillelsen af de vandige og organiske faser fra hinanden.
- Røret centrifugeres i en klinisk centrifuge ved 3.000 x g i 5 min. ved RT. Dette centrifugeringstrin gør det muligt at adskille den øvre vandige fase fra den nedre organiske fase, som indeholder alle lipidklasser.
- Brug en borosilikatglaspipette til at overføre den lavere organiske fase (~400 μL) til et andet 15 ml højstyrkeglasskruerør med en polytetrafluorethylenforet hætte. Glasperlerne må ikke forstyrres eller overgå den vandige fase under en sådan overførsel. Hold den lavere organiske fase under strømmen af nitrogengas.
- Der tilsættes 300 μL chloroform-methanol (2:1) til den resterende øvre vandige fase for at muliggøre ekstraktion af sphingolipider og PA, PS, PI og CL. Vortex røret kraftigt i 5 min ved RT.
- Røret centrifugeres i en klinisk centrifuge ved 3.000 x g i 5 min. ved RT.
- Der anvendes en borosilikatglaspipettertil at overføre den lavere organiske fase (~ 200 μL), der dannes efter centrifugering, til den organiske fase, der er opsamlet ved trin 7.13.
- Brug strømmen af nitrogengas til at fordampe opløsningsmidlet i de kombinerede organiske faser. Luk rørene, der indeholder lipidfilmen under strømmen af nitrogengas. Disse rør opbevares ved -80 °C.
8. Adskillelse af ekstraherede lipider ved LC
- 500 μL acetonitril/2-propanol/nanorent vand (65:35:5) til et rør, der indeholder lipidfilmen opnået ved trin 7.16. Vortex røret 3x for 10 s på RT.
- Emne indholdet af røret til ultralydsonikering i 15 min. Vortex røret 3x for 10 s på RT.
- Der udtages 100 μL af en prøve fra glasset, og den tilsættes til et glasglas med en indsats, der anvendes til en brøndplade. Undgå luftbobler i indsatsen, før du pacing det ind i brøndpladen.
- Brug et LC-system til at adskille forskellige lipidarter på en C18-kolonne CSH i omvendt fase, der er koblet til et førkolonnesystem (se Materialetabel). Under adskillelsen holdes kolonnen ved 55 °C og med en strømningshastighed på 0,3 ml/min. Prøven opbevares i brøndpladen ved RT.
- Brug de mobile faser, der består af blanding A (acetonitrile/vand [60:40 (v/v)]) og blanding B (isopropanol/acetonitrile [90:10 (v/v)]). For en positiv form for påvisning af moderioner, der er oprettet ved hjælp af elektrosprayionskilden (ESI) ioningskilden, ESI-tilstanden (+), indeholder den mobile fase A og B ammoniumformat ved den endelige koncentration på 10 mM. Ved negativ detektion af moderioner, ESI-tilstanden (-), indeholder den mobile fase A og B ammoniumacetat ved den endelige koncentration på 10 mM.
- Brug et prøvevolumen på 10 μL til injektionen i både ESI-tilstanden (+) og ESI (-).
- Adskil forskellige lipidarter efter LC ved hjælp af følgende LC-gradient: 0-1 min 10% (fase B); 1-4 min 60% (fase B); 4-10 min 68% (fase B); 10-21 97 % (fase B) 21-24 min 97% (fase B); 24-33 min 10% (fase B).
- Ekstraktionsemner ne køres som den første prøve mellem hver fjerde prøve og som den sidste prøve. Træk baggrunden fra for at normalisere data.
- Figur 1viser et repræsentativt totalt ionkromatogram fra LC/MS-data fra lipider udvundet af celler af vildtypestammen BY4742 .
9. Massespektrometrisk analyse af lipider adskilt af LC
- Brug et massespektrometer udstyret med en HESI (opvarmet elektrosprayionisering) ioniseringskilde til at analysere lipider, der blev adskilt af LC. Brug indstillingerne i tabel 2.
- Brug Fourier-transformanalysatoren til at registrere moderioner (MS1) med en opløsning på 60.000 og inden for masseområdet på 150-2.000 Da.
- Brug indstillingerne i tabel 3 til at registrere sekundære ioner (MS2).
10. Identifikation og kvantificering af forskellige lipidklasser og -arter ved behandling af rådata fra LC-MS/MS
- Se materialetabellen for software til at udføre identifikation og kvantificering af forskellige lipider fra rå LC-MS/MS filer. Denne software bruger den største lipid database, der indeholder mere end 1,5 millioner lipid ion prækursorer (MS1) og deres forudsagtfragment ioner (MS2). Softwaren bruger også MS1 toppe til lipid kvantificering og MS2 til lipid identifikation. Et repræsentativt kromatogram af to isomeriske fosfatynyyserinformer (34:0), der har samme m/z-værdi, men forskellige retentionstider samt deres MS1- og MS2-spektre, er vist i henholdsvis figur 2, figur 3og figur 4.
- Søg i LC-MS-rå filer, der indeholder MS1-data med fuld scanning og dataafhængige MS2-data for gratis (unesterified) fedtsyrer (FFA), kardiolipin (CL), phytoceramid (PHC), phytosphingosine (PHS), phosphatidylcholin (PC), phosphtidaylethanolamin (PE), phosphatidylglycerol (PG), phosphatidylinositol (PI), phosphatidylserin (PS) og triacylglycerol (TAG) lipidklasser med en m/z-tolerance på 5 ppm for prækursorier og 10 ppm for produktioner. Andre søgeparametre vises i tabel 4. Følg vejledningen i softwarebrugervejledningen. Identiteten af interne lipidstandarder og lipidarter med usædvanlig fedtsyresammensætning skal verificeres manuelt.
- Brug lipiddataanalyse (http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml), MZmine 2 (http://mzmine.github.io/) eller XCMS-software(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html)til at behandle rådata fra LC-MS/MS for at identificere og quantitat forskellige lipidklasser og arter ved hjælp af frit tilgængelige open source-alternativer til Lipid-Søgesoftwaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores metode til en kvantitativ vurdering af større cellulære lipider i en gærcelle ved hjælp af LC-MS/MS var alsidig og robust. Det gav os mulighed for at identificere og kvantificere 10 forskellige lipidklasser i S. cerevisiae celler dyrket i den syntetiske minimal YNB medium oprindeligt indeholder 2% glukose. Disse lipidklasser omfatter frie (unesterified) fedtsyrer (FFA), CL, phytoceramid (PHC), phytosphingosine (PHS), PC, PE, PG, PI, PS og TAG (Supplerende tabel 1). Talrige molekylære arter af hver af disse klasser blev identificeret og kvantificeret ved hjælp af denne LC-MS/MS-metode (supplerende tabel 1).
Vores LC-MS/MS-metode var også følsom. Den gjorde det faktisk muligt at identificere og kvantificere molekylære arter af lipider i koncentrationer helt ned til 0,165 pmol/μL (se data for fytoceramid i tabel 5). Denne kvantitationsgrænse varierer for forskellige lipidklasser inden for en lang række koncentrationer (tabel 5).
Vigtigere er det, vores metode tilladt identifikation og kvantificering af forskellige isobariske eller isomeriske former for lipider. Isobaric former for lipider er lipid arter med samme nominelle masse (dvs. summen af masserne af de mest rigelige isotoper), men forskellige nøjagtige masser31. Isomeriske former for lipider er lipidarter med samme molekylære formel, men med forskellig kemisk struktur31. For eksempel, brugen af vores LC-MS/ MS metode skelnes mellem PHC (16:0_26:0) og den isobariske lipid arter PC (16:0_10:0): selv om de har samme nominelle masseværdi på 650, deres nøjagtige masser er 650.6457 og 650.4755, henholdsvis. Desuden skelnes denne LC-MS/MS-metode mellem to par isomeriske lipidarter med samme molekylære formel, men forskellig kemisk struktur: 1) PC (18:0_18:1) og PC (20:0_16:1), med molekylær formel (C44H87N1O8P1) og nøjagtig masse (788,6163); og 2) PE (16:0_16:0) og PE (14:0_18:0), med den molekylære formel (C37H75N1O8P1) og nøjagtig masse (692,5224).
Vores LC-MS/MS-metode kan bruges til at øge effektiviteten af ionisering for lipider i alle klasser, hvilket forbedrer identifikationen og kvantificeringen af større cellulære lipider. En sådan forbedring kan opnås ved hjælp af alternative mobile fasetilsætningsstoffer til ESI MS (tabel 6). Disse alternative faser omfatter ammoniumformat, ammoniumformat med myresyre, ammoniumacetat, ammoniumacetat med eddikesyre og ammoniumacetat med myresyre. Hvert af disse alternative mobile fase tilsætningsstoffer kan anvendes til både normalfase- og reverse-fase LC-kolonner (tabel 6).
En anden fordel ved vores LC-MS/MS-metode består i evnen til at bruge to forskellige metoder til fragmentering af prækursorer (MS1) af lipider i MS2-produkter. Disse to metoder er højenergi kollisionsdissociation (HCD) og kollisionsinduceret dissociation (CID)32. Vi fandt, at CID-metoden er gavnlig, hvis den anvendes i kombination med ammoniumacetat mobile fase additiv for ESI (-) tilstand af MS, som under disse betingelser det giver mulighed for en stigning i effektiviteten af MS1 lipid ion fragmentering i MS2 produkter til PHC, CL, FFA, PE, PG, PI, og PS (Tabel 7). I modsætning hertil er HCD-metoden gunstig, hvis den anvendes i kombination med ammoniumformatmobilfaseadditivt for MS's ESI-tilstand (+), da den under disse omstændigheder muliggør en forøgelse af effektiviteten af MS1-lipidionfragmentering i MS2-produkter til PC, PHS og TAG (tabel 8).
Figur 1: Det samlede ionkromatogram (TIC) fra væskekromatografi/massespektrometri (LC/MS) af lipider, der blev udvundet fra celler af vildtypestammen BY4742. TIC af lipider adskilt af LC på en omvendt fase kolonne CSH C18 og detekteret af MS af moderioner, der blev oprettet ved hjælp af den negative elektrospray ioniseringtilstand. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Et kromatogram af to isomeriske fosfatynynylser (34:0), der har samme m/z-værdi (M-H) på 762,5294, men forskellige retentionstider på 7,65 min. og 8,49 min. Lipiderne blev udvundet af celler af vildtypestammen BY4742 og adskilt ved flydende kromatografi på en omvendt fase kolonne CSH C18. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: MS1-spektre af to isomeriske fosfatylserinarter (34:0), der har samme m/z-værdi (M-H) på 762,5294, men forskellige retentionstider på 7,65 min. og 8,49 min. Lipiderne blev udvundet af celler af vildtypestammen BY4742, adskilt af flydende kromatografi på en omvendt fase kolonne CSH C18 (som vist i figur 2) og detekteret ved massespektrometri af forældre (MS1) ioner, der blev skabt ved hjælp af den negative elektrospray ioniseringstilstand. (A) MS1-spektret af en phosphatidylserinform (34:0) med m/z-værdien (M-H) på 762,5294 og retentionstiden på 7,65 min.(B) MS1-spektret af en phosphatidylserinform (34:0) med m/z-værdien (M-H) på 762.5294 og retentionstiden på 8,49 min. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: MS2-spektre af to isomeriske fosfatylserinarter (34:0), der har samme m/z-værdi (M-H) på 762,5294, men forskellige retentionstider på 7,65 min. og 8,49 min. Lipiderne blev udvundet af celler af vildtypestammen BY4742, adskilt ved flydende kromatografi på en omvendt fase kolonne CSH C18 (som vist i figur 2) og detekteret ved massespektrometri af MS1-ioner (som vist i figur 3). Sekundære ioner (MS2) blev derefter opdaget ved massespektrometri. (A) MS2-spektret af en phosphatidylserinform (34:0) med m/z-værdien (M-H) på 762,5294 og retentionstiden på 7,65 min. Tabet af en serinmoiety frembragte en ion med m/z-værdien (M-H) på 675,6149. (B) MS2-spektret af en phosphatidylserinform (34:0) med m/z-værdien (M-H) på 762,5294 og retentionstiden på 8,49 min. Tabet af en serinmoiety frembragte en ion med m/z-værdien (M-H) på 675,8843. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Registreringstilstand | Lipidklasse | Hydrofob halesammensætning | Beregnet m/z-værdi | Koncentration (pmol/μl) |
| Negative | Ceramid | 18:1_17:0 | 550.5204675 | 226 |
| Negative | Cardiolipin (Cardiolipin) | 14:0_14:0_14:0_14:0 | 1239.839755 | 196 |
| Negative | Fri fedtsyre | 19:0 | 297.2799035 | 837 |
| Negative | Phosphatidylethanolamin | 15:0_15:0 | 662.4766305 | 377 |
| Negative | Phosphatidylglycerol | 15:0_15:0 | 693.4712115 | 349 |
| Negative | Phosphatidylinositol | 17:0_20:4 | 871.5342065 | 3 |
| Negative | Phosphatidylserin | 17:0_17:0 | 762.5290605 | 318 |
| Positive | Phosphatidylcholin | 13:0_13:0 | 650.4755335 | 385 |
| Positive | Phytosphingosine | 16:1 | 272.2584055 | 225 |
| Positive | Triacylglycerol | 28:1_10:1_10:1 | 818.7232155 | 367 |
Tabel 1: Sammensætningen af en blanding af interne lipidstandarder. Interne lipidstandarder blev fremstillet i chloroform/methanol (2:1) blanding. Detektionstilstand henviser til en positiv eller negativ tilstand af moderiondetektion ved hjælp af et Orbitrap Velos-massespektrometer, der er udstyret med elektrosprayioniserings (ESI) ioningskilde. De beregnede m/z-værdier er for lipiders adducts.
| FTMS + p-opløsning | 60000 |
| Masseområde (dalton) | 150-2000 |
| Ion-kildetype | HESI (HESI) |
| Kapillær temperatur (°C) | 300 |
| Kildevarmetemperatur (°C) | 300 |
| Kappe gasflow | 10 |
| Aux gasflow | 5 |
| Positiv polaritetspænding (kV) | 3 |
| Negativ polaritetspænding (kV) | 3 |
| Kildestrøm (μA) | 100 |
Tabel 2: Orbitrap Velos Massespektrometerindstillinger, der bruges til at analysere lipider, der blev adskilt af LC. Forkortelser: FTMS + p = Fourier transformeringsbaseret massespektrometri i ESI-tilstand (+) HESI = opvarmet elektrosprayionisering.
| Instrumentpolaritet | Positive | Negative |
| Aktiveringstype | Høj-energi-induceret-kollision-dissociation | Kollision-induceret-dissociation |
| Minimalt signal påkrævet | 5000 | 5000 |
| Isolationsbredde | 2 | 2 |
| Normaliseret kollisionsenergi | 55 | 35 |
| Standardgebyrtilstand | 2 | 2 |
| Aktiveringstid | 0.1 | 10 |
| FTMS + C-opløsning | 7500 | |
| Der blev udvalgt 5 mest intense toppe til ms/ms |
Tabel 3: Orbitrap Velos Massespektrometerets indstillinger, der anvendes til at detektere sekundære ioner (MS2). Forkortelse: FTMS + C = Fourier transformerbaseret massespektrometri i ESI-tilstand (+).
| Identifikation | |
| Database | Orbitrap (Orbitrap) |
| Maksimal registrering | Tilbagekaldelse isotop (TIL) |
| Søgemulighed | Produktsøgning Orbitrap |
| Søgetype | Produkt |
| Eksperimenttype | LC-MS |
| Tolerance over for prækursorer | 10 sider pr. minut |
| Produkttolerance | Højenergi-induceret kollisionsdissociation [ESI (+) tilstand]: 20 ppm |
| Kollisionsbetinget dissociation [ESI (-) tilstand]: 0,5 Daltons | |
| Kvantitering | |
| Udfør kvantificering | På |
| m/z tolerance | -5.0; +5.0 |
| Tolerancetype | Ppm |
| Filter | |
| Filter for topplacering | På |
| Hovednodefilter | Main isomer peak |
| m-score tærskel | 5 |
| c-score tærskel | 2 |
| FFA prioritet | På |
| Filter for id-kvalitet | A: Lipid klasse & alle fedtsyrer er helt identificeret |
| B: Lipid klasse & nogle fedtsyrer er identificeret | |
| C: Lipid klasse eller FA er identificeret | |
| D: Lipid identificeret ved andre fragmentioner (H2O osv.) | |
| Lipid klasse | |
| Højenergi-induceret kollisionsdissociation [ESI (+) tilstand] | PC, TAG |
| Kollisions-induceret-dissociation [ESI (-) mode] | CER, CL, FFA, PE, PG, PI, PS |
| Ioner | |
| Højenergi-induceret kollisionsdissociation [ESI (+) tilstand] | + H; + NH4; + Na |
| Kollisions-induceret-dissociation [ESI (-) mode] | - H. - 2H. - HCOO |
Tabel 4: De søgeparametre, der anvendes til at identificere forskellige lipidklasser og arter ved hjælp af lipididentifikationssoftwaren "Lipid Search" (V 4.1). Forkortelser: CER = ceramid; CL = kardiolipin; FFA = fri (ikke-esterificeret) fedtsyre; PC = phosphatidylcholin; PE = phosphatidylethanolamin; PG = phosphatidylglycerol; PI = phosphatidylinositol; PS = phosphatidylserin; TAG = triacylglycerol.
Tabel 5: De laveste koncentrationer af molekylære arter af forskellige lipidklasser, der kan identificeres og kvantificeres ved hjælp af vores LC-MS/MS-metode. Et skøn over den laveste kvantificerbare koncentration for hver lipidklasse er baseret på MS-topområderne for dens interne standard (disse MS-toparealer og lipidstandardkoncentrationer vises med fed skrift) og denrepræsentative molekylære form, der findes ved den laveste påviselige koncentration. Data præsenteres som gennemsnitsværdier for to uafhængige forsøg, for hvilke der blev udført tre tekniske replikater. Klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).
| Lipidstandard | ESI-tilstand | Amf | AmF/FA | Amac | Amac/AA | AmAc/ANLÆG |
| Phc | - | 74 | 75.2 | 85.8 | 77 | 74.8 |
| Cl | - | 72.9 | 75.1 | 78.3 | 68.4 | 74 |
| Ffa | - | 77.1 | 77.2 | 75.5 | 84 | 72.9 |
| Pe | - | 98 | 96 | 95 | 91.5 | 86 |
| Pg | - | 64 | 45.1 | 75.9 | 60.5 | 55 |
| Pi | - | 79.3 | 76 | 82.5 | 80.3 | 77 |
| Ps | - | 73.7 | 61.6 | 85.8 | 81.4 | 73.7 |
| Pc | + | 93.5 | 86.9 | 69.3 | 60.5 | 62.7 |
| Phs | + | 89.1 | 79.2 | 78.1 | 73.7 | 69.3 |
| TAG (TAG) | + | 92.4 | 88 | 86.9 | 80.3 | 84.7 |
Tabel 6: Virkningerne af alternative mobile fasetilsætningsstoffer for ESI MS på effektiviteten af ionisering for lipider i forskellige klasser. Forskellige lipider blev adskilt fra hinanden ved omvendt fase flydende kromatografi. Kommercielle lipidstandarder, der hører til forskellige klasser af lipider, er nævnt i tabel 1. ESI-ioniseringsmetoden (-) eller ESI (+) blev anvendt til MS i nærværelse af forskellige mobile fasetilsætningsstoffer. Ioniseringsprocenten for hver lipidstandard vises som en middelværdi fra tre tekniske replikater. For hver lipid blev ioniseringsprocenten beregnet på grundlag af MS-topområdet. En værdi af den højeste ioniseringseffektivitet for hvert lipid vises med fed skrift. Forkortelser: AmF = ammoniumformat; AmF/FA = ammoniumformat med myresyre; AmAc = ammoniumacetat; AmAc/AA = ammoniumacetat med eddikesyre; AmAc/FA = ammoniumacetat med myresyre; CL = kardiolipin; FFA = fri (ikke-esterificeret) fedtsyre; PC = phosphatidylcholin; PE = phosphatidylethanolamin; PG = phosphatidylglycerol; PHC = phytoceramid; PHS = phytosphingosine; PI = phosphatidylinositol; PS = phosphatidylserin; TAG = triacylglycerol.
| Lipidstandard | ESI-tilstand | Amf | Amac |
| Phc | - | 75 | 83.8 |
| Cl | - | 70.9 | 79.3 |
| Ffa | - | 76.1 | 74.5 |
| Pe | - | 98 | 95 |
| Pg | - | 64 | 75.9 |
| Pi | - | 79.3 | 82.5 |
| Ps | - | 71.5 | 84.8 |
| Pc | + | 52.3 | 60.5 |
| Phs | + | 78.4 | 75.2 |
| TAG (TAG) | + | 65.7 | 69.7 |
Tabel 7: Virkningen af kollisionsinduceret dissociation (CID) på effektiviteten af forløberioner (MS1) fragmentering. Kommercielle lipidstandarder, der hører til forskellige klasser af lipider, er nævnt i tabel 1. ESI-ioniseringsmetoden (-) eller ESI (+) blev anvendt til MS i nærvær af et ammoniumformat (AmF) eller ammoniumacetat (AmAc) mobilfasetilsætningsstof. Procentdelen af MS1-lipidioner, der var fragmenteret i MS2-produkter, vises som en middelværdi fra tre tekniske replikater. For hver lipid blev ioniseringsprocenten beregnet på grundlag af MS2-topområdet. En værdi af den højeste procentdel af MS1-lipidioner, der var fragmenterede, vises med fed skrift for hvert lipid (sammenlign med dataene i tabel 8). Denne værdi er den højeste, hvis effektiviteten af MS2-produktiondannelse er højest. Forkortelser: CL = kardiolipin; FFA = fri (ikke-esterificeret) fedtsyre; PC = phosphatidylcholin; PE = phosphatidylethanolamin; PG = phosphatidylglycerol; PHC = phytoceramid; PHS = phytosphingosine; PI = phosphatidylinositol; PS = phosphatidylserin; TAG = triacylglycerol.
| Lipidstandard | ESI-tilstand | Amf | Amac |
| Phc | - | 68.4 | 65.4 |
| Cl | - | 74.3 | 75.2 |
| Ffa | - | 84.2 | 81.2 |
| Pe | - | 85.1 | 73.1 |
| Pg | - | 68.4 | 67.1 |
| Pi | - | 58.7 | 55.8 |
| Ps | - | 67.4 | 68.5 |
| Pc | + | 92.5 | 65.3 |
| Phs | + | 87.1 | 75.1 |
| TAG (TAG) | + | 91.4 | 84.9 |
Tabel 8: Virkningen af højenergikollisionsmetoden (HCD) på effektiviteten af forløberioner (MS1) fragmentering. Kommercielle lipidstandarder, der hører til forskellige klasser af lipider, er nævnt i tabel 1. ESI-ioniseringsmetoden (-) eller ESI (+) blev anvendt til MS i nærvær af et ammoniumformat (AmF) eller ammoniumacetat (AmAc) mobilfasetilsætningsstof. Procentdelen af MS1-lipidioner, der var fragmenteret i MS2-produkter, vises som en middelværdi fra tre tekniske replikater. For hver lipid blev ioniseringsprocenten beregnet på grundlag af MS2-topområdet. En værdi af den højeste procentdel af MS1-lipidioner, der var fragmenterede, vises med fed skrift for hvert lipid (sammenlign med dataene i tabel 7). Denne værdi er den højeste, hvis effektiviteten af MS2-produktiondannelse er højest. Andre forkortelser: CL = kardiolipin; FFA = fri (ikke-esterificeret) fedtsyre; PC = phosphatidylcholin; PE = phosphatidylethanolamin; PG = phosphatidylglycerol; PHC = phytoceramid; PHS = phytosphingosine; PI = phosphatidylinositol; PS = phosphatidylserin; TAG = triacylglycerol.
Supplerende tabel 1: En liste over molekylære arter af 10 forskellige lipidklasser, der er identificeret og kvantificeret i S. cerevisiae-celler ved hjælp af vores LC-MS/MS-metode. Disse lipidklasser omfattede frie (unesterified) fedtsyrer (FFA), kardiolipin (CL), phytoceramid (PHC), phytosphingosine (PHS), phosphatidylcholin (PC), fosfor atidylethanolamin (PE), phosphatidylglycerol (PG), phosphatidylinositol (PI), phosphatidylserin (PS) og triacylglycerol (TAG). S. cerevisiae celler blev dyrket i det syntetiske minimale YNB medium oprindeligt indeholdende 2% glukose. Aliquots af gærceller til lipidekstraktion og LC-MS/MS-analyse af ekstraherede lipider blev fundet på dag 1, 2, 3, 4, 6, 8 og 10 af dyrkning. Alle lipidarter af hver lipidklasse, der blev identificeret i gærceller, der blev fundet på forskellige dyrkningsdage, vises. Nogle af disse lipidarter var kun til stede i kronologisk unge gærceller, der blev fundet på dag 1-4 i dyrkning, andre kun i kronologisk gamle gærceller, der blev fundet på dag 6-10 i dyrkning, mens nogle var til stede i både kronologisk unge og gamle gærceller. Det højeste MS-topområde for hver lipidart i hver lipidklasse, der er identificeret på en bestemt dyrkningsdag, vises. Lipid standarder for forskellige lipid klasser, der blev brugt til kvvantitation af andre arter inden for denne lipid klasse vises i rød farve. De beregnede m/z-værdier er for lipiders adducts. Forkortelse: ESI (-) = MS's ESI-tilstand (-) ESI (+) = MS's ESI-tilstand (+) præsenteres som middelværdier for to uafhængige eksperimenter, for hver af hvilke der blev udført tre tekniske replikater. Klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Følgende forholdsregler er vigtige for en vellykket gennemførelse af den protokol, der er beskrevet her:
1. Chloroform og methanol er giftige. De effektivt udtrække forskellige stoffer fra overflader, herunder laboratorium plastudstyr og din hud. Derfor håndteredisse organiske opløsningsmidler med forsigtighed ved at undgå brug af plast i trin, der involverer kontakt med chloroform og / eller methanol, ved hjælp af borosilikat glas pipetter til disse trin, og skylning disse pipetter med chloroform og methanol før brug.
2. Under lipidekstraktion ved blanding af methanol/chloroform (17:1) anvendes en borosilikatglaspipette til at overføre den lavere organiske fase (~400 μL) til et 15 ml højstyrkeglasskruetcentrifugerør med en polytetrafluorethylenforet hætte. Glasperlerne må ikke forstyrres eller overgå den vandige fase under en sådan overførsel. Hold den lavere organiske fase under strømmen af nitrogengas.
3. Under forberedelsen af prøveforberedelsen til LC-MS/MS er det vigtigt at fjerne alle luftbobler i glashætteglasserne, før hætteglasserne sættes i en brøndplade.
4. For at opnå en fuldstændig opløselighed af ammoniumformat og ammoniumacetat i mobile faser A og B før lipidseparation ved LC opløses hvert salt i 500 μL nanorent vand, før opløsningen blandes med den mobile fase og sonikering i 20 min.
5. Opbevar ikke lipidfilmen, der dannes efter opløsningsmiddelfordampning, i længere tid, før den køres. Vi opbevarer denne film på -80 °C i højst en uge, før vi opløser den i acetonitrile/2-propanol/nano-ren vand (65:35:5) blanding og derefter udsætte lipider til LC-MS / MS.
LC-MS/MS-metoden, der er beskrevet her, er en alsidig, robust og følsom teknik til en kvantitativ vurdering af mange lipidarter, der omfatter gærens cellulære lipidom eller en anden eukaryote organisme. Metoden gør det muligt at identificere og kvantificere forskellige isobariske eller isomeriske lipidarter, gør det muligt at anvende alternative mobile fasetilsætningsstoffer til ESI MS til at fremme lipidionisering og gøre lipididentifikation og -kvantificering mere effektiv og kan anvende både HCD- og CID-metoder til fragmentering eller aktivering af MS1-lipidioner.
Vi bruger denne LC-MS/MS metode til at studere aldersrelaterede ændringer i cellulære og organellar lipidomer under kronologisk ældning af den spirende gær S. cerevisiae. Vi anvender også denne metode til at undersøge, hvor mange aldringsforskydnings-forsinkende genetiske, kostmæssige og farmakologiske indgreb påvirker lipidsammensætningen af hele S. cerevisiae-cellen og dens forskellige organeller. På grund af sin alsidighed, robusthed og følsomhed kan denne LC-MS/MS-metode med held anvendes til kvantitativ vurdering af cellulære og organellarlipidomer i eukaryote organismer på tværs af phyla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har modstridende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige over for nuværende og tidligere medlemmer af Titorenko-laboratoriet for drøftelser. Vi anerkender Center for Biologisk Anvendelse af Massespektrometri og Center for Strukturel og Funktionel Genomics (begge på Concordia University) for fremragende ydelser. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) i Canada (RGPIN 2014-04482) og Concordia University Chair Fund (CC0113). K.M. blev støttet af Concordia University Merit Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
References
- Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
- Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
- Brügger, B. Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry. Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).
- Zechner, R., et al. FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).
- Eisenberg, T., Büttner, S. Lipids and cell death in yeast. FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).
- Richard, V. R., et al. Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death. Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).
- Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis. Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).
- Mårtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. Effects of lipids on mitochondrial functions. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).
- Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
- Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).
- Goldberg, A. A., et al. A novel function of lipid droplets in regulating longevity. Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).
- Kohlwein, S. D. Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).
- Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. Peroxisome metabolism and cellular aging. Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).
- Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).
- Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down. Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).
- Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast. Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).
- Dimmer, K. S., Rapaport, D. Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).
- Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions. Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).
- Mitrofanova, D., et al. Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).
- Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. Organelle contact zones as sites for lipid transfer. Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).
- Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
- Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
- Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).
- Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
- Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry. Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).
- Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
- Klose, C., Tarasov, K. Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics. Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
- Sud, M., et al. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).
- Pauling, J. K., et al. Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids. PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).
