Summary
Wir präsentieren ein Protokoll mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie, um wichtige zelluläre Lipide in Saccharomyces cerevisiaezu identifizieren und zu quantifizieren. Die beschriebene Methode zur quantitativen Bewertung wichtiger Lipidklassen innerhalb einer Hefezelle ist vielseitig, robust und empfindlich.
Abstract
Lipide sind strukturell vielfältige amphipathische Moleküle, die in Wasser unlöslich sind. Lipide sind wesentliche Beiträge zur Organisation und Funktion biologischer Membranen, Energiespeicherung und -produktion, zelluläre Signalisierung, vesikulärer Transport von Proteinen, Organellebiogenese und regulierter Zelltod. Da die aufkeimende Hefe Saccharomyces cerevisiae ein einzelliges Eukaryoten ist, das für gründliche molekulare Analysen zugänglich ist, half seine Verwendung als Modellorganismus, Mechanismen aufzudecken, die den Fettstoffwechsel mit dem intrazellulären Transport mit komplexen biologischen Prozessen innerhalb eukaryotischer Zellen verbinden. Die Verfügbarkeit einer vielseitigen Analysemethode für die robuste, empfindliche und genaue quantitative Bewertung wichtiger Lipidklassen innerhalb einer Hefezelle ist entscheidend, um tiefe Einblicke in diese Mechanismen zu erhalten. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verwendung der Flüssigchromatographie in Verbindung mit der Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS) für die quantitative Analyse der wichtigsten zellulären Lipide von S. cerevisiae vor. Die beschriebene LC-MS/MS-Methode ist vielseitig und robust. Es ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung zahlreicher Arten (einschließlich verschiedener isobarer oder isomerischer Formen) innerhalb jeder der 10 Lipidklassen. Diese Methode ist empfindlich und ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung einiger Lipidarten in Konzentrationen von bis zu 0,2 pmol/l. Die Methode wurde erfolgreich angewendet, um Lipidome ganzer Hefezellen und ihrer gereinigten Organellen zu bewerten. Der Einsatz alternativer mobiler Phasenadditive für die Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie bei dieser Methode kann die Ionisationseffizienz bei einigen Lipidarten erhöhen und kann daher zur Verbesserung ihrer Identifizierung und Quantifizierung eingesetzt werden.
Introduction
Eine Reihe von Beweisen zeigt, dass Lipide, eine der wichtigsten Klassen von Biomolekülen, spielen wesentliche Rolle in vielen lebenswichtigen Prozessen innerhalb einer eukaryotischen Zelle. Diese Prozesse umfassen die Montage von Lipid-Doppelschichten, die die Plasmamembran und Membranen umgebenden Zellorganellen bilden, den Transport kleiner Moleküle über Zellmembranen, die Reaktion auf Veränderungen in der extrazellulären Umgebung und intrazelluläre Signaltransduktion, die Erzeugung und Speicherung von Energie, den Import und Export von Proteinen, die auf verschiedene Organellen beschränkt sind, vesikulären Handel mit Proteinen innerhalb des Endomembransystems und der Proteinsekretion sowie verschiedene Arten des regulierten Zelltodes1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Die angehende Hefe S. cerevisiae, ein einzelliger eukaryotischer Organismus, wurde erfolgreich verwendet, um einige der Mechanismen zu entdecken, die den wesentlichen Rollen von Lipiden in diesen lebenswichtigen zellulären Prozessen zugrundeliegen 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae ist ein wertvoller Modellorganismus für die Aufdeckung dieser Mechanismen, weil er für umfassende biochemische, genetische, zellbiologische, chemische, biologische, systembiologische und mikrofluidische Dissektionsanalysen21,22,23,24,25zugänglich ist. Weitere Fortschritte beim Verständnis von Mechanismen, durch die der Fettstoffwechsel und der intrazelluläre Transport zu diesen lebenswichtigen zellulären Prozessen beitragen, erfordern empfindliche Massenspektrometrietechnologien für die quantitative Charakterisierung des zellulären Lipidoms, das Verständnis der molekularen Lipidkomplexität und die Integration der quantitativen Lipidomik in eine multidisziplinäre Plattform der Systembiologie1,2,3,26, 27,28,29,30.
Aktuelle Methoden für die Massenspektrometrie-unterstützte quantitative Lipidomik von Hefezellen und Zellen anderer eukaryotischer Organismen sind nicht ausreichend vielseitig, robust oder empfindlich. Darüber hinaus sind diese derzeit verwendeten Methoden nicht in der Lage, verschiedene isobarische oder isomerische Lipidarten voneinander zu unterscheiden. Hier beschreiben wir eine vielseitige, robuste und empfindliche Methode, die den Einsatz von Flüssigchromatographie in Verbindung mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) für die quantitative Analyse der wichtigsten zellulären Lipide von S. cerevisiaeermöglicht.
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Protocol
1. Herstellung steriler Medien zur Hefekultierung
- Bereiten Sie 90 ml eines vollständigen YP-Mediums vor, das 1% (w/v) Hefeextrakt und 2% (w/v) Bactopepton enthält.
- Bereiten Sie 90 ml eines synthetischen minimalen YNB-Mediums vor, das 0,67 % (w/v) Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren, 20 mg/L L-Histidin, 30 mg/L L-Leucin,30 mg/L L-Lysinund 20 mg/L Uracil enthält.
- 90 ml des gesamten YP-Mediums gleichmäßig in zwei 250 ml Erlenmeyerkolben (d.h. je 45 ml) aufteilen.
- 90 ml des synthetischen Minimal-YNB-Mediums in zwei 250 ml Erlenmeyer-Kolben (d.h. je 45 ml) aufteilen.
- Autoklavieren Sie die Kolben mit YP- und YNB-Medien bei 15 psi/121 °C für 45 min vor Gebrauch.
2. Hefe-Stamm
- Verwenden Sie den Wild-Stamm BY4742 (MAT- his3-1 leu2-0 lys2-0 ura3-0).
3. Kultieasthefe im gesamten YP-Medium mit Glukose
- Autoklaveine 20% (w/v) Vorrat an Glukose bei 15 psi/121 °C für 45 min vor der Anwendung.
- Fügen Sie 5 ml der sterilen 20% (w/v) Glukoselösung in jeden der beiden Erlenmeyerkolben, die das sterile YP-Medium enthalten, für eine Endkonzentration von 2% Glukose (w/v) hinzugeben.
- Verwenden Sie eine mikrobiologische Schleife, um Zellen des Wildstamms BY4742 in jeden der beiden Erlenmeyerkolben, die das YP-Medium enthalten, mit Glukose zu impfen.
- Kultur die Zellen über Nacht bei 30 °C mit Rotationsschütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute.
- Nehmen Sie ein Aliquot der Hefekultur. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Gesamtzahl der Hefezellen pro ml Kultur zu bestimmen.
4. Hefe auf das synthetische Minimal-YNB-Medium mit Glukose übertragen und kultivieren
- Fügen Sie jedem der beiden Erlenmeyerkolben, die das sterile YNB-Medium enthalten, 5 ml der sterilen 20%-Stammlösung (w/v) Glukose zu einer Endkonzentration von 2% Glucose (w/v) hinzu.
- Verwenden Sie eine sterile Pipette, um ein Volumen der Übernachthefekultur, das die Gesamtzahl von 5,0 x 107 Zellen enthält, in jede der beiden Erlenmeyerkolben zu übertragen, die das YNB-Medium mit Glukose enthalten.
- Kultur die Zellen für mindestens 24 h (oder mehr, wenn das Experiment erfordert) bei 30 °C mit Rotationsschütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute.
5. Herstellung von Reagenzien, Laborwaren und Geräten zur Lipidextraktion
- Bereiten Sie Folgendes vor: 1) hohe Qualität (>99,9%) Chloroform; 2) hochgradreich (>99,9%) Methanol; 3) 28% (v/v) Ammoniumhydroxidlösung in nanoreinem Wasser; 4) Glasperlen (säuregewaschen, 425-600 m); 5) ein Wirbel mit entsprechendem Adapter; 6) 15 ml Hochgeschwindigkeitsglaszentrifugenrohre mit polytetrafluorethylen gefütterten Kappen; 7) 17:1 und 2:1 Mischungen von Chloroform und Methanol; 8) ein Chloroform/Methanol (2:1) Mit 0,1% Ammoniumhydroxid (v/v); 9) ABC-Lösung (155 mM Ammoniumbicarbonat, pH = 8,0); 10) eine Mischung interner Lipidnormen, die in einem 2:1-Gemisch aus Chloroform und Methanol gemäß Tabelle 1hergestellt werden; und 11) 2 ml Glasprobenfläschchen mit Polytetrafluorethylen gefütterten Kappen zur Extraktion von zellulären Lipiden.
6. Herstellung von Reagenzien, Laborwaren und Geräten für LC
- Bereiten Sie folgendes vor: 1) Acetonitril/2-Propanol/Nano-reines Wasser (65:35:5) Gemisch; 2) einen Wirbel mit entsprechendem Adapter; 3) ein Ultraschall-Sonicator; 4) Glasfläschchen mit Einsätzen für eine Wellplate; 5) ein LC-System, das mit einer binären Pumpe, einem Entgaser und einem Autosampler ausgestattet ist; 6) eine C18-Rückwärtsphasensäule (2,1 mm; 75 mm; Porengröße 130 ° ; pH-Bereich von 1-11) gekoppelt an ein Vorsäulensystem; 7) Mischung A: Acetonitril/Wasser (60:40); und 8) Mischung B: Isopropanol/Acetonitril (90:10).
7. Lipidextraktion aus Hefezellen
- Nehmen Sie ein Aliquot der Hefekultur. Verwenden Sie ein Hämozytometer oder messen Sie OD600, um die Gesamtzahl der Hefezellen pro ml Kultur zu bestimmen.
- Nehmen Sie ein Volumen der Hefekultur, das eine Gesamtanzahl von 5,0 x 107 Zellen (3,3 Einheiten OD600) enthält. Legen Sie dieses Kulturvolumen in ein vorgechilltes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
- Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 16.000 x g für 1 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.
- 1,5 ml eiskaltes nanoreines Wasser hinzufügen und die Zellen durch Zentrifugieren bei 16.000 x g 1 min bei 4 °C waschen. Entsorgen Sie den Überstand.
- 1,5 ml eiskalte ABC-Lösung hinzufügen und die Zellen durch Zentrifugieren bei 16.000 x g 1 min bei 4 °C waschen. Entsorgen Sie den Überstand. Das Zellpellet kann vor der Lipidextraktion bei -80 °C gelagert werden.
- Um die Lipidextraktion zu beginnen, tauen Sie das Zellpellet auf Eis auf.
- Setzen Sie das Zellpellet in 200 l eiskaltem nanoreinem Wasser wieder auf. Übertragen Sie die Zellsuspension auf ein 15 ml hochfestes Glasschnecken-Spitzenzentrifugenrohr mit einer mit Polytetrafluorethylen gefütterten Kappe. Fügen Sie dieser Tube folgendes hinzu: 1) 25 l des Gemischs der in Chloroform/Methanol (2:1) hergestellten Mischung von internen Lipidnormen; 2) 100 l von 425-600 'M säuregewaschene Glasperlen; und 3) 600 l Chloroform/Methanol (17:1) Gemisch.
- Wirbeln Sie das Rohr mit hoher Geschwindigkeit für 5 min bei Raumtemperatur (RT), um die Zellen zu stören.
- Wirbel n. Chr. bei niedriger Geschwindigkeit für 1 h bei RT, um die Extraktion von Lipiden zu erleichtern.
- Inkubieren Sie die Probe für 15 min auf Eis, um die Proteinfällung und die Trennung der wässrigen und organischen Phasen voneinander zu fördern.
- Zentrifuge das Rohr in einer klinischen Zentrifuge bei 3.000 x g für 5 min bei RT. Dieser Zentrifugationsschritt ermöglicht es, die obere wässrige Phase von der unteren organischen Phase zu trennen, die alle Lipidklassen enthält.
- Verwenden Sie eine Borosilikat-Glaspipette, um die untere organische Phase (ca. 400 l) auf ein weiteres 15 ml hochfestes Glasschnecken-Spitzenzentrifugenrohr mit einer mit Polytetrafluorethylen gefütterten Kappe zu übertragen. Unterbrechen Sie während des Transfers nicht die Glasperlen oder die obere wässrige Phase. Halten Sie die untere organische Phase unter dem Fluss von Stickstoffgas.
- Fügen Sie 300 l Chloroform-Methanol (2:1) In die verbleibende obere wässrige Phase ein, um die Extraktion von Sphingolipiden und PA, PS, PI und CL zu ermöglichen. Wirbel des Rohres kräftig für 5 min bei RT.
- Zentrifuge das Rohr in einer klinischen Zentrifuge bei 3.000 x g für 5 min bei RT.
- Verwenden Sie eine Borosilikat-Glaspipette, um die nach der Zentrifugierung gebildete untere organische Phase (ca. 200 l) in die organische Phase zu übertragen, die in Schritt 7.13 gesammelt wurde.
- Verwenden Sie den Stickstoffgasstrom, um das Lösungsmittel in den kombinierten organischen Phasen zu verdampfen. Schließen Sie die Rohre, die den Lipidfilm enthalten, unter dem Fluss von Stickstoffgas. Bewahren Sie diese Rohre bei -80 °C auf.
8. Trennung der extrahierten Lipide durch LC
- Fügen Sie 500 l Acetonitril/2-Propanol/Nano-reines Wasser (65:35:5) in ein Rohr, das den bei Schritt 7.16 erhaltenen Lipidfilm enthält. Wirbel das Rohr 3x für 10 s bei RT.
- Unterziehen Sie den Inhalt der Röhre einer Ultraschallbeschallung für 15 min. Vortex das Rohr 3x für 10 s bei RT.
- Nehmen Sie 100 l einer Probe aus dem Rohr und fügen Sie sie in eine Glasflasche mit einem Einsatz für eine Wellplatte. Beseitigen Sie Luftblasen im Einsatz, bevor Sie sie in die Wellplate einbauen.
- Verwenden Sie ein LC-System, um verschiedene Lipidarten auf einer umgekehrten Phase c18-Spalte CSH gekoppelt mit einem vorkolenden System zu trennen (siehe Tabelle der Materialien). Während der Trennung die Säule bei 55 °C und bei einer Durchflussrate von 0,3 ml/min halten. Halten Sie die Probe in der Bohrplatte bei RT.
- Verwenden Sie die beweglichen Phasen, die aus Mischung A (Acetonitril/Wasser [60:40 (v/v)]) und Mischung B (Isopropanol/Acetonitril [90:10 (v/v)]) bestehen. Für einen positiven Modus der Detektion von Elternionen, die mit der Elektrospray-Ionisation (ESI)-Ionenquelle erzeugt werden, enthalten die mobilen Phasen A und B Bei der Endkonzentration von 10 mM das Ammoniumformat. Für einen negativen Modus der Stammionenerkennung enthalten die ESI (-) Modus, die mobilen Phasen A und B Ammoniumacetat bei der Endkonzentration von 10 mM.
- Verwenden Sie für die Injektion in den ESI-Modus (+) und den ESI-Modus (-) ein Probenvolumen von 10 l.
- Trennen Sie verschiedene Lipidarten durch LC mit dem folgenden LC-Gradienten: 0-1 min 10% (Phase B); 1-4 min 60% (Phase B); 4-10 min 68% (Phase B); 10-21 97% (Phase B); 21-24 min 97% (Phase B); 24-33 min 10% (Phase B).
- Führen Sie Extraktionsrohlinge als erste Probe zwischen allen vier Proben und als letzte Probe aus. Subtrahieren Sie den Hintergrund, um Daten zu normalisieren.
- Abbildung 1zeigt ein repräsentatives Gesamtionenchromatogramm aus LC/MS-Daten von Lipiden, die aus Zellen des Wildstamms BY4742 extrahiert wurden.
9. Massenspektrometrische Analyse von lipiden getrennt durch LC
- Verwenden Sie ein Massenspektrometer, das mit einer HESI-Ionenquelle (beheizte Elektrospray-Ionisierung) ausgestattet ist, um Lipide zu analysieren, die durch LC getrennt wurden. Verwenden Sie die in Tabelle 2angegebenen Einstellungen .
- Verwenden Sie den Fourier-Transformationsanalysator, um Elternionen (MS1) mit einer Auflösung von 60.000 und im Massenbereich von 150-2.000 Da zu erkennen.
- Verwenden Sie die in Tabelle 3 angegebenen Einstellungen, um sekundäre Ionen (MS2) zu erkennen.
10. Identifizierung und Quantifizierung verschiedener Lipidklassen und Arten durch Verarbeitung von Rohdaten von LC-MS/MS
- Siehe Tabelle der Materialien für Software, um die Identifizierung und Quantifizierung von verschiedenen Lipiden aus rohen LC-MS/MS-Dateien durchzuführen. Diese Software verwendet die größte Lipid-Datenbank, die mehr als 1,5 Millionen Lipidionen-Vorläufer (MS1) und ihre vorhergesagten Fragmentionen (MS2) enthält. Die Software verwendet auch MS1-Peaks für die Lipidquantitation und MS2 zur Lipididentifikation. Ein repräsentatives Chromatogramm zweier isomerischer Phosphatidylserinformen (34:0), die den gleichen m/z-Wert, aber unterschiedliche Retentionszeiten, sowie ihre MS1- und MS2-Spektren aufweisen, sind in Abbildung 2, Abbildung 3und Abbildung 4dargestellt.
- LC-MS-Rohdateien mit full-scan MS1-Daten und datenabhängigen MS2-Daten nach freien (unesterifizierten) Fettsäuren (FFA), Cardiolipin (CL), Phytoceramid (PHC), Phytosphingosin (PHS), Phosphatidylcholin (PC), Phospha Tidylethanolamin (PE), Phosphatidylglycerol (PG), Phosphatidylinositol (PI), Phosphatidylserin (PS) und Triacylglycerol (TAG) Lipidklassen mit einer m/z-Toleranz von 5 ppm für Vorläuferionen und 10 ppm für Produktionen. Weitere Suchparameter sind in Tabelle 4dargestellt. Befolgen Sie die Anweisungen im Software-Benutzerhandbuch. Die Identitäten von internen Lipidstandards und Lipidarten mit ungewöhnlicher Fettsäurezusammensetzung müssen manuell überprüft werden.
- Um verschiedene Lipidklassen und -arten mit Hilfe frei verfügbarer Open-Source-Alternativen für die Lipid Search Software zu identifizieren und zu quantitieren, verwenden Sie die Software Lipid Data Analyzer (http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml), MZmine 2 (http://mzmine.github.io/) oder XCMS (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html), um Rohdaten von LC-MS/MS zu verarbeiten.
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Representative Results
Unsere Methode zur quantitativen Bewertung wichtiger zellulärer Lipide innerhalb einer Hefezelle mit Hilfe von LC-MS/MS war vielseitig und robust. Es ermöglichte uns, 10 verschiedene Lipidklassen in S. cerevisiae Zellen zu identifizieren und zu quantifizieren, die im synthetischen minimalen YNB-Medium kultiviert wurden, das zunächst 2% Glukose enthielt. Diese Lipidklassen umfassen freie (unesterifizierte) Fettsäuren (FFA), CL, Phytoceramid (PHC), Phytosphingosin (PHS), PC, PE, PG, PI, PS und TAG (Ergänzende Tabelle 1). Zahlreiche molekulare Arten jeder dieser Klassen wurden mit dieser LC-MS/MS-Methode identifiziert und quantifiziert (Ergänzende Tabelle 1).
Unsere LC-MS/MS-Methode war ebenfalls empfindlich. Tatsächlich ermöglichte sie die Identifizierung und Quantifizierung molekularer Lipidarten in Konzentrationen von bis zu 0,165 pmol/L (siehe Daten für Phytoceramid in Tabelle 5). Diese Quantifizierungsgrenze unterscheidet sich für verschiedene Lipidklassen innerhalb eines breiten Konzentrationsbereichs (Tabelle 5).
Wichtig ist, dass unsere Methode die Identifizierung und Quantifizierung verschiedener isobareric oder isomer Formen von Lipiden ermöglichte. Isobarische Formen von Lipiden sind Lipidarten mit der gleichen Nominalmasse (d.h. Summe der Massen der am häufigsten vorkommenden Isotope), aber unterschiedlichen exakten Massen31. Isomerische Formen von Lipiden sind Lipidarten mit der gleichen molekularen Formel, aber mit unterschiedlicher chemischer Struktur31. Zum Beispiel die Verwendung unserer LC-MS/MS-Methode, die zwischen PHC (16:0_26:0) und den isobarischen Lipidarten PC (16:0_10:0) unterscheidet: Obwohl sie den gleichen Nominalmassenwert von 650 haben, sind ihre genauen Massen 650.6457 bzw. 650.4755. Darüber hinaus unterscheidet diese LC-MS/MS-Methode zwischen zwei Paaren isomerischer Lipidarten mit der gleichen molekularen Formel, aber unterschiedlicher chemischer Struktur: 1) PC (18:0_18:1) und PC (20:0_16:1), mit molekularer Formel (C44H87N1O8P1) und exakter Masse (788.6163); und 2) PE (16:0_16:0) und PE (14:0_18:0), mit der molekularen Formel (C37H75N1O8P1) und exakter Masse (692.5224).
Unsere LC-MS/MS-Methode kann verwendet werden, um die Effizienz der Ionisation für Lipide aller Klassen zu erhöhen und so die Identifizierung und Quantifizierung wichtiger zellulärer Lipide zu verbessern. Eine solche Verbesserung kann durch den Einsatz alternativer mobiler Phasenzusatzstoffe für die ESI MS (Tabelle 6) erreicht werden. Zu diesen alternativen Phasen gehören Ammoniumformate, Ammoniumformate mit Ameisensäure, Ammoniumacetat, Ammoniumacetat mit Essigsäure und Ammoniumacetat mit Ameisensäure. Jeder dieser alternativen mobilen Phasenadditive kann sowohl für die Normalphasen- als auch für die Reverse-Phase-LC-Säulen verwendet werden (Tabelle 6).
Ein weiterer Vorteil unserer LC-MS/MS-Methode besteht in der Möglichkeit, zwei verschiedene Methoden zur Fragmentierung von Vorläuferionen (MS1) von Lipiden in MS2-Produkte zu verwenden. Diese beiden Methoden sind hochenergetische Kollisionsdissoziation (HCD) und kollisionsinduzierte Dissoziation (CID)32. Wir fanden heraus, dass die CID-Methode vorteilhaft ist, wenn sie in Kombination mit dem mobilen Ammoniumacetat-Additiv für den ESI-(-) Ms-Modus verwendet wird, da es unter diesen Bedingungen eine Erhöhung der Effizienz der MS1-Lipidionenfragmentierung in MS2-Produkte für PHC, CL, FFA, PE, PG, PI und PS ermöglicht (Tabelle 7). Im Gegensatz dazu ist die HCD-Methode günstig, wenn sie in Kombination mit dem mobilen Ammoniumformat-Additiv für den MS-Modus (+) verwendet wird, da es unter diesen Bedingungen eine Erhöhung der Effizienz der MS1-Lipidionenfragmentierung in MS2-Produkte für PC, PHS und TAG ermöglicht (Tabelle 8).
Abbildung 1: Die gesamten Ionenchromatogramme (TIC) aus der Flüssigchromatographie/Massenspektrometrie (LC/MS) Daten von Lipiden, die aus Zellen des Wildstamms BY4742 extrahiert wurden. Das TIC von Lipiden, die durch LC auf einer Reverse-Phase-Säule CSH C18 getrennt und von MS von übergeordneten Ionen erfasst wurden, die mit dem negativen Elektrospray-Ionisationsmodus erzeugt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Ein Chromatogramm zweier isomerischer Phosphatidylserinformen (34:0), die den gleichen m/z-Wert (M-H) von 762,5294, aber unterschiedliche Retentionszeiten von 7,65 min und 8,49 min aufweisen. Die Lipide wurden aus Zellen des Wildstamms BY4742 extrahiert und durch Flüssigchromatographie auf einer Reverse-Phasen-Säule CSH C18 getrennt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: MS1-Spektren zweier isomerischer Phosphatidylserin-Arten (34:0), die den gleichen m/z-Wert (M-H) von 762,5294, aber unterschiedliche Retentionszeiten von 7,65 min und 8,49 min aufweisen. Die Lipide wurden aus Zellen des Wildstamms BY4742 extrahiert, durch Flüssigchromatographie auf einer Reverse-Phasen-Säule CSH C18 (siehe Abbildung 2)getrennt und durch Massenspektrometrie von Eltern (MS1)-Ionen nachgewiesen, die mit dem negativen Elektrospray-Ionisationsmodus erzeugt wurden. (A) Das MS1-Spektrum einer Phosphatidylserinform (34:0) mit dem m/z-Wert (M-H) von 762,5294 und der Retentionszeit von 7,65 min. (B) Das MS1-Spektrum einer Phosphatidylserinform (34:0) mit dem m/z-Wert (M-H) von 762.5294 und der Retentionszeit von 8,49 min. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: MS2-Spektren zweier isomerischer Phosphatidylserin-Arten (34:0), die den gleichen m/z-Wert (M-H) von 762,5294, aber unterschiedliche Retentionszeiten von 7,65 min und 8,49 min aufweisen. Die Lipide wurden aus Zellen des Wildstamms BY4742 extrahiert, durch Flüssigchromatographie auf einer Reverse-Phasen-Säule CSH C18 (siehe Abbildung 2)getrennt und durch Massenspektrometrie von MS1-Ionen nachgewiesen (siehe Abbildung 3). Sekundärionen (MS2) wurden dann durch Massenspektrometrie nachgewiesen. (A) Das MS2-Spektrum einer Phosphatidylserinform (34:0) mit dem m/z-Wert (M-H) von 762,5294 und der Retentionszeit von 7,65 min. Der Verlust eines serinen Anteils erzeugte ein Ionen mit dem m/z-Wert (M-H) von 675.6149. (B) Das MS2-Spektrum einer Phosphatidylserinform (34:0) mit dem m/z-Wert (M-H) von 762,5294 und der Retentionszeit von 8,49 min. Der Verlust eines serinen Anteils erzeugte ein Ion mit dem m/z-Wert (M-H) von 675.8843. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Erkennungsmodus | Lipidklasse | Hydrophobe Schwanzzusammensetzung | Berechneter m/z-Wert | Konzentration (Pmoles/l) |
| Negative | Ceramid | 18:1_17:0 | 550.5204675 | 226 |
| Negative | Cardiolipin | 14:0_14:0_14:0_14:0 | 1239.839755 | 196 |
| Negative | Freie Fettsäure | 19:0 | 297.2799035 | 837 |
| Negative | Phosphatidylethanolamin | 15:0_15:0 | 662.4766305 | 377 |
| Negative | Phosphatidylglycerol | 15:0_15:0 | 693.4712115 | 349 |
| Negative | Phosphatidylinositol | 17:0_20:4 | 871.5342065 | 3 |
| Negative | Phosphatidylserin | 17:0_17:0 | 762.5290605 | 318 |
| Positive | Phosphatidylcholin | 13:0_13:0 | 650.4755335 | 385 |
| Positive | Phytosphingosin | 16:1 | 272.2584055 | 225 |
| Positive | Triacylglycerol | 28:1_10:1_10:1 | 818.7232155 | 367 |
Tabelle 1: Zusammensetzung einer Mischung interner Lipidnormen. Interne Lipidstandards wurden in Chloroform/Methanol (2:1) gemisch hergestellt. Der Erkennungsmodus bezieht sich auf einen positiven oder negativen Modus der Erkennung von Elternionen mit einem Orbitrap Velos Massenspektrometer, das mit einer ESI-Ionenquelle (Electrospray Ionization) ausgestattet ist. Die berechneten m/z-Werte sind für die Addukte von Lipiden.
| FTMS + p Auflösung | 60000 |
| Massenbereich (dalton) | 150-2000 |
| Ionenquelltyp | Hesi |
| Kapillartemperatur (°C) | 300 |
| Quellheiztemperatur (°C) | 300 |
| Mantelgasstrom | 10 |
| Aux-Gasstrom | 5 |
| Positive Polaritätsspannung (kV) | 3 |
| Negative Polaritätsspannung (kV) | 3 |
| Quellstrom (A) | 100 |
Tabelle 2: Die Einstellungen des Orbitrap Velos-Massenspektrometers zur Analyse von Lipiden, die durch LC getrennt wurden. Abkürzungen: FTMS + p = Fourier transformbasierte Massenspektrometrie im ESI (+)-Modus; HESI = beheizte Elektrospray-Ionisation.
| Instrumentenpolarität | Positive | Negative |
| Aktivierungstyp | Hochenergetische-induzierte Kollisionsdissoziation | Kollisionsinduzierte Dissoziation |
| Minimales Signal erforderlich | 5000 | 5000 |
| Isolationsbreite | 2 | 2 |
| Normalisierte Kollisionsenergie | 55 | 35 |
| Standard-Ladezustand | 2 | 2 |
| Aktivierungszeit | 0.1 | 10 |
| FTMS + C Auflösung | 7500 | |
| 5 intensivste Spitzen wurden für ms/ms ausgewählt |
Tabelle 3: Die Einstellungen des Orbitrap Velos-Massenspektrometers zur Erkennung von Sekundärionen (MS2). Abkürzung: FTMS + C = Fourier transformbasierte Massenspektrometrie im ESI (+)-Modus.
| Identifizierung | |
| Datenbank | Orbitrap |
| Peak-Erkennung | Rückrufisotop (ON) |
| Suchoption | Produktsuche Orbitrap |
| Suchtyp | Produkt |
| Experimentiertyp | LC-MS |
| Vorläufertoleranz | 10 ppm |
| Produkttoleranz | Hochenergetisch-induzierte Kollisionsdissoziation [ESI (+) Modus]: 20 ppm |
| Kollisionsinduzierte Dissoziation [ESI (-) Modus]: 0,5 Daltons | |
| Quantifizierung | |
| Quantifizierung ausführen | Auf |
| m/z Toleranz | -5.0; +5,0 |
| Toleranztyp | Ppm |
| Filter | |
| Top-Rang-Filter | Auf |
| Hauptknotenfilter | Haupt-Isomer-Spitze |
| m-Score-Schwellenwert | 5 |
| c-Score-Schwellenwert | 2 |
| FFA-Priorität | Auf |
| ID-Qualitätsfilter | A: Lipidklasse & alle Fettsäuren sind vollständig identifiziert |
| B: Lipidklasse & einige Fettsäuren werden identifiziert | |
| C: Lipidklasse oder FA werden identifiziert | |
| D: Lipid durch andere Fragmentionen (H2O, etc.) identifiziert | |
| Lipidklasse | |
| Hochenergetisch-induzierte Kollisionsdissoziation [ESI (+) Modus] | PC, TAG |
| Kollisionsinduzierte Dissoziation [ESI (-) Modus] | CER, CL, FFA, PE, PG, PI, PS |
| Ionen | |
| Hochenergetisch-induzierte Kollisionsdissoziation [ESI (+) Modus] | + H; + NH4; + Na |
| Kollisionsinduzierte Dissoziation [ESI (-) Modus] | - H; - 2H; - HCOO |
Tabelle 4: Die Suchparameter, die verwendet werden, um verschiedene Lipidklassen und Arten mit Hilfe der Lipid-Identifikationssoftware "Lipid Search" (V 4.1) zu identifizieren. Abkürzungen: CER = Ceramid; CL = Cardiolipin; FFA = freie (unesterifizierte) Fettsäure; PC = Phosphatidylcholin; PE = Phosphatidylethanolamin; PG = Phosphatidylglycerol; PI = Phosphatidylinositol; PS = Phosphatidylserin; TAG = Triacylglycerol.
Tabelle 5: Die niedrigsten Konzentrationen molekularer Arten verschiedener Lipidklassen, die mit Hilfe unserer LC-MS/MS-Methode identifiziert und quantisiert werden können. Eine Schätzung der niedrigsten quantifizierbaren Konzentration für jede Lipidklasse basiert auf den MS-Spitzenbereichen für ihren internen Standard (diese MS-Spitzenbereiche und Lipidstandardkonzentrationen werden fett dargestellt) und ihrer repräsentativen molekularen Form, die bei der niedrigsten nachweisbaren Konzentration vorhanden ist. Die Daten werden als Mittelwerte von zwei unabhängigen Experimenten dargestellt, für die jeweils drei technische Replikationen durchgeführt wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
| Lipidstandard | ESI-Modus | Amf | AmF/FA | Amac | Amac/AA | AmAc/FA |
| Phc | - | 74 | 75.2 | 85.8 | 77 | 74.8 |
| Cl | - | 72.9 | 75.1 | 78.3 | 68.4 | 74 |
| Ffa | - | 77.1 | 77.2 | 75.5 | 84 | 72.9 |
| Pe | - | 98 | 96 | 95 | 91.5 | 86 |
| Pg | - | 64 | 45.1 | 75.9 | 60.5 | 55 |
| Pi | - | 79.3 | 76 | 82.5 | 80.3 | 77 |
| Ps | - | 73.7 | 61.6 | 85.8 | 81.4 | 73.7 |
| Pc | + | 93.5 | 86.9 | 69.3 | 60.5 | 62.7 |
| Phs | + | 89.1 | 79.2 | 78.1 | 73.7 | 69.3 |
| Etikett | + | 92.4 | 88 | 86.9 | 80.3 | 84.7 |
Tabelle 6: Die Auswirkungen alternativer mobiler Phasenzusatzstoffe für das ESI MS auf die Effizienz der Ionisation für Lipide verschiedener Klassen. Verschiedene Lipide wurden durch eine umgekehrte Flüssigchromatographie voneinander getrennt. Kommerzielle Lipidstandards, die zu verschiedenen Lipidklassen gehören, sind in Tabelle 1aufgeführt. Die ESI-(-) oder ESI (+) Art der Ionisierung wurde für MS in Gegenwart verschiedener mobiler Phasenadditive verwendet. Der Ionisationsprozentsatz für jeden Lipidstandard wird als Mittelwert aus drei technischen Replikationen dargestellt. Für jedes Lipid wurde der Ionisationsprozentsatz auf Der Grundlage der MS-Spitzenfläche berechnet. Ein Wert der höchsten Ionisationseffizienz für jedes Lipid wird fett dargestellt. Abkürzungen: AmF = Ammoniumformat; AmF/FA = Ammoniumformat mit Ameisensäure; AmAc = Ammoniumacetat; AmAc/AA = Ammoniumacetat mit Essigsäure; AmAc/FA = Ammoniumacetat mit Ameisensäure; CL = Cardiolipin; FFA = freie (unesterifizierte) Fettsäure; PC = Phosphatidylcholin; PE = Phosphatidylethanolamin; PG = Phosphatidylglycerol; PHC = Phytoceramid; PHS = Phytosphingosin; PI = Phosphatidylinositol; PS = Phosphatidylserin; TAG = Triacylglycerol.
| Lipidstandard | ESI-Modus | Amf | Amac |
| Phc | - | 75 | 83.8 |
| Cl | - | 70.9 | 79.3 |
| Ffa | - | 76.1 | 74.5 |
| Pe | - | 98 | 95 |
| Pg | - | 64 | 75.9 |
| Pi | - | 79.3 | 82.5 |
| Ps | - | 71.5 | 84.8 |
| Pc | + | 52.3 | 60.5 |
| Phs | + | 78.4 | 75.2 |
| Etikett | + | 65.7 | 69.7 |
Tabelle 7: Die Wirkung der Kollisions-induzierten Dissoziation (CID)-Methode auf die Effizienz der Vorläuferionen (MS1)-Fragmentierung. Kommerzielle Lipidstandards, die zu verschiedenen Lipidklassen gehören, sind in Tabelle 1aufgeführt. Die ESI-(-) oder ESI (+) Art der Ionisation wurde für MS in Gegenwart eines Ammoniumformats (AmF) oder Ammoniumacetat (AmAc) mobilen Phasenadditivs verwendet. Der Prozentsatz der IN MS2-Produkte fragmentierten MS1-Lipidionen wird als Mittelwert aus drei technischen Replikationen dargestellt. Für jedes Lipid wurde der Ionisationsprozentsatz auf der Grundlage der MS2-Spitzenfläche berechnet. Ein Wert des höchsten Prozentsatzes der fragmentierten MS1-Lipidionen wird für jedes Lipid fett dargestellt (vergleiche mit den in Tabelle 8dargestellten Daten). Dieser Wert ist der höchste, wenn der Wirkungsgrad der MS2-Produktionenbildung am höchsten ist. Abkürzungen: CL = Cardiolipin; FFA = freie (unesterifizierte) Fettsäure; PC = Phosphatidylcholin; PE = Phosphatidylethanolamin; PG = Phosphatidylglycerol; PHC = Phytoceramid; PHS = Phytosphingosin; PI = Phosphatidylinositol; PS = Phosphatidylserin; TAG = Triacylglycerol.
| Lipidstandard | ESI-Modus | Amf | Amac |
| Phc | - | 68.4 | 65.4 |
| Cl | - | 74.3 | 75.2 |
| Ffa | - | 84.2 | 81.2 |
| Pe | - | 85.1 | 73.1 |
| Pg | - | 68.4 | 67.1 |
| Pi | - | 58.7 | 55.8 |
| Ps | - | 67.4 | 68.5 |
| Pc | + | 92.5 | 65.3 |
| Phs | + | 87.1 | 75.1 |
| Etikett | + | 91.4 | 84.9 |
Tabelle 8: Die Wirkung der Hochenergie-Kollisionsdissoziation (HCD) auf die Effizienz der Vorläuferionen (MS1)-Fragmentierung. Kommerzielle Lipidstandards, die zu verschiedenen Lipidklassen gehören, sind in Tabelle 1aufgeführt. Die ESI-(-) oder ESI (+) Art der Ionisation wurde für MS in Gegenwart eines Ammoniumformats (AmF) oder Ammoniumacetat (AmAc) mobilen Phasenadditivs verwendet. Der Prozentsatz der IN MS2-Produkte fragmentierten MS1-Lipidionen wird als Mittelwert aus drei technischen Replikationen dargestellt. Für jedes Lipid wurde der Ionisationsprozentsatz auf der Grundlage der MS2-Spitzenfläche berechnet. Ein Wert des höchsten Prozentsatzes der fragmentierten MS1-Lipidionen wird für jedes Lipid fett dargestellt (vergleiche mit den in Tabelle 7dargestellten Daten). Dieser Wert ist der höchste, wenn der Wirkungsgrad der MS2-Produktionenbildung am höchsten ist. Andere Abkürzungen: CL = Cardiolipin; FFA = freie (unesterifizierte) Fettsäure; PC = Phosphatidylcholin; PE = Phosphatidylethanolamin; PG = Phosphatidylglycerol; PHC = Phytoceramid; PHS = Phytosphingosin; PI = Phosphatidylinositol; PS = Phosphatidylserin; TAG = Triacylglycerol.
Ergänzende Tabelle 1: Eine Liste molekularer Arten von 10 verschiedenen Lipidklassen, die in S. cerevisiae-Zellen mit Hilfe unserer LC-MS/MS-Methode identifiziert und quantifiziert wurden. Diese Lipidklassen umfassten freie (unesterifizierte) Fettsäuren (FFA), Cardiolipin (CL), Phytoceramid (PHC), Phytosphingosin (PHS), Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylglycerol (PG), Phosphatidylinositol (PI), Phosphatidylserin (PS) und Triacylglycerol (PS). S. cerevisiae Zellen wurden in der synthetischen minimalen YNB Medium zunächst mit 2% Glukose kultiviert. Aliquots von Hefezellen zur Lipidextraktion und LC-MS/MS-Analyse extrahierter Lipide wurden an den Tagen 1, 2, 3, 4, 6, 8 und 10 der Kultivierung zurückgewonnen. Gezeigt werden alle Lipidarten jeder Lipidklasse, die in Hefezellen identifiziert wurden, die an verschiedenen Tagen der Kultivierung wiederhergestellt wurden. Einige dieser Lipidarten waren nur in chronologisch jungen Hefezellen vorhanden, die sich an den Tagen 1-4 der Kultivierung erholten, andere nur in chronologisch alten Hefezellen, die an den Tagen 6-10 der Kultivierung wiederhergestellt wurden, während einige sowohl in chronologisch jungen als auch in alten Hefezellen vorhanden waren. Es wird der höchste MS-Spitzenbereich für jede Lipidart jeder Lipidklasse angezeigt, die an einem bestimmten Kultivierungstag identifiziert wurde. Lipidstandards verschiedener Lipidklassen, die für die Quantifizierung anderer Arten innerhalb dieser Lipidklasse verwendet wurden, werden in roter Farbe angezeigt. Die berechneten m/z-Werte sind für die Addukte von Lipiden. Abkürzung: ESI (-) = der ESI (-) Modus von MS; ESI (+) = der ESI (+) Modus von MS. Daten werden als Mittelwerte von zwei unabhängigen Experimenten dargestellt, für die jeweils drei technische Replikationen durchgeführt wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
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Discussion
Die folgenden Vorsichtsmaßnahmen sind wichtig für die erfolgreiche Implementierung des hier beschriebenen Protokolls:
1. Chloroform und Methanol sind giftig. Sie extrahieren effizient verschiedene Substanzen von Oberflächen, einschließlich Labor-Kunststoffundzeug und Ihre Haut. Behandeln Sie daher diese organischen Lösungsmittel mit Vorsicht, indem Sie die Verwendung von Kunststoffen in Schritten vermeiden, die den Kontakt mit Chloroform und/oder Methanol beinhalten, Borosilikatglaspipetten für diese Schritte verwenden und diese Pipetten vor der Verwendung mit Chloroform und Methanol spülen.
2. Verwenden Sie während der Lipidextraktion durch Methanol/Chlorform (17:1) gemisch eine Borosilikatglaspipette, um die untere organische Phase (ca. 400 l) auf ein 15 ml hochfestes Glasschnecken-Spitzenzentrifugenrohr mit einer mit Polytetrafluorethylen ausgekleideten Kappe zu übertragen. Unterbrechen Sie während des Transfers nicht die Glasperlen oder die obere wässrige Phase. Halten Sie die untere organische Phase unter dem Fluss von Stickstoffgas.
3. Während der Probenvorbereitung für LC-MS/MS ist es wichtig, alle Luftblasen in den Glasfläschchen zu beseitigen, bevor die Durchstechflaschen in eine Wellplatte eingesetzt werden.
4. Um eine vollständige Löslichkeit von Ammoniumformat und Ammoniumacetat in den beweglichen Phasen A und B vor der Lipidtrennung durch LC zu erreichen, lösen Sie jedes Salz in 500 l nanoreinem Wasser auf, bevor Sie die Lösung mit der mobilen Phase mischen und 20 min beschallen.
5. Lagern Sie den nach der Lösungsmittelverdampfung gebildeten Lipidfilm nicht über einen längeren Zeitraum vor dem Laufen auf. Wir lagern diesen Film bei -80 °C nicht mehr als eine Woche, bevor wir ihn in der Acetonitril/2-Propanol/Nano-reinen Wassermischung (65:35:5) auflösen und dann die Lipide LC-MS/MS unterziehen.
Die hier beschriebene LC-MS/MS-Methode ist eine vielseitige, robuste und empfindliche Technik für eine quantitative Bewertung vieler Lipidarten, die das zelluläre Lipidom der Hefe oder einen anderen eukaryotischen Organismus umfassen. Die Methode ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung verschiedener isobarener oder isomerischer Lipidarten, ermöglicht die Verwendung alternativer mobiler Phasenadditive für die ESI MS, um die Lipidionisierung zu fördern und die Lipididentifikation und -quantifizierung effizienter zu gestalten, und kann sowohl HCD- als auch CID-Methoden zur Fragmentierung oder Aktivierung von MS1-Lipidionen verwenden.
Wir verwenden diese LC-MS/MS-Methode, um altersbedingte Veränderungen der zellulären und organellarären Lipidome während der chronologischen Alterung der angehenden Hefe S. cerevisiae zuuntersuchen. Wir verwenden diese Methode auch, um zu untersuchen, wie viele alterungsverzögernde genetische, diätetische und pharmakologische Interventionen die Lipidzusammensetzung der gesamten S. cerevisiae Zelle und ihrer verschiedenen Organellen beeinflussen. Aufgrund seiner Vielseitigkeit, Robustheit und Empfindlichkeit kann diese LC-MS/MS-Methode erfolgreich für die quantitative Bewertung der zellulären und organellarischen Lipidome in eukaryotischen Organismen in der Phyla eingesetzt werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Wir danken aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Titorenko-Labors für Diskussionen. Wir würdigen das Zentrum für biologische Anwendungen der Massenspektrometrie und das Zentrum für Strukturelle und Funktionelle Genomik (beide an der Concordia University) für herausragende Leistungen. Diese Studie wurde durch Stipendien des Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) kanadas (RGPIN 2014-04482) und des Concordia University Chair Fund (CC0113) unterstützt. K.M. wurde vom Concordia University Merit Award unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
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