Summary
Presentamos un protocolo que utiliza cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem para identificar y cuantificar los principales lípidos celulares en Saccharomyces cerevisiae. El método descrito para una evaluación cuantitativa de las principales clases de lípidos dentro de una célula de levadura es versátil, robusto y sensible.
Abstract
Los lípidos son moléculas anfipáticas estructuralmente diversas que son insolubles en agua. Los lípidos son factores esenciales que contribuyen a la organización y función de las membranas biológicas, el almacenamiento y la producción de energía, la señalización celular, el transporte vesicular de proteínas, la biogénesis de los orgánulos y la muerte celular regulada. Debido a que la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae es un eucariota unicelular susceptible de análisis moleculares exhaustivos, su uso como organismo modelo ayudó a descubrir mecanismos que vinculaban el metabolismo lipídico y el transporte intracelular a procesos biológicos complejos dentro de las células eucariotas. La disponibilidad de un método analítico versátil para la evaluación cuantitativa robusta, sensible y precisa de las principales clases de lípidos dentro de una célula de levadura es crucial para obtener información profunda sobre estos mecanismos. Aquí presentamos un protocolo para utilizar cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para el análisis cuantitativo de los principales lípidos celulares de S. cerevisiae. El método LC-MS/MS descrito es versátil y robusto. Permite la identificación y cuantificación de numerosas especies (incluyendo diferentes formas isobáricas o isoméricas) dentro de cada una de las 10 clases de lípidos. Este método es sensible y permite la identificación y cuantificación de algunas especies de lípidos a concentraciones tan bajas como 0,2 pmol/L. El método se ha aplicado con éxito para evaluar los lípidos de las células enteras de la levadura y sus orgánulos purificados. El uso de aditivos alternativos de fase móvil para la espectrometría de masas de ionización por electrospray en este método puede aumentar la eficiencia de la ionización para algunas especies de lípidos y, por lo tanto, puede utilizarse para mejorar su identificación y cuantificación.
Introduction
Un conjunto de evidencia indica que los lípidos, una de las principales clases de biomoléculas, desempeñan un papel esencial en muchos procesos vitales dentro de una célula eucariota. Estos procesos incluyen el montaje de bicapas lipídicas que constituyen la membrana plasmática y las membranas que rodean los orgánulos celulares, el transporte de pequeñas moléculas a través de las membranas celulares, la respuesta a los cambios en el entorno extracelular y la transducción de señales intracelulares, generación y almacenamiento de energía, importación y exportación de proteínas confinadas a diferentes orgánulos, tráfico vesicular de proteínas dentro del sistema de endomembrana y proteína de secreción, y varios modos de muerte celular regulada1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
La levadura en ciernes S. cerevisiae, un organismo eucariota unicelular, se ha utilizado con éxito para descubrir algunos de los mecanismos subyacentes a las funciones esenciales de los lípidos en estos procesos celulares vitales4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae es un valioso organismo modelo para descubrir estos mecanismos porque es susceptible a análisis integrales bioquímicos, genéticos, biológicos celulares, biológicos químicos, biológicos del sistema y microfluídicos21,22,23,24,25. Un mayor progreso en la comprensión de los mecanismos a través de los cuales el metabolismo lipídico y el transporte intracelular contribuyen a estos procesos celulares vitales requiere tecnologías sensibles de espectrometría de masas para la caracterización cuantitativa del lipidoma, la comprensión de la complejidad molecular del lípido, e integrando la lipidómica cuantitativa en una plataforma multidisciplinaria de biología de sistemas1,2,3,26, 27,28,29,30.
Los métodos actuales para la lipidómica cuantitativa asistida por espectrometría de masas de las células de levadura y las células de otros organismos eucariotas no son lo suficientemente versátiles, robustos o sensibles. Además, estos métodos utilizados actualmente son incapaces de diferenciar varias especies de lípidos isobáricos o isoméricos entre sí. Aquí describimos un método versátil, robusto y sensible que permite el uso de cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para el análisis cuantitativo de los principales lípidos celulares de S. cerevisiae.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de medios estériles para el cultivo de levadura
- Preparar 90 ml de un medio YP completo que contiene 1% (p/v) extracto de levadura y 2% (p/v) bactopeptona.
- Preparar 90 ml de un medio sintético mínimo YNB que contenga 0,67% (p/v) base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos, 20 mg/L L-histidina, 30 mg/L L-leucina, 30 mg/L L-lisina y 20 mg/L uracil.
- Divida 90 ml del medio YP completo por igual en dos matraces Erlenmeyer de 250 ml (es decir, 45 ml cada uno).
- Divida 90 ml del medio Sintético Mínimo YNB en dos matraces Erlenmeyer de 250 ml (es decir, 45 ml cada uno).
- Autoclave de los matraces con medios YP y YNB a 15 psi/121 oC durante 45 minutos antes de su uso.
2. Variedad de levadura
- Utilice la cepa de tipo silvestre BY4742 (MAT his3 -1 leu2 -0 lys2 -0 ura3-0).
3. Levadura de cultivo en el medio completo de YP con glucosa
- Autoclave una solución de 20% (p/v) de glucosa a 15 psi/121 oC durante 45 minutos antes de su uso.
- Añadir 5 ml de la solución estéril de 20% (p/v) de glucosa a cada uno de los dos matraces Erlenmeyer que contengan el medio YP estéril para una concentración final de 2% de glucosa (p/v).
- Utilice un bucle microbiológico para inocular las células de la cepa de tipo salvaje BY4742 en cada uno de los dos matraces de Erlenmeyer que contienen el medio YP con glucosa.
- Cultivar las células durante la noche a 30 oC con agitación rotacional a 200 rpm.
- Tome una alícuota de la cultura de la levadura. Utilice un hemocaquímetro para determinar el número total de células de levadura por ml de cultivo.
4. Transferencia de levadura y cultivo en el medio sintético mínimo YNB con glucosa
- Añadir 5 ml de la solución estéril de 20% (p/v) de glucosa a cada uno de los dos matraces Erlenmeyer que contengan el medio YNB estéril a una concentración final de 2% de glucosa (p/v).
- Utilice una pipeta estéril para transferir un volumen del cultivo de levadura durante la noche que contenga el número total de 5,0 x 107 células en cada uno de los dos matraces de Erlenmeyer que contienen el medio YNB con glucosa.
- Cultivo de las células durante al menos 24 h (o más, si el experimento lo requiere) a 30 oC con agitación rotacional a 200 rpm.
5. Preparación de reactivos, material de laboratorio y equipos para la extracción de lípidos
- Preparar lo siguiente: 1) grado alto (>99,9%) cloroformo; 2) grado alto (>99,9%) metanol; 3) 28% (v/v) solución de hidróxido de amonio en agua nanopura; 4) perlas de vidrio (lavadas con ácido, 425-600 m); 5) un vórtice con adaptador adecuado; 6) tubos centrífugos de vidrio de alta velocidad de 15 ml con tapas forradas de politetrafluoroetileno; 7) 17:1 y 2:1 mezclas de cloroformo y metanol; 8) una mezcla de cloroformo/metanol (2:1) con hidróxido de amonio al 0,1% (v/v); 9) Solución ABC (155 mM de bicarbonato de amonio, pH a 8,0); 10) una mezcla de normas internas de lípidos preparadas en una mezcla 2:1 de cloroformo y metanol, tal como se indica en el Cuadro 1; y 11) viales de muestra de vidrio de 2 ml con tapas forradas de politetrafluoroetileno para la extracción de lípidos celulares.
6. Preparación de reactivos, material de laboratorio y equipos para LC
- Preparar lo siguiente: 1) mezcla de acetonitrilo/2-propanol/agua nanopura (65:35:5); 2) un vórtice con adaptador adecuado; 3) un sonicador ultrasónico; 4) viales de vidrio con insertos para una placa de pozo; 5) un sistema LC equipado con una bomba binaria, degasser, y un autosampler; 6) una columna de fase inversa C18 (2,1 mm; 75 mm; tamaño de poro 130o; rango de pH de 1-11) acoplado a un sistema de pre-columna; 7) mezcla A: acetonitrilo/agua (60:40); y 8) mezcla B: isopropanol/acetonitrilo (90:10).
7. Extracción de lípidos de células de levadura
- Tome una alícuota de la cultura de la levadura. Utilice un hemocohtómetro o mida OD600 para determinar el número total de células de levadura por ml de cultivo.
- Tome un volumen de cultivo de levadura que contenga un número total de 5.0 x 107 celdas (3.3 unidades OD600). Coloque este volumen de cultivo en un tubo de microcentrífuga pretallado de 1,5 ml.
- Cosechar las células por centrifugación a 16.000 x g durante 1 min a 4oC. Descarta el sobrenadante.
- Añadir 1,5 ml de agua nanopura helada y lavar las células por centrifugación a 16.000 x g durante 1 min a 4 oC. Descarta el sobrenadante.
- Añadir 1,5 ml de solución ABC helada y lavar las células por centrifugación a 16.000 x g durante 1 min a 4 oC. Descarta el sobrenadante. El pellet celular se puede almacenar a -80 oC antes de la extracción de lípidos.
- Para comenzar la extracción de lípidos, descongelar el pellet celular sobre hielo.
- Resuspenda el gránulo celular en 200 ml de agua nanopura helada. Transfiera la suspensión de la celda a un tubo de centrífuga superior de tornillo de vidrio de alta resistencia de 15 ml con una tapa forrada de politetrafluoroetileno. Añadir lo siguiente a este tubo: 1) 25 l de la mezcla de normas internas de lípidos preparadas en cloroformo/metanol (2:1) mezcla; 2) 100 sL de perlas de vidrio lavadas con ácido de 425-600 m; y 3) 600 l de mezcla de cloroformo/metanol (17:1).
- Vortex el tubo a alta velocidad durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT) para interrumpir las células.
- Vortex el tubo a baja velocidad durante 1 h a RT para facilitar la extracción de lípidos.
- Incubar la muestra durante 15 minutos sobre hielo para promover la precipitación proteica y la separación de las fases acuosas y orgánicas entre sí.
- Centrifugar el tubo en una centrífuga clínica a 3.000 x g durante 5 min a RT. Este paso de centrifugación permite separar la fase acuosa superior de la fase orgánica inferior, que contiene todas las clases de lípidos.
- Utilice una pipeta de vidrio borosilicato para transferir la fase orgánica inferior (400 l) a otro tubo de centrífuga superior de tornillo de vidrio de alta resistencia de 15 ml con una tapa forrada de politetrafluoroetileno. No interrumpa las perlas de vidrio ni la fase acuosa superior durante dicha transferencia. Mantener la fase orgánica inferior bajo el flujo de gas nitrógeno.
- Añadir 300 l de mezcla cloroformo-metanol (2:1) a la fase acuosa superior restante para permitir la extracción de esfingolípidos y PA, PS, PI y CL. Vortex el tubo vigorosamente durante 5 minutos a RT.
- Centrifugar el tubo en una centrífuga clínica a 3.000 x g durante 5 min a RT.
- Utilice una pipeta de vidrio borosilicato para transferir la fase orgánica inferior (200 l) formada después de la centrifugación a la fase orgánica recogida en el paso 7.13.
- Utilice el flujo de gas nitrógeno para evaporar el disolvente en las fases orgánicas combinadas. Cierre los tubos que contienen la película lipídica bajo el flujo de gas nitrógeno. Almacene estos tubos a -80 oC.
8. Separación de los lípidos extraídos por LC
- Añadir 500 l de acetonitrilo/2-propanol/agua nanopura (65:35:5) mezcla a un tubo que contenga la película lipídica obtenida en el paso 7.16. Vortex el tubo 3x para 10 s en RT.
- Sujeto el contenido del tubo a sonicación ultrasónica durante 15 min. Vortex el tubo 3x para 10 s en RT.
- Tomar 100 ml de una muestra del tubo y añadirla a un vial de vidrio con un inserto utilizado para una placa de pozo. Elimine las burbujas de aire en la plaquita antes de introducirla en la placa de pozo.
- Utilice un sistema LC para separar diferentes especies de lípidos en una columna CSH de fase inversa C18 acoplada a un sistema de precolumna (ver Tabla de materiales). Durante la separación, mantenga la columna a 55 oC y a un caudal de 0,3 ml/min. Mantenga la muestra en la placa de pozo en RT.
- Utilice las fases móviles que consisten en la mezcla A (acetonitrilo/agua [60:40 (v/v)]) y la mezcla B (isopropanol/acetonitrilo [90:10 (v/v)]). Para un modo positivo de detección de iones parentales creados utilizando la fuente de iones de ionización por electrospray (ESI), el modo ESI (+), las fases móviles A y B contienen formate de amonio a la concentración final de 10 mM. Para un modo negativo de detección de iones primarios, el modo ESI (-), las fases móviles A y B contienen acetato de amonio a la concentración final de 10 mM.
- Utilice un volumen de muestra de 10 l para la inyección en el modo ESI (+) y ESI (-).
- Separar diferentes especies de lípidos por LC utilizando el siguiente gradiente LC: 0-1 min 10% (fase B); 1-4 min 60% (fase B); 4-10 min 68% (fase B); 10-21 97% (fase B); 21-24 min 97% (fase B); 24-33 min 10% (fase B).
- Ejecute espacios en blanco de extracción como la primera muestra, entre cada cuatro muestras y como la última muestra. Reste el fondo para normalizar los datos.
- En la Figura 1se muestra un cromatograma iónico total representativo a partir de datos LC/MS de lípidos extraídos de células de la cepa de tipo salvaje BY4742.
9. Análisis espectrométrico de masa de lípidos separados por LC
- Utilice un espectrómetro de masas equipado con una fuente de iones HESI (ionización electrospray calentada) para analizar los lípidos separados por LC. Utilice los ajustes proporcionados en la Tabla 2.
- Utilice el analizador de transformación Fourier para detectar iones primarios (MS1) con una resolución de 60.000 y dentro del rango de masa de 150-2.000 Da.
- Utilice la configuración proporcionada en la Tabla 3 para detectar iones secundarios (MS2).
10. Identificación y cuantificación de diferentes clases y especies de lípidos mediante el procesamiento de datos en bruto de LC-MS/MS
- Consulte la Tabla de materiales para el software para llevar a cabo la identificación y cuantificación de diferentes lípidos de archivos LC-MS/MS sin procesar. Este software utiliza la base de datos de lípidos más grande, que contiene más de 1,5 millones de precursores de iones de lípidos (MS1) y sus iones de fragmentos previstos (MS2). El software también utiliza picos MS1 para la cuantificación de lípidos y MS2 para la identificación de lípidos. Un cromatograma representativo de dos formas de fosfatidilserina isoscórica (34:0) que tienen el mismo valor m/z pero tiempos de retención diferentes, así como sus espectros MS1 y MS2, se muestran en la Figura 2, Figura 3y Figura 4, respectivamente.
- Buscar archivos en bruto LC-MS que contienen datos MS1 de exploración completa y datos MS2 dependientes de datos para ácidos grasos libres (no esterpizados) (FFA), cardiolipina (CL), fitoceramida (PHC), fitosfingosina (PHS), fosfatidilcolina (PC), fosfatidilcolina (PC), fosfatfoligo clases de lípidos de aitidylethanolamine (PE), fosfatidilglucerol (PG), fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina (PS) y triacilgliceroles (TAG) utilizando una tolerancia m/z de 5 ppm para iones precursores y 10 ppm para iones de producto. Otros parámetros de búsqueda se muestran en la Tabla 4. Siga las instrucciones proporcionadas en el manual del usuario del software. Las identidades de las normas internas de lípidos y especies de lípidos con composición inusual de ácidos grasos deben verificarse manualmente.
- Para identificar y cuantificar diferentes clases y especies de lípidos con la ayuda de alternativas de código abierto disponibles libremente para el software Lipid Search, utilice el software Lipid Data Analyzer (http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml), MZmine 2(http://mzmine.github.io/)o XCMS(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html) para procesar datos sin procesar de LC-MS/MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nuestro método para una evaluación cuantitativa de los principales lípidos celulares dentro de una célula de levadura con la ayuda de LC-MS/MS fue versátil y robusto. Nos permitió identificar y cuantificar 10 clases diferentes de lípidos en células de S. cerevisiae cultivadas en el medio sintético mínimo YNB que inicialmente contenía 2% de glucosa. Estas clases de lípidos incluyen ácidos grasos libres (no esterificados) (FFA), CL, fitoceramida (PHC), fitosfingosina (PHS), PC, PE, PG, PI, PS y TAG (Tabla suplementaria 1). Numerosas especies moleculares de cada una de estas clases fueron identificadas y cuantificadas utilizando este método LC-MS/MS(Tabla Suplementaria 1).
Nuestro método LC-MS/MS también era sensible. De hecho, habilitó la identificación y cuantificación de especies moleculares de lípidos a concentraciones tan bajas como 0,165 pmol/L (véanse los datos de la fitoceramida en el Cuadro 5). Este límite de cuantificación difiere para diferentes clases de lípidos dentro de una amplia gama de concentraciones (Tabla 5).
Es importante destacar que nuestro método permitió la identificación y cuantificación de diferentes formas isobáricas o isoméricas de lípidos. Las formas isobáricas de lípidos son especies lipídicas con la misma masa nominal (es decir, suma de las masas de los isótopos más abundantes) pero diferentes masas exactas31. Las formas isoméricas de lípidos son especies lipídicas con la misma fórmula molecular pero con diferente estructura química31. Por ejemplo, el uso de nuestro método LC-MS/MS distinguió entre PHC (16:0_26:0) y las especies isobáricas de lípidos PC (16:0_10:0): aunque tienen el mismo valor de masa nominal de 650, sus masas exactas son 650.6457 y 650.4755, respectivamente. Además, este método LC-MS/MS distinguía entre dos pares de especies de lípidos isoméricos con la misma fórmula molecular pero estructura química diferente: 1) PC (18:0_18:1) y PC (20:0_16:1), con fórmula molecular (C44H87N1O8P1) y masa exacta (788.6163); y 2) PE (16:0_16:0) y PE (14:0_18:0), con la fórmula molecular (C37H75N1O8P1) y la masa exacta (692.5224).
Nuestro método LC-MS/MS se puede utilizar para aumentar la eficiencia de la ionización de lípidos de todas las clases, mejorando así la identificación y cuantificación de los principales lípidos celulares. Dicha mejora puede lograrse mediante el uso de aditivos alternativos de fase móvil para la EM ESI(cuadro 6). Estas fases alternativas incluyen formate de amonio, formate de amonio con ácido fórmico, acetato de amonio, acetato de amonio con ácido acético y acetato de amonio con ácido fórmico. Cada uno de estos aditivos alternativos de fase móvil se puede utilizar tanto para las columnas LC de fase normal como para las de fase inversa(Tabla 6).
Otra ventaja de nuestro método LC-MS/MS consiste en la capacidad de utilizar dos métodos diferentes para la fragmentación de iones precursores (MS1) de lípidos en productos MS2. Estos dos métodos son la disociación colisonal de alta energía (HCD) y la disociación inducida por colisión (CID)32. Encontramos que el método CID es beneficioso si se utiliza en combinación con el aditivo de fase móvil de acetato de amonio para el modo ESI (-) de la EM, ya que en estas condiciones permite un aumento en la eficiencia de la fragmentación de iones de lípidos MS1 en productos MS2 para PHC, CL, FFA, PE, PG, PI y PS (Tabla 7). Por el contrario, el método HCD es favorable si se utiliza en combinación con el aditivo de fase móvil formate de amonio para el modo ESI (+) de la EM, ya que en estas condiciones permite un aumento de la eficiencia de la fragmentación del ion lipídico MS1 en productos MS2 para PC, PHS y TAG(Tabla 8).
Figura 1: El cromatografía iónica total (TIC) a partir de cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS) datos de lípidos que se extrajeron de células de la cepa de tipo silvestre BY4742. El TIC de los lípidos separados por LC en una columna de fase inversa CSH C18 y detectado por la EM de los iones primarios que fueron creados usando el modo de ionización de electrospray negativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Un cromatograma de dos formas de fosfatidilserina isoscórica (34:0) que tienen el mismo valor m/z (M-H) de 762.5294 pero diferentes tiempos de retención de 7,65 min y 8,49 min. Los lípidos se extrajeron de las células de la cepa de tipo silvestre BY4742 y se separaron por cromatografía líquida en una columna de fase inversa CSH C18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Espectros MS1 de dos especies de fosfatidilserina isoscórica (34:0) que tienen el mismo valor m/z (M-H) de 762.5294 pero diferentes tiempos de retención de 7,65 min y 8,49 min. Los lípidos se extrajeron de las células de la cepa de tipo silvestre BY4742, separados por cromatografía líquida en una columna de fase inversa CSH C18 (como se muestra en la Figura 2)y detectados por espectrometría de masas de iones principales (MS1) que se crearon utilizando el modo de ionización electrospray negativo. (A) El espectro MS1 de una forma de fosfatidilserina (34:0) con el valor m/z (M-H) de 762.5294 y el tiempo de retención de 7,65 min. (B) El espectro MS1 de una forma de fosfatidilserina (34:0) con el valor m/z (M-H) de 762.5294 y el tiempo de retención de 8,49 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Espectros MS2 de dos especies de fosfatidilserina isoscórica (34:0) que tienen el mismo valor m/z (M-H) de 762.5294 pero diferentes tiempos de retención de 7,65 min y 8,49 min. Los lípidos se extrajeron de las células de la cepa de tipo silvestre BY4742, separados por cromatografía líquida en una columna de fase inversa CSH C18 (como se muestra en la Figura 2)y detectados por espectrometría de masas de iones MS1 (como se muestra en la Figura 3). Los iones secundarios (MS2) fueron detectados por espectrometría de masas. (A) El espectro MS2 de una forma de fosfatidilserina (34:0) con el valor m/z (M-H) de 762.5294 y el tiempo de retención de 7,65 min. La pérdida de una mitad de serina produjo un ion con el valor m/z (M-H) de 675.6149. (B) El espectro MS2 de una forma de fosfatidilserina (34:0) con el valor m/z (M-H) de 762.5294 y el tiempo de retención de 8,49 min. La pérdida de una mitad de serina produjo un ion con el valor m/z (M-H) de 675.8843. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Modo de detección | Clase de lípidos | Composición de cola hidrófoba | Valor m/z calculado | Concentración (pmoles/l) |
| Negativo | Ceramida | 18:1_17:0 | 550.5204675 | 226 |
| Negativo | Cardiolipin | 14:0_14:0_14:0_14:0 | 1239.839755 | 196 |
| Negativo | Acido graso libre | 19:0 | 297.2799035 | 837 |
| Negativo | Fosfatidiletanolamina | 15:0_15:0 | 662.4766305 | 377 |
| Negativo | Fosfatidílycerol | 15:0_15:0 | 693.4712115 | 349 |
| Negativo | Fosfatidilinositol | 17:0_20:4 | 871.5342065 | 3 |
| Negativo | Fosfatidilserina | 17:0_17:0 | 762.5290605 | 318 |
| Positivo | Fosfatidilcolina | 13:0_13:0 | 650.4755335 | 385 |
| Positivo | Fitosfingosina | 16:1 | 272.2584055 | 225 |
| Positivo | Triacillycerol | 28:1_10:1_10:1 | 818.7232155 | 367 |
Tabla 1: La composición de una mezcla de normas internas de lípidos. Se prepararon normas internas de lípidos en mezcla de cloroformo/metanol (2:1). El modo de detección se refiere a un modo positivo o negativo de detección de iones padres utilizando un espectrómetro de masas Orbitrap Velos equipado con fuente de iones de ionización por electrospray (ESI). Los valores m/z calculados son para los aductos de lípidos.
| Resolución FTMS + p | 60000 |
| Rango de masa (dalton) | 150-2000 |
| Tipo de fuente de iones | Hesi |
| Temperatura capilar (oC) | 300 |
| Temperatura del calentador de origen (C) | 300 |
| Flujo de gas de vaina | 10 |
| Flujo de gas auxiliar | 5 |
| Tensión de polaridad positiva (kV) | 3 |
| Tensión de polaridad negativa (kV) | 3 |
| Corriente de origen (A) | 100 |
Tabla 2: Los ajustes del espectrómetro de masas Orbitrap Velos utilizados para analizar los lípidos separados por LC. Abreviaturas: FTMS + p - Espectrometría de masas basada en transformación de Fourier en el modo ESI (+); HESI - ionización de electrospray calentado.
| Polaridad del instrumento | Positivo | Negativo |
| Tipo de activación | Disociación de colisión inducida por alta energía | Disociación inducida por colisión |
| Señal mínima requerida | 5000 | 5000 |
| Ancho de aislamiento | 2 | 2 |
| Energía de colisión normalizada | 55 | 35 |
| Estado de cargo predeterminado | 2 | 2 |
| Tiempo de activación | 0.1 | 10 |
| Resolución FTMS + C | 7500 | |
| 5 picos más intensos fueron seleccionados para ms/ms |
Tabla 3: Ajustes del espectrómetro de masas Orbitrap Velos utilizados para detectar iones secundarios (MS2). Abreviatura: FTMS + C - Espectrometría de masas basada en transformación de Fourier en el modo ESI (+).
| Identificación | |
| Base | Orbitrap |
| Detección de picos | Recuperar isótopo (ON) |
| Opción de búsqueda | Búsqueda de productos Orbitrap |
| Tipo de búsqueda | Producto |
| Tipo de experimento | LC-MS |
| Tolerancia de precursores | 10 ppm |
| Tolerancia del producto | Disociación de colisión inducida por alta energía [modo ESI (+)]: 20 ppm |
| Disociación inducida por colisión [modo ESI (-)]: 0,5 Daltons | |
| Cuantificación | |
| Ejecutar cuantificación | En |
| tolerancia m/z | -5.0; +5.0 |
| Tipo de tolerancia | Ppm |
| Filtro | |
| Filtro de rango superior | En |
| Filtro de nodo principal | Pico principal del isómero |
| umbral de puntuación m | 5 |
| umbral de puntuación c | 2 |
| Prioridad ffA | En |
| Filtro de calidad ID | R: Clase de lípidos y todos los ácidos grasos están completamente identificados |
| B: Clase de lípidos y algunos ácidos grasos se identifican | |
| C: Se identifican la clase de lípidos o FA | |
| D: Lípidos identificados por otros iones de fragmentos (H2O, etc.) | |
| Clase de lípidos | |
| Disociación de colisión inducida por alta energía [modo ESI (+)] | PC, TAG |
| Disociación inducida por colisión [modo ESI (-)] | CER, CL, FFA, PE, PG, PI, PS |
| Iones | |
| Disociación de colisión inducida por alta energía [modo ESI (+)] | + H; + NH4; + Na |
| Disociación inducida por colisión [modo ESI (-)] | - H; - 2H; - HCOO |
Tabla 4: Los parámetros de búsqueda utilizados para identificar diferentes clases y especies de lípidos con la ayuda del software de identificación de lípidos "Lipid Search" (V 4.1). Abreviaturas: CER - ceramida; CL - cardiolipina; FFA - ácido graso libre (no esterificado); PC - fosfatidilcolina; PE - fosfatidiletanolamina; PG - fosfatidilglicerol; PI - fosfatidilinositol; PS - fosfatidilserina; TAG - triacilglycerol.
Tabla 5: Las concentraciones más bajas de especies moleculares de diferentes clases de lípidos que se pueden identificar y cuantificar con la ayuda de nuestro método LC-MS/MS. Una estimación de la concentración cuantificable más baja para cada clase de lípidos se basa en las áreas pico de la EP para su estándar interno (estas áreas pico de la EP y las concentraciones estándar de lípidos se muestran en negrita) y su forma molecular representativa presente en la concentración detectable más baja. Los datos se presentan como valores medios de dos experimentos independientes, para cada uno de los cuales se realizaron tres réplicas técnicas. Haga clic aquí para ver esta tabla (haga clic con el botón derecho para descargar).
| Estándar de lípidos | Modo ESI | Amf | AmF/FA | Amac | Amac/AA | AmAc/FA |
| Phc | - | 74 | 75.2 | 85.8 | 77 | 74.8 |
| Cl | - | 72.9 | 75.1 | 78.3 | 68.4 | 74 |
| Ffa | - | 77.1 | 77.2 | 75.5 | 84 | 72.9 |
| Pe | - | 98 | 96 | 95 | 91.5 | 86 |
| Pg | - | 64 | 45.1 | 75.9 | 60.5 | 55 |
| Pi | - | 79.3 | 76 | 82.5 | 80.3 | 77 |
| Ps | - | 73.7 | 61.6 | 85.8 | 81.4 | 73.7 |
| Pc | + | 93.5 | 86.9 | 69.3 | 60.5 | 62.7 |
| Phs | + | 89.1 | 79.2 | 78.1 | 73.7 | 69.3 |
| etiqueta | + | 92.4 | 88 | 86.9 | 80.3 | 84.7 |
Tabla 6: Los efectos de los aditivos alternativos de fase móvil para la ESE en las eficiencias de la ionización de lípidos de diferentes clases. Diferentes lípidos fueron separados entre sí por cromatografía líquida de fase inversa. Las normas comerciales de lípidos que pertenecen a diferentes clases de lípidos se nombran en la Tabla 1. El modo de ionización ESI (-) o ESI (+) se utilizó para la EP en presencia de diferentes aditivos de fase móvil. El porcentaje de ionización para cada estándar lipídico se muestra como un valor medio de tres réplicas técnicas. Para cada lípido, el porcentaje de ionización se calculó en función del área de pico de la EM. Un valor de la mayor eficiencia de ionización para cada lípido se muestra en negrita. Abreviaturas: AmF - formate de amonio; AmF/FA - formatede de amonio con ácido fórmico; AmAc - acetato de amonio; AmAc/AA - acetato de amonio con ácido acético; AmAc/FA - acetato de amonio con ácido fórmico; CL - cardiolipina; FFA - ácido graso libre (no esterificado); PC - fosfatidilcolina; PE - fosfatidiletanolamina; PG - fosfatidilglicerol; PHC - fitoceramida; PHS - fitosfingosina; PI - fosfatidilinositol; PS - fosfatidilserina; TAG - triacilglycerol.
| Estándar de lípidos | Modo ESI | Amf | Amac |
| Phc | - | 75 | 83.8 |
| Cl | - | 70.9 | 79.3 |
| Ffa | - | 76.1 | 74.5 |
| Pe | - | 98 | 95 |
| Pg | - | 64 | 75.9 |
| Pi | - | 79.3 | 82.5 |
| Ps | - | 71.5 | 84.8 |
| Pc | + | 52.3 | 60.5 |
| Phs | + | 78.4 | 75.2 |
| etiqueta | + | 65.7 | 69.7 |
Tabla 7: El efecto del método de disociación inducida por colisión (CID) en la eficiencia de la fragmentación de los iones precursores (MS1). Las normas comerciales de lípidos que pertenecen a diferentes clases de lípidos se nombran en la Tabla 1. El modo de ionización ESI (-) o ESI (+) se utilizó para la EP, en presencia de un aditivo de fase móvil de formatede de amonio (AmF) o acetato de amonio (AmAc). El porcentaje de iones lipídicos MS1 que se fragmentaron en productos MS2 se muestra como un valor medio de tres réplicas técnicas. Para cada lípido, el porcentaje de ionización se calculó en función del área de pico MS2. Un valor del porcentaje más alto de iones lipídicos MS1 que se fragmentaron se muestra en negrita para cada lípido (comparar con los datos presentados en la Tabla 8). Este valor es el más alto si la eficiencia de la formación de iones del producto MS2 es la más alta. Abreviaturas: CL - cardiolipina; FFA - ácido graso libre (no esterificado); PC - fosfatidilcolina; PE - fosfatidiletanolamina; PG - fosfatidilglicerol; PHC - fitoceramida; PHS - fitosfingosina; PI - fosfatidilinositol; PS - fosfatidilserina; TAG - triacilglycerol.
| Estándar de lípidos | Modo ESI | Amf | Amac |
| Phc | - | 68.4 | 65.4 |
| Cl | - | 74.3 | 75.2 |
| Ffa | - | 84.2 | 81.2 |
| Pe | - | 85.1 | 73.1 |
| Pg | - | 68.4 | 67.1 |
| Pi | - | 58.7 | 55.8 |
| Ps | - | 67.4 | 68.5 |
| Pc | + | 92.5 | 65.3 |
| Phs | + | 87.1 | 75.1 |
| etiqueta | + | 91.4 | 84.9 |
Tabla 8: El efecto del método de disociación colisonal de alta energía (HCD) en la eficiencia de la fragmentación de los iones precursores (MS1). Las normas comerciales de lípidos que pertenecen a diferentes clases de lípidos se nombran en la Tabla 1. El modo de ionización ESI (-) o ESI (+) se utilizó para la EP, en presencia de un aditivo de fase móvil de formatede de amonio (AmF) o acetato de amonio (AmAc). El porcentaje de iones lipídicos MS1 que se fragmentaron en productos MS2 se muestra como un valor medio de tres réplicas técnicas. Para cada lípido, el porcentaje de ionización se calculó en función del área de pico MS2. Un valor del porcentaje más alto de iones lipídicos MS1 que se fragmentaron se muestra en negrita para cada lípido (comparar con los datos presentados en la Tabla 7). Este valor es el más alto si la eficiencia de la formación de iones del producto MS2 es la más alta. Otras abreviaturas: CL - cardiolipina; FFA - ácido graso libre (no esterificado); PC - fosfatidilcolina; PE - fosfatidiletanolamina; PG - fosfatidilglicerol; PHC - fitoceramida; PHS - fitosfingosina; PI - fosfatidilinositol; PS - fosfatidilserina; TAG - triacilglycerol.
Tabla Suplementaria 1: Una lista de especies moleculares de 10 clases diferentes de lípidos identificadas y cuantificadas en células S. cerevisiae con la ayuda de nuestro método LC-MS/MS. Estas clases de lípidos incluían ácidos grasos libres (no estertalizados) (FFA), cardiolipina (CL), fitoceramida (PHC), fitosfingosina (PHS), fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilino (PIsitol), fosfatidilcolina (PS) y triacilglicerol (TAG). Las células de S. cerevisiae se cultivaron en el medio sintético mínimo YNB que inicialmente contenía 2% de glucosa. Las alícuotas de las células de levadura para la extracción de lípidos y el análisis LC-MS/MS de los lípidos extraídos se recuperaron en los días 1, 2, 3, 4, 6, 8 y 10 de cultivo. Se muestran todas las especies de lípidos de cada clase de lípidos que se identificaron en las células de levadura recuperadas en diferentes días de cultivo. Algunas de estas especies de lípidos estaban presentes sólo en células de levadura cronológicamente jóvenes recuperadas en los días 1-4 del cultivo, otras sólo en células de levadura cronológicamente viejas recuperadas en los días 6-10 de cultivo, mientras que algunas estaban presentes tanto en células de levadura cronológicamente jóvenes como viejas. Se muestra el área pico más alta de la EP para cada especie de lípidos de cada clase de lípidos identificada en un determinado día de cultivo. Los estándares de lípidos de diferentes clases de lípidos que se utilizaron para la cuantificación de otras especies dentro de esta clase de lípidos se muestran en color rojo. Los valores m/z calculados son para los aductos de lípidos. Abreviatura: ESI (-) - el modo ESI (-) de MS; ESI (+) - el modo ESI (+) de MS. Los datos se presentan como valores medios de dos experimentos independientes, para cada uno de los cuales se realizaron tres réplicas técnicas. Haga clic aquí para ver esta tabla (haga clic con el botón derecho para descargar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Las siguientes precauciones son importantes para la implementación exitosa del protocolo descrito aquí:
1. El cloroformo y el metanol son tóxicos. Extraen eficientemente diversas sustancias de las superficies, incluyendo plásticos de laboratorio y su piel. Por lo tanto, manipule estos disolventes orgánicos con precaución evitando el uso de plásticos en pasos que impliquen contacto con cloroformo y/o metanol, utilizando pipetas de vidrio borosilicato para estos pasos, y enhebando estas pipetas con cloroformo y metanol antes de su uso.
2. Durante la extracción de lípidos por mezcla de metanol/cloroformo (17:1), utilice una pipeta de vidrio borosilicato para transferir la fase orgánica inferior (400 l) a un tubo de centrífuga superior de tornillo de vidrio de alta resistencia de 15 ml con una tapa de polietileno forrada de politetrafluoro. No interrumpa las perlas de vidrio ni la fase acuosa superior durante dicha transferencia. Mantener la fase orgánica inferior bajo el flujo de gas nitrógeno.
3. Durante la preparación de la muestra para LC-MS/MS, es importante eliminar todas las burbujas de aire en los viales de vidrio antes de insertar los viales en una placa de pozo.
4. Para lograr una solubilización completa del formato de amonio y el acetato de amonio en las fases móviles A y B antes de la separación de lípidos por LC, disolver cada sal en 500 ml de agua nanopura antes de mezclar la solución con la fase móvil y sonicar durante 20 min.
5. No almacene la película lipídica formada después de la evaporación del disolvente durante un largo período de tiempo antes de correr. Almacenamos esta película a -80 oC durante no más de una semana antes de disolverla en la mezcla acetonitrilo/2-propanol/agua nanopura (65:35:5) y luego someter los lípidos a LC-MS/MS.
El método LC-MS/MS descrito aquí es una técnica versátil, robusta y sensible para una evaluación cuantitativa de muchas especies de lípidos que comprenden el lipidoma celular de la levadura o cualquier otro organismo eucariota. El método permite la identificación y cuantificación de diferentes especies de lípidos isobáricos o isoméricos, permite utilizar aditivos alternativos de fase móvil para la ESI MS para promover la ionización lipídica y hacer más eficiente la identificación y cuantificación de lípidos, y puede utilizar métodos tanto HCD como CID para la fragmentación o activación de iones lipídicos MS1.
Utilizamos este método LC-MS/MS para estudiar los cambios relacionados con la edad en los lípidos celulares y organelares durante el envejecimiento cronológico de la levadura en ciernes S. cerevisiae. También empleamos este método para investigar cuántas intervenciones genéticas, dietéticas y farmacológicas que retrasan el envejecimiento influyen en la composición lipídica de toda la célula de S. cerevisiae y sus diversos orgánulos. Debido a su versatilidad, robustez y sensibilidad, este método LC-MS/MS se puede utilizar con éxito para la evaluación cuantitativa de los lípidos celulares y organelares en organismos eucariotas en toda la phyla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros actuales y anteriores del laboratorio Titorenko los debates. Reconocemos el Centro de Aplicaciones Biológicas de la Espectrometría de Masas y el Centro de Genómica Estructural y Funcional (ambos en la Universidad de Concordia) por sus servicios sobresalientes. Este estudio fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería (NSERC) de Canadá (RGPIN 2014-04482) y del Fondo de Cátedras de la Universidad de Concordia (CC0113). K.M. fue apoyado por el Premio al Mérito de la Universidad de Concordia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
References
- Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
- Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
- Brügger, B. Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry. Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).
- Zechner, R., et al. FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).
- Eisenberg, T., Büttner, S. Lipids and cell death in yeast. FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).
- Richard, V. R., et al. Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death. Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).
- Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis. Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).
- Mårtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. Effects of lipids on mitochondrial functions. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).
- Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
- Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).
- Goldberg, A. A., et al. A novel function of lipid droplets in regulating longevity. Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).
- Kohlwein, S. D. Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).
- Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. Peroxisome metabolism and cellular aging. Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).
- Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).
- Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down. Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).
- Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast. Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).
- Dimmer, K. S., Rapaport, D. Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).
- Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions. Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).
- Mitrofanova, D., et al. Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).
- Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. Organelle contact zones as sites for lipid transfer. Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).
- Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
- Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
- Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).
- Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
- Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry. Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).
- Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
- Klose, C., Tarasov, K. Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics. Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
- Sud, M., et al. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).
- Pauling, J. K., et al. Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids. PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).
