Summary
サッカロミセス・セレビシエの主要な細胞脂質を同定し定量するために、タンデム質量分析と相まって液体クロマトグラフィーを用いたプロトコルを提示する。酵母細胞内の主要な脂質クラスの定量的評価のための記載された方法は、汎用性、堅牢、および感受性である。
Abstract
脂質は、水に不溶性の構造的に多様な両型分子です。脂質は、生体膜の組織と機能、エネルギー貯蔵および生産、細胞シグナル伝達、タンパク質の静脈輸送、オルガネラ生物新生、および調節された細胞死に不可欠な貢献者です。出芽酵母サッカロミセス・セレビシエは、分子解析を徹底するのに適した単細胞真核生物であるため、モデル生物としての使用は、脂質代謝と細胞内輸送を真核細胞内の複雑な生物学的プロセスに結びつけるメカニズムを明らかにするのに役立った。酵母細胞内の主要な脂質クラスの堅牢で敏感で正確な定量的評価のための汎用性の高い分析方法の利用は、これらのメカニズムに関する深い洞察を得るために重要です。ここでは、S.cerevisiaeの主要な細胞脂質の定量分析のために、タンデム質量分析(LC-MS/MS)と相まって液体クロマトグラフィーを使用するプロトコルを提示する。記載されているLC-MS/MS法は、汎用性が高く、堅牢です。10種類の脂質クラスの中で、多数の種(異なる同種または異性体を含む)の同定と定量が可能です。この方法は感度が高く、0.2 pmol/μLの低濃度で一部の脂質種を同定し、定量することができます。この方法は、酵母細胞全体とその精製された小器官のリピドームの評価にうまく適用されています。この方法でエレクトロスプレーイオン化質量分析のための代替移動相添加剤を使用すると、一部の脂質種のイオン化の効率を高めることができ、したがって、それらの同定および定量を改善するために使用することができます。
Introduction
証拠の体は、生体分子の主要なクラスの一つである脂質が真核細胞内の多くの重要なプロセスで不可欠な役割を果たしていることを示しています。これらのプロセスには、細胞小器官を取り巻く細胞膜および膜を構成する脂質二重層の組み立て、細胞膜を越えた小分子の輸送、細胞外環境および細胞内シグナル伝達の変化への応答、エネルギーの生成と貯蔵、異なるオルガネラに閉じ込められたタンパク質の輸出入、内膜系内のタンパク質の静脈密売、および細胞死の数のモードが含まれる 、2,3,4,5,6,7,8,9,10.
出芽酵母S.cerevisiaeは、単細胞真核生物であり、これらの重要な細胞プロセスにおける脂質の本質的な役割の根底にあるメカニズムの一部を明らかにするために成功しています4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19,20.S.cerevisiaeは、包括的な生化学的、遺伝的、細胞生物学的、化学的生物学的、システム生物学的、および微小流体解剖分析21、22、23、24、25に適しているため、これらのメカニズムを明らかにするための貴重なモデル生物である。脂質代謝と細胞内輸送がこれらの重要な細胞プロセスに寄与するメカニズムの理解のさらなる進歩には、細胞リピトームの定量的特徴付け、リピドーム分子の複雑性の理解、および定量的リピドミクスをシステム生物学1、2、3、26の学際的プラットフォームに統合するための高感度な質量分析技術が必要である。 27、28、29、30。
酵母細胞および他の真核生物の細胞の質量分析支援定量リピドミクスの現在の方法は、十分に汎用性が高くなく、堅牢で、または感受性が高い。また、これらの現在使用されている方法は、種々の同種または異性体脂質種を互いに区別することができない。ここでは、S.cerevisiaeの主要な細胞脂質の定量分析のためのタンデム質量分析(LC-MS/MS)と相まって液体クロマトグラフィーの使用を可能にする汎用性、堅牢、および高感度な方法について説明します。
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Protocol
1. 酵母を培養するための滅菌培地の調製
- 1%(w/v)酵母エキスと2%(w /v)バクトペプトンを含む完全なYP培地の90 mLを調製します。
- 0.67%(w/v)酵母窒素塩基を含む合成最小YNB培地90 mLを調製し、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基、20mg/L-ヒスチジン、30 mg/L L-ロイシン、30mg/L L-リジン、20mg/Lウラシルを調製します。
- 完全なYP培地の90mLを2つの250 mLのエルレンマイヤーフラスコ(すなわち、それぞれ45mL)に均等に割る。
- 合成最小YNB培地の90 mLを2つの250 mLエルレンマイヤーフラスコ(すなわち、各45mL)に分ける。
- 使用前に45分の間に15 psi/121 °CでYPおよびYNB媒体とフラスコをオートクレーブ。
2. 酵母菌株
- 野生型株BY4742(MATαhis3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0)を使用する。
3. ブドウ糖を含む完全なYP培地で酵母を培養する
- オートクレーブは、使用前に45分の15 psi / 121 °Cでグルコースの20%(w/v)ストック溶液をストックします。
- 滅菌20%(w/v)ストック溶液の5 mLを、滅菌YP培地を含む2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに加え、最終的な濃度の2%グルコース(w/v)を行う。
- 微生物ループを使用して、野生型株BY4742の細胞を、グルコースを含む2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに接種する。
- 200rpmで回転揺れをして30°Cで細胞を一晩培養する。
- 酵母文化のアリコートを取る。ヘモサイトメーターを使用して、培養のmL当たりの酵母細胞の総数を決定します。
4. 酵母をグルコースを用いた合成最小YNB培地に移し培養する
- 滅菌YNB培地を含む2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに、無菌20%(w/v)ストック溶液の5mLを2%グルコース(w/v)の最終濃度に加える。
- 無菌ピペットを使用して、合計5.0 x107細胞を含む一晩酵母培養物の体積を、ブドウ糖を含む2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに移入する。
- 200rpmで回転揺れを伴う30°Cで少なくとも24時間(または、実験が必要な場合以上)の細胞を培養する。
5. 脂質抽出用の試薬、実験器具、装置の調製
- 以下を準備する:1)高いグレード(>99.9%)クロロホルム;2) 高等級 (>99.9%)メタノール;3) ナノ純水中の水酸化アンモニウム溶液 28%(v/v)4)ガラスビーズ(酸洗浄、425-600 μM);5)適切なアダプターを備えた渦。6)ポリテトラフルオロエチレン裏地付きキャップ付き15 mL高速ガラス遠心分離管;7) クロロホルムとメタノールの混合物を17:1と2:1;8)クロロホルム/メタノール(2:1)0.1%水酸化アンモニウム(v/v)との混合物。9) ABC溶液 (155 mM 重炭酸アンモニウム, pH = 8.0);10)表1に示すようにクロロホルムとメタノールの2:1混合物で調製された内部脂質基準の混合物;11)細胞脂質の抽出のためのポリテトラフルオロエチレン裏地付きキャップを用いた2mLガラスサンプルバイアル。
6. LC用試薬・ラボウェア・装置の製造
- 以下を準備する:1)アセトニトリル/2-プロパノール/ナノ純水(65:35:5)混合物。2)適切なアダプターを備えた渦。3)超音波超音波処理器。4)ウェルプレート用インサート付きガラスバイアル。5)バイナリポンプ、脱ガッサー、およびオートサンプラーを装備したLCシステム。6)C18逆相カラム(2.1mm;75 mm;細孔サイズ130 Å;pH範囲1-11)を前列システムに結合する。7)混合物A:アセトニトリル/水(60:40);そして8)混合物B:イソプロパノール/アセトニトリル(90:10)。
7. 酵母細胞からの脂質抽出
- 酵母文化のアリコートを取る。ヘモサイトメーターを使用するか、またはOD600を測定して、培養のmL当たりの酵母細胞の総数を決定する。
- 合計 5.0 x 107細胞 (3.3 単位 OD600)を含む酵母培養のボリュームを取ります。この量の培養液をプレチル1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れる。
- 4°Cで1分16,000xgで遠心分離により細胞を収穫する。上清を捨てます。
- 1.5mLの氷冷ナノ純水を加え、4°Cで16,000 x gの遠心分離で細胞を洗浄します。上清を捨てます。
- 1.5 mLの氷冷ABC溶液を加え、4°Cで16,000 x gの遠心分離で細胞を洗浄します。上清を捨てます。細胞ペレットは、脂質抽出の前に-80°Cで保存することができる。
- 脂質抽出を開始するには、氷上の細胞ペレットを解凍します。
- 200 μLの氷冷ナノ純水で細胞ペレットを再懸濁します。セルサスペンションをポリテトラフルオロエチレン裏地付きキャップ付きの15mL高強度ガラススクリュートップ遠心分離管に移します。このチューブに以下を追加: 1) 25 μLクロロホルム/メタノール(2:1)混合物で調製された内部脂質標準の混合物;2) 425-600 μMの酸洗浄ガラスビーズの100 μL;そして3)600 μLのクロロホルム/メタノール(17:1)混合物。
- 室温(RT)で5分間高速でチューブをボルテックスし、細胞を破壊する。
- RTで1時間の低速でチューブをボルテックスし、脂質の抽出を容易にする。
- サンプルを氷上で15分間インキュベートし、タンパク質の沈殿と水相と有機相の互いの分離を促進します。
- 3,000 x gの臨床遠心分離機でチューブを 5 分間 RT で遠心分離します。この遠心分離工程は、すべての脂質クラスを含む下の有機相から上水相を分離することを可能にする。
- ホウケイ酸ガラスピペットを使用して、ポリテトラフルオロエチレン裏地付きキャップを用いて、低い有機相(〜400μL)を別の15mL高強度ガラススクリュートップ遠心分離機チューブに移します。このような移動中にガラスビーズまたは上水相を破壊しないでください。窒素ガスの流れの下で低い有機相を保つ。
- 残りの上部水相にクロロホルムメタノール(2:1)混合物を300μL加え、スフィンゴ脂質およびPA、PS、PI、およびCL.ボルテックスをRTで5分間激しく抽出できるようにします。
- 3,000 x gの臨床遠心分離機でチューブを 5 分間 RT で遠心分離します。
- ホウケイ酸ガラスピペットを使用して、遠心分離後に形成された低い有機相(〜200μL)をステップ7.13で採取した有機相に移します。
- 窒素ガスの流れを利用して、結合した有機相で溶媒を蒸発させます。窒素ガスの流れ下で脂質膜を含むチューブを閉じます。これらのチューブは-80°Cで保管してください。
8. LCによる抽出脂質の分離
- ステップ7.16で得られた脂質膜を含むチューブに、アセトニトリル/2-プロパノール/ナノ純水(65:35:5)混合物を500μL加えます。RTで10 sのためのチューブ3xをボルテックス。
- RTで10 sのための15分の超音波超音波処理にチューブの内容を対象. Vortexチューブ3x。
- チューブからサンプル100μLを取り、ウェルプレートに使用するインサートでガラスバイアルに追加します。ウェルプレートにペーシングする前に、インサートの気泡を除去します。
- LC システムを使用して、逆相 C18 カラム CSH を前段のシステムに結合した異なる脂質種を分離します (材料表を参照)。分離の間、カラムを55°C、流量0.3 mL/minに保ち、サンプルをウェルプレートのRTに保管します。
- 混合物A(アセトニトリル/水[60:40(v/v)])と混合物B(イソプロパノール/アセトニトリル[90:10(v/v)])で構成される移動相を使用します。エレクトロスプレーイオン化(ESI)イオン源を用いて作成された親イオンの検出の正のモードでは、ESI(+)モード、移動相AおよびBは、10mMの最終濃度でアンモニウムの定型を含む。親イオン検出の負のモードでは、ESI(-)モード、移動相AおよびBは、10mMの最終濃度で酢酸アンモニウムを含む。
- ESI(+)モードとESI(-)モードの両方に注入する場合は、10 μLのサンプルボリュームを使用します。
- LCの次の勾配を使用して別々の異なる脂質種: 0-1 分 10% (フェーズ B);1-4分60%(フェーズB);4-10分68%(相B);10-21 97% (フェーズB);21-24分97%(フェーズB);24〜33分10%(相B)。
- 抽出ブランクは、最初のサンプル、4 つのサンプルの間、および最後のサンプルとして実行します。背景を減算してデータを正規化します。
- 野生型株BY4742の細胞から抽出された脂質のLC/MSデータからの代表的な総イオンクロマトグラムを図1に示す。
9. LCによって分離された脂質の質量分析
- LCで分離した脂質を分析するためにHESI(加熱エレクトロスプレーイオン化)イオン源を搭載した質量分析計を使用してください。表 2に示す設定を使用します。
- フーリエ変換アナライザーを使用して、60,000 の解像度で、質量範囲 150 ~ 2,000 Da 内で親イオン (MS1) を検出します。
- 表3に示す設定を使用して、二次イオン(MS2)を検出します。
10. LC-MS/MSの生データ処理による異なる脂質クラスおよび種の同定と定量
- 生の LC-MS/MS ファイルから異なる脂質の識別と定量を実行するソフトウェアの資料表を参照してください。このソフトウェアは、150万個以上の脂質イオン前駆体(MS1)と予測断片イオン(MS2)を含む最大の脂質データベースを使用します。ソフトウェアはまた、脂質の定量のためのMS1ピークと脂質同定のためのMS2を使用しています。同じm/z値を有するが保持時間が異なる2つの異性異性ホスファチジルセリン(34:0)の代表的なクロマトグラムと、MS1およびMS2スペクトルをそれぞれ図2、図3、図4に示す。
- LC-MSの生ファイルを検索するフルスキャンMS1データとデータ依存性MS2データを無料(無菌)脂肪酸(FFA)、カージオリピン(CL)、フィトセラミド(PHC)、フィトスフィンゴシン(PHS)、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジル エタノールアミン(PE)、ホスファチジルグリセロール(PG)、ホスファチジルイノシトール(PI)、ホスファチジルセリン(PS)、トリアシルグリセリン(TAG)の脂質クラスは、前駆体イオンに対して5ppm、製品イオンに対して10ppmのm/z耐性を使用した。その他の検索パラメータを表 4に示します。ソフトウェア・ユーザー・マニュアルに記載されている指示に従ってください。異常な脂肪酸組成を有する内部脂質基準および脂質種の同一性は、手動で検証する必要がある。
- 脂質検索ソフトウェアの自由に利用可能なオープンソースの代替手段の助けを借りて、異なる脂質クラスや種を同定し、定量化するには、脂質データ分析器(http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml)、MZmine2(http://mzmine.github.io/)、またはXCMS(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html)ソフトウェアを使用して、LC-MS/MSからの生データを処理します。
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Representative Results
LC-MS/MSの助けを借りて酵母細胞内の主要な細胞脂質の定量的評価のための私達の方法は多目的で、強い。当初2%のグルコースを含む合成最小YNB培地で培養されたS.セレビシエ細胞の10種類の脂質クラスを同定し、定量化することができました。これらの脂質クラスには、遊離(未エステル化)脂肪酸(FFA)、CL、フィトセラミド(PHC)、フィトスフィンゴシン(PHS)、PC、PE、PG、PI、PS、およびTAG(補足表1)が含まれる。これらの各クラスの多数の分子種を同定し、このLC-MS/MS法を用いて定量化した(補足表1)。
LC-MS/MS法も敏感でした。実際、0.165 pmol/μLの低濃度での脂質の分子種の同定と定量を可能にした(表5のフィトセラミドのデータを参照)。この定量の限界は、広範囲の濃度内の異なる脂質クラスに対して異なる(表5)。
重要なことに、我々の方法は、脂質の異なる同種または異性体形態の同定と定量を可能にした。脂質の同種は、同じ名目質量(すなわち、最も豊富な同位体の質量の和)を有する脂質種であるが、正確な質量31を異なる。異性体の脂質は、同じ分子式を有するが、異なる化学構造を有する脂質種である。例えば、私たちのLC-MS/MS法の使用はPHC(16:0_26:0)と同圧脂質種PC(16:0_10:0)を区別します:彼らは650の同じ名目質量値を持っていますが、正確な質量はそれぞれ650.6457と650.4755です。さらに、このLC-MS法は、同じ分子式が異なる化学構造を有する異性体脂質種の2組を区別する:1)PC(18:0_18:1)とPC(20:0_16:1)、分子式(C44H87N1O8P1)と正確質量(788.6163)。2) PE (16:0_16:0) および PE (14:0_18:0), 分子式 (C37H75N1O8P1) と正確質量 (692.5224).
LC-MS/MS法を用い、全クラスの脂質のイオン化効率を高め、主要な細胞脂質の同定と定量を向上させることができます。このような改善は、ESI MS用の代替移動相添加剤(表6)を用いることで達成できる。これらの代替相には、アンモニウム・ギ酸、ギ酸を含むアンモニウム・ギマ、酢酸アンモニウム、酢酸を含む酢酸アンモニウム、酢酸を含む酢酸アンモニウム、酢酸アンモニウムが挙げられる。これらの代替移動相添加剤のそれぞれは、正常相および逆相LCカラムの両方に使用することができる(表6)。
LC-MS/MS法のもう一つの利点は、MS2製品への脂質の前駆体イオン(MS1)の断片化に2つの異なる方法を使用できることです。これら2つの方法は、高エネルギー衝突解離(HCD)および衝突誘発解離(CID)32である。このCID法は、ESI(-)モードのESI(-)モード用の酢酸アンモニウム移動相添加剤と組み合わせて使用すると有益であることがわかりました。対照的に、HCD法は、MSのESI(+)モード用のアンモニウム・フォーマット・移動相添加剤と組み合わせて使用すれば好ましいが、これらの条件下でMS1脂質イオン断片化の効率を向上させ、PC、PHSおよびTAG用MS2製品に対して(表8)。
図1:野生型株BY4742の細胞から抽出した脂質の液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)データからのイオンクロマトグラム(TIC)の合計。逆相カラムCSH C18上でLCによって分離され、負のエレクトロスプレーイオン化モードを用いて作成された親イオンのMSによって検出された脂質のティック。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:同じm/z値(M-H)が762.5294のが、7.65分と8.49分の異なる保持時間を有する2つの異性ホスファチジルセリン(34:0)のクロマトグラム。脂質を野生型株BY4742の細胞から抽出し、逆相カラムCSH C18上の液体クロマトグラフィーにより分離した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:762.5294の同じm/z値(M-H)を有するが、7.65分および8.49分の異なる保持時間を有する2つの異性ホスファチジルセリン種(34:0)のMS1スペクトル。脂質を野生型株BY4742の細胞から抽出し、逆相カラムCSH C18上の液体クロマトグラフィー(図2参照)で分離し、負の電気スプレーイオン化モードを用いて作製した親(MS1)イオンの質量分析によって検出した。(A) m/z 値 (M-H) 762.5294、保持時間 7.65 分のホスファチジルセリン (34:0) の MS1 スペクトル。 (B) m/z 値 (M-H) 762.5294 および保持時間 8.49 分のホスファチジルセリンの MS1 スペクトル (34:0)この図の大きいバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:762.5294の同じm/z値(M-H)を有するが、7.65分および8.49分の異なる保持時間を有する2つの異性ホスファチジルセリン種(34:0)のMS2スペクトル。脂質を野生型株BY4742の細胞から抽出し、逆相カラムCSH C18上で液体クロマトグラフィーで分離し(図2に示すように)、MS1イオンの質量分析法で検出した(図3参照)。次いで、二次イオン(MS2)を質量分析法で検出した。(A) m/z 値 (M-H) 762.5294、保持時間 7.65 分のホスファチジルセリン (34:0) の MS2 スペクトル。セリン部分の損失は、675.6149のm/ z値(M-H)のイオンを生成しました。(B) m/z 値 (M-H) 762.5294、保持時間 8.49 分のホスファチジルセリン (34:0) の MS2 スペクトル。セリン部分の損失は、675.8843のm/ z値(M-H)のイオンを生成しました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 検出モード | 脂質クラス | 疎水性テール組成物 | 計算された m/z 値 | 濃度(pmoles/μl) |
| 負 | セラミド | 18:1_17:0 | 550.5204675 | 226 |
| 負 | カーディオリピン | 14:0_14:0_14:0_14:0 | 1239.839755 | 196 |
| 負 | 遊離脂肪酸 | 19:0 | 297.2799035 | 837 |
| 負 | ホスファチジルエタノールアミン | 15:0_15:0 | 662.4766305 | 377 |
| 負 | ホスファチジルグリセロール | 15:0_15:0 | 693.4712115 | 349 |
| 負 | ホスファチジルイノシトール | 17:0_20:4 | 871.5342065 | 3 |
| 負 | ホスファチジルセリン | 17:0_17:0 | 762.5290605 | 318 |
| 正 | ホスファチジルコリン | 13:0_13:0 | 650.4755335 | 385 |
| 正 | フィトスフィンゴシン | 16:1 | 272.2584055 | 225 |
| 正 | トリアシルグリセロール | 28:1_10:1_10:1 | 818.7232155 | 367 |
表1:内部脂質標準の混合物の組成。内部脂質基準は、クロロホルム/メタノール(2:1)混合物で調製した。検出モードとは、エレクトロスプレーイオン化(ESI)イオン源を搭載したオービトラップベロス質量分析計を使用した親イオン検出の正または負のモードを指します。計算されたm/z値は、脂質の付加物に対する値です。
| FTMS + p 解像度 | 60000 |
| 質量範囲(ダルトン) | 150-2000 |
| イオン ソースの種類 | ヘシ |
| キャピラリー温度(°C) | 300 |
| ソースヒーター温度(°C) | 300 |
| シースガスの流れ | 10 |
| 補助ガスの流れ | 5 |
| 正極電圧(kV) | 3 |
| 負極電圧(kV) | 3 |
| ソース電流(μA) | 100 |
表2:LCによって分離された脂質を分析するために使用されるオービトラップベロス質量分析計の設定。略語: FTMS + p = ESI(+)モードでのフーリエ変換ベースの質量分析。HESI = 加熱エレクトロスプレーイオン化。
| 計器の極性 | 正 | 負 |
| アクティベーションタイプ | 高エネルギーによる衝突解離 | 衝突による解離 |
| 必要最小限の信号 | 5000 | 5000 |
| 分離幅 | 2 | 2 |
| 正規化された衝突エネルギー | 55 | 35 |
| 既定の充電状態 | 2 | 2 |
| ライセンス認証時間 | 0.1 | 10 |
| FTMS + C 解像度 | 7500 | |
| ms/ms に最も強烈なピークが 5 つ選択されました |
表3:二次イオン(MS2)を検出するために使用されるオービトラップベロス質量分析計の設定。略称: FTMS + C = ESI(+)モードにおけるフーリエ変換ベースの質量分析。
| 識別 | |
| データベース | オービラップ |
| ピーク検出 | 同位体(ON)をリコールする |
| 検索オプション | 製品検索オービット |
| 検索の種類 | 製品 |
| 実験タイプ | LC-MS |
| 前駆体許容値 | 10 ppm |
| 製品許容範囲 | 高エネルギーによる衝突-解離[ESI(+)モード]:20 ppm |
| 衝突誘発解離[ESI(-)モード]:0.5ダルトン | |
| 定量 | |
| 定量の実行 | に |
| m/z 許容誤差 | -5.0;+5.0 |
| 公差タイプ | Ppm |
| フィルター | |
| 上位ランク フィルタ | に |
| メイン ノード フィルタ | 主異性体のピーク |
| M スコアしきい値 | 5 |
| c スコアしきい値 | 2 |
| FFA の優先順位 | に |
| ID 品質フィルター | A: 脂質クラス&すべての脂肪酸が完全に同定される |
| B:脂質クラスと脂肪酸の一部が同定される | |
| C:脂質クラスまたはFAが同定される | |
| D:他のフラグメントイオン(H2Oなど)によって同定された脂質 | |
| 脂質クラス | |
| 高エネルギーによる衝突解離[ESI(+)モード] | PC,タグ |
| 衝突誘発解離[ESI(-)モード] | CER, CL, FFA, PE, PG, PI, PS |
| イオン | |
| 高エネルギーによる衝突解離[ESI(+)モード] | + H;+ NH4;+ ナ |
| 衝突誘発解離[ESI(-)モード] | - H;- 2H;- HCOO |
表4:脂質同定ソフトウェア「脂質検索」(V4.1)の助けを借りて、異なる脂質クラスおよび種を同定するために使用される検索パラメータ。略語: CER = セラミド;CL = カーディオリピン;FFA = フリー(無気味)脂肪酸;PC = ホスファチジルコリン;PE = ホスファチジルエタノールアミン;PG =ホスファチジルグリセロール;PI = ホスファチジルイノシトール;PS = ホスファチジルセリン;TAG = トリアシルグリセロール。
表5:LC-MS/MS法の助けを借りて同定し、定量することができる異なる脂質クラスの分子種の最も低い濃度。各脂質クラスの定量可能な最低濃度の推定値は、その内部標準のMSピーク領域(これらのMSピーク領域と脂質標準濃度は太字で表示される)と、その代表的な分子形態が最も低い検出可能な濃度で存在することに基づいています。データは、3つの技術的複製が実行された2つの独立した実験の平均値として提示される。こちらの表を表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。
| 脂質標準 | ESI モード | Amf | アムフ/FA | Amac | アマク/AA | アマク/FA |
| Phc | - | 74 | 75.2 | 85.8 | 77 | 74.8 |
| Cl | - | 72.9 | 75.1 | 78.3 | 68.4 | 74 |
| 遊離 | - | 77.1 | 77.2 | 75.5 | 84 | 72.9 |
| Pe | - | 98 | 96 | 95 | 91.5 | 86 |
| Pg | - | 64 | 45.1 | 75.9 | 60.5 | 55 |
| Pi | - | 79.3 | 76 | 82.5 | 80.3 | 77 |
| Ps | - | 73.7 | 61.6 | 85.8 | 81.4 | 73.7 |
| Pc | + | 93.5 | 86.9 | 69.3 | 60.5 | 62.7 |
| Phs | + | 89.1 | 79.2 | 78.1 | 73.7 | 69.3 |
| タグ | + | 92.4 | 88 | 86.9 | 80.3 | 84.7 |
表6:ESI MSの代替移動相添加剤が異なるクラスの脂質に対するイオン化の効率に及ぼす影響。逆相液体クロマトグラフィーにより異なる脂質が互いに分離された。脂質の異なるクラスに属する市販の脂質標準は、表1に名前が付けられています。異なる移動相添加物の存在下で、イオン化のESI(-)またはESI(+)モードがMSに使用されました。各脂質標準のイオン化の割合は、3つの技術的複製からの平均値として示される。脂質ごとに、イオン化率はMSピーク面積に基づいて算出した。各脂質のイオン化効率が最も高い値を太字で表示します。略語: AmF = アンモニウム・フォーマット;AmF/FA = アンモニウムのギマチとギ酸;アマツ=酢酸アンモニウム;アマチック/AA =酢酸アンモニウム;アマク/FA =酢酸アンモニウムとギ酸;CL = カーディオリピン;FFA = フリー(無気味)脂肪酸;PC = ホスファチジルコリン;PE = ホスファチジルエタノールアミン;PG =ホスファチジルグリセロール;PHC = フィトセラミド;PHS = フィトスフィンゴシン;PI = ホスファチジルイノシトール;PS = ホスファチジルセリン;TAG = トリアシルグリセロール。
| 脂質標準 | ESI モード | Amf | Amac |
| Phc | - | 75 | 83.8 |
| Cl | - | 70.9 | 79.3 |
| 遊離 | - | 76.1 | 74.5 |
| Pe | - | 98 | 95 |
| Pg | - | 64 | 75.9 |
| Pi | - | 79.3 | 82.5 |
| Ps | - | 71.5 | 84.8 |
| Pc | + | 52.3 | 60.5 |
| Phs | + | 78.4 | 75.2 |
| タグ | + | 65.7 | 69.7 |
表7:衝突誘発解離(CID)法が前駆体イオン(MS1)断片化の効率に及ぼす影響。脂質の異なるクラスに属する市販の脂質標準は、表1に名前が付けられています。イオン化のESI(-)またはESI(+)モードは、アンモニウム・フォーマット(AmF)または酢酸アンモニウム(AmAc)移動相添加剤の存在下で、MSに使用された。MS2製品に断片化したMS1脂質イオンの割合は、3つの技術的複製からの平均値として示されています。脂質ごとに、イオン化率はMS2ピーク面積に基づいて算出した。断片化したMS1脂質イオンの最高割合の値は、各脂質について太字で表示される(表8に示したデータと比較)。MS2製品イオン形成の効率が最も高い場合、この値は最高です。略語: CL = カーディオリピン;FFA = フリー(無気味)脂肪酸;PC = ホスファチジルコリン;PE = ホスファチジルエタノールアミン;PG =ホスファチジルグリセロール;PHC = フィトセラミド;PHS = フィトスフィンゴシン;PI = ホスファチジルイノシトール;PS = ホスファチジルセリン;TAG = トリアシルグリセロール。
| 脂質標準 | ESI モード | Amf | Amac |
| Phc | - | 68.4 | 65.4 |
| Cl | - | 74.3 | 75.2 |
| 遊離 | - | 84.2 | 81.2 |
| Pe | - | 85.1 | 73.1 |
| Pg | - | 68.4 | 67.1 |
| Pi | - | 58.7 | 55.8 |
| Ps | - | 67.4 | 68.5 |
| Pc | + | 92.5 | 65.3 |
| Phs | + | 87.1 | 75.1 |
| タグ | + | 91.4 | 84.9 |
表8:前駆体イオン(MS1)断片化の効率に対する高エネルギー衝突解離(HCD)法の効果。脂質の異なるクラスに属する市販の脂質標準は、表1に名前が付けられています。イオン化のESI(-)またはESI(+)モードは、アンモニウム・フォーマット(AmF)または酢酸アンモニウム(AmAc)移動相添加剤の存在下で、MSに使用された。MS2製品に断片化したMS1脂質イオンの割合は、3つの技術的複製からの平均値として示されています。脂質ごとに、イオン化率はMS2ピーク面積に基づいて算出した。断片化したMS1脂質イオンの最高割合の値は、各脂質について太字で表示される(表7に示したデータと比較)。MS2製品イオン形成の効率が最も高い場合、この値は最高です。その他の略語: CL = カーディオリピン;FFA = フリー(無気味)脂肪酸;PC = ホスファチジルコリン;PE = ホスファチジルエタノールアミン;PG =ホスファチジルグリセロール;PHC = フィトセラミド;PHS = フィトスフィンゴシン;PI = ホスファチジルイノシトール;PS = ホスファチジルセリン;TAG = トリアシルグリセロール。
補足表1:LC-MS/MS法の助けを借りて、S.セレビシエ細胞で同定され、定量化された10種類の脂質クラスの分子種のリスト。これらの脂質クラスには、フリー(無エステル化)脂肪酸(FFA)、カーディオリピン(CL)、フィトセラミド(PHC)、フィトスフィンゴシン(PHS)、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルグリセロール(PG)、ホスファチジルジリゾール(PI)、ホスファチジルジロール(PI)、ホスファチジルジリセル酸(PI)、ホスファチジルジリテルスロール(PI)、トリアチジル(ポリアグリセリン)、トリアチジルグリセリン(PI)、ホスファチジルイノシトール(PI)、ホスファチジルジリセル酸(PI)、トリアチジル酸(タグルグリセリン)、トリアチジル酸(ポリアグリセリン)が含まれていた。S.セレビシエ細胞は、最初に2%グルコースを含有する合成最小YNB培地で培養した。抽出脂質の抽出およびLC-MS/MS分析のための酵母細胞のアリコートは、培養の1日目、2日目、3日目、4日目、6日、8日、および10日目に回収された。異なる培養日に回収した酵母細胞で同定された各脂質クラスの全ての脂質種が示されている。これらの脂質種のいくつかは、培養の1〜4日目に回収された年代順に若い酵母細胞にのみ存在し、他のものは培養の6〜10日目に回収された年代順に古い酵母細胞にのみ存在し、一部は年代的に若年および古い酵母細胞の両方に存在していた。培養の特定の日に同定された各脂質クラスの各脂質種ごとに最高のMSピーク面積が示されている。この脂質クラス内の他の種の定量に使用された異なる脂質クラスの脂質基準は、赤色で表示される。計算されたm/z値は、脂質の付加物に対する値です。略語: ESI (-) = MS の ESI (-) モードESI(+)=MSのESI(+)モードは、3つの技術的複製が実行された2つの独立した実験の平均値として提示されます。こちらの表を表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。
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Discussion
ここで説明するプロトコルの実装を成功させるためには、次の注意事項が重要です。
1. クロロホルムとメタノールは有毒です。それらは実験室のプラスチック製品およびあなたの皮を含む表面から、さまざまな物質を効率よく抽出する。したがって、これらの有機溶媒は、クロロホルムおよび/またはメタノールとの接触を伴うステップでプラスチックの使用を避け、これらのステップにホウケイ酸ガラスピペットを使用し、使用前にクロロホルムとメタノールでこれらのピペットをすすぐすることによって注意してこれらの有機溶媒を処理します。
2. メタノール/クロロホルム(17:1)混合物による脂質抽出の際、ホウケイ酸ガラスピペットを使用して、ポリテトラフルオロエチレン裏地付きキャップを用いて、低有機相(〜400μL)を15mL高強度ガラススクリュートップ遠心分離管に移します。このような移動中にガラスビーズまたは上水相を破壊しないでください。窒素ガスの流れの下で低い有機相を保つ。
3. LC-MS/MSのサンプル調製時には、バイアルをウェルプレートに挿入する前に、ガラスバイアル内のすべての気泡を除去することが重要です。
4. LCによる脂質分離前の移動相AおよびBにおけるアンモニウム・アセ酸アンモニウムと酢酸アンモニウムの完全な可溶化を達成するために、各塩を500μLのナノ純水で溶解してから、液を移動相と混合し、20分間超音波処理する。
5. 溶媒蒸発後に形成された脂質膜を、実行前に長期間保存しないでください。このフィルムは、アセトニトリル/2-プロパノール/ナノ純水(65:35:5)混合物に溶解し、脂質をLC-MS/MSに施す前に、1週間以内に-80°Cで保存します。
ここで説明するLC-MS/MS法は、酵母または他の真核生物の細胞リピドームを含む多くの脂質種の定量的評価のための汎用性、堅牢、かつ高感度な技術です。この方法は、異なるアイソバリックまたは異性体脂質種の同定と定量を可能にし、ESI MSの代替移動相添加剤を使用して脂質イオン化を促進し、脂質同定と定量をより効率的にし、MS1脂質イオンの断片化または活性化のためにHCDおよびCIDの両方の方法を使用することができる。
このLC-MS/MS法を用いて、出芽酵母S.セレビシエの年代順エージング中の細胞およびオルガネラリピドムの加齢変化を研究する。また、この方法を用いて、老化遅延の遺伝的、食事的、および薬理学的介入が、S.セレビシエ細胞全体およびその様々なオルガネラの脂質組成に影響を与える影響を調べる。その多様性、強さおよび感受性のために、このLC-MS/MS法は、フィラ全体の真核生物における細胞および細胞性脂肪性の定量的評価にうまく使用することができる。
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Disclosures
著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。
Acknowledgments
ティトレンコ研究所の現在および元メンバーに話し合いに感謝しています。我々は、質量分析の生物学的応用センター及び構造機能ゲノミクスセンター(両方ともコンコルディア大学)が優れたサービスを提供する。この研究は、カナダの自然科学工学研究評議会(RGPIN 2014-04482)とコンコルディア大学議長基金(CC0113)からの助成金によって支えられました。K.M.はコンコルディア大学功労賞の支援を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
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