Summary
Vi presentiamo un protocollo che utilizza la cromatografia liquida accoppiata con la spettrometria di massa tandem per identificare e quantificare i principali lipidi cellulari in Saccharomyces cerevisiae. Il metodo descritto per una valutazione quantitativa delle principali classi lipidiche all'interno di una cellula di lievito è versatile, robusto e sensibile.
Abstract
I lipidi sono molecole anfipatiche strutturalmente diverse che sono insolubili in acqua. I lipidi sono contributori essenziali all'organizzazione e alla funzione delle membrane biologiche, dello stoccaggio e della produzione di energia, della segnalazione cellulare, del trasporto vescicolare delle proteine, della biogenesi dell'orgelli e della morte cellulare regolata. Poiché il lievito in erba Saccharomyces cerevisiae è un euaryote unicellulare che consente di analizzare molecolari approfondite, il suo uso come organismo modello ha contribuito a scoprire meccanismi che collegano il metabolismo dei lipidi e il trasporto intracellulare a complessi processi biologici all'interno di cellule eucariotiche. La disponibilità di un metodo analitico versatile per una valutazione quantitativa robusta, sensibile e accurata delle principali classi di lipidi all'interno di una cellula di lievito è fondamentale per ottenere informazioni approfondite su questi meccanismi. Qui presentiamo un protocollo per utilizzare la cromatografia liquida accoppiata con la spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per l'analisi quantitativa dei principali lipidi cellulari di S. cerevisiae. Il metodo LC-MS/MS descritto è versatile e robusto. Consente l'identificazione e la quantificazione di numerose specie (comprese diverse forme isobariche o isomeriche) all'interno di ciascuna delle classi di 10 lipidi. Questo metodo è sensibile e consente l'identificazione e la quantificazione di alcune specie di lipidi a concentrazioni a partire da 0,2 pmol/L. Il metodo è stato applicato con successo alla valutazione dei lipidomi delle cellule intere del lievito e dei loro organelli purificati. L'uso di additivi alternativi di fase mobile per la spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray in questo metodo può aumentare l'efficienza della ionizzazione per alcune specie lipidiche e può quindi essere utilizzato per migliorarne l'identificazione e la quantitazione.
Introduction
Un insieme di prove indica che i lipidi, una delle principali classi di biomolecole, svolgono un ruolo essenziale in molti processi vitali all'interno di una cellula eucarome. Questi processi includono l'assemblaggio di bistrati lipidici che costituiscono la membrana plasmatica e le membrane che circondano gli organelli cellulari, il trasporto di piccole molecole attraverso le membrane cellulari, la risposta ai cambiamenti nell'ambiente extracellulare e la trasduzione del segnale intracellulare, la generazione e lo stoccaggio dell'energia, l'importazione e l'esportazione di proteine confinate a diversi organelli, il traffico vescicolare di proteine all'interno del sistema endomembrana e della segreteria delle proteine, e diversi modi regolati di morte cellulare1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Il lievito in erba S. cerevisiae, un organismo eucariotico unicellulare, è stato utilizzato con successo per scoprire alcuni dei meccanismi alla base dei ruoli essenziali dei lipidi in questi processi cellulari vitali4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae è un organismo modello prezioso per scoprire questi meccanismi perché è suscettibile di biochimica completa, genetica, cellula biologica, biologica chimica, sistema biologica, e microfluidica dissezione analisi21,22,23,24,25. Ulteriori progressi nella comprensione dei meccanismi attraverso i quali il metabolismo lipidico e il trasporto intracellulare contribuiscono a questi processi cellulari vitali richiedono tecnologie sensibili di spettrometria di massa per la caratterizzazione quantitativa del lipidome cellulare, la comprensione della complessità molecolare lipidoma e l'integrazione della lipidomica quantitativa in una piattaforma multidisciplinare della biologia dei sistemi1,2,3,26, 27,28,29,30.
Gli attuali metodi per la lipidomica quantitativa assistita dalla spettrometria di massa delle cellule di lievito e delle cellule di altri organismi eucarioti non sono sufficientemente versatili, robusti o sensibili. Inoltre, questi metodi attualmente utilizzati non sono in grado di distinguere varie specie di lipidi isobarici o isomeriche l'una dall'altra. Qui descriviamo un metodo versatile, robusto e sensibile che permette l'uso di cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per l'analisi quantitativa dei principali lipidi cellulari di S. cerevisiae.
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Protocol
1. Preparazione di supporti sterili per la coltura del lievito
- Preparare 90 mL di un mezzo YP completo che contiene 1% (w/v) di estratto di lievito e 2% (w/v) bactopeptone.
- Preparare 90 mL di un mezzo YNB minimo sintetico contenente 0,67% (w/v) base di azoto di lievito senza aminoacidi, 20 mg/L L-histidina, 30 mg/L -leucina, 30 mg/L L-lisina, e 20 mg/L uracile.
- Dividere 90 mL del mezzo YP completo equamente in due flaconi Erlenmeyer da 250 mL (cioè 45 mL ciascuno).
- Dividere 90 mL del mezzo yNB minimo sintetico in due flaconi Erlenmeyer da 250 mL (cioè 45 mL ciascuno).
- Autoclave i flaastri con supporti YP e YNB a 15 psi/121 s per 45 min prima dell'uso.
2. Ceppo di lievito
- Utilizzare il ceppo di tipo selvaggio BY4742(MAT- 1 leu2 - 0 lys2 - 0 ura30).
3. Lievito di coltura nel mezzo YP completo con glucosio
- Autoclave una soluzione di riserva del 20% (w/v) di glucosio a 15 psi/121 C per 45 min prima dell'uso.
- Aggiungere 5 mL della soluzione sterile 20% (w/v) di glucosio a ciascuno dei due flaconi Erlenmeyer contenenti il mezzo YP sterile per una concentrazione finale di 2% glucosio (w/v).
- Utilizzare un ciclo microbiologico per inoculare le cellule del ceppo di tipo selvaggio BY4742 in ciascuno dei due flaconi Erlenmeyer contenenti il mezzo YP con glucosio.
- Coltura le cellule durante la notte a 30 s con agitazione rotazionale a 200 rpm.
- Prendete una aliquota di cultura del lievito. Utilizzare un emocitometro per determinare il numero totale di cellule di lievito per mL di coltura.
4. Trasferire il lievito e coltivarli nel mezzo YNB minimale sintetico con glucosio
- Aggiungere 5 mL della soluzione sterile 20% (w/v) di glucosio a ciascuno dei due flaconi Erlenmeyer contenenti il mezzo YNB sterile ad una concentrazione finale del 2% di glucosio (w/v).
- Utilizzare una pipetta sterile per trasferire un volume della coltura di lievito overnight che contiene il numero totale di 5,0 x 107 cellule in ciascuno dei due flaconi Erlenmeyer contenenti il mezzo YNB con glucosio.
- Coltura le cellule per almeno 24 h (o più, se l'esperimento richiede) a 30 gradi centigradi con scosse rotazionali a 200 giri/min.
5. Preparazione di reagenti, labware e attrezzature per l'estrazione dei lipidi
- Preparare quanto segue: 1) di alto livello (>99,9%) cloroformio; 2) grado elevato (>99,9%) metanolo; 3) 28% (v/v) soluzione di idrossido di ammonio in acqua nano-pura; 4) perline di vetro (lavate con acido, 425-600 M); 5) un vortice con adattatore appropriato; 6) tubi di centrifuga di vetro ad alta velocità da 15 mL con tappi rivestiti in politetrafluoroetilene; 7) 17:1 e 2:1 miscele di cloroformio e metanolo; 8) una miscela di cloroformio/metanolo (2:1) con 0,1% di idrossido di ammonio (v/v); 9) Soluzione ABC (155 mM di bicarbonato di ammonio, pH - 8,0); 10) una miscela di norme interne in materia di lipidi preparate in una miscela 2:1 di cloroformio e metanolo, come indicato nella tabella 1; e 11) 2 mL di campioni di vetro con tappi foderati in politetrafluoretilene per l'estrazione dei lipidi cellulari.
6. Preparazione di reagenti, labware e attrezzature per LC
- Preparare la seguente miscela: 1) acetonitrile/2-propanol/nano-pure water (65:35:5); 2) un vortice con adattatore appropriato; 3) un sonicatore ad ultrasuoni; 4) fiale di vetro con inserti per un pozzo; 5) un sistema LC dotato di una pompa binaria, degasser e un autocampionatore; 6) una colonna C18 in fase inversa (2,1 mm; 75 mm; dimensione dei pori 130 e gamma di pH di 1-11) accoppiato a un sistema pre-colonna; 7) miscela A: acetonitrile/acqua (60:40); e 8) miscela B: isopropanolo/acetonitrile (90:10).
7. Estrazione di lipidi dalle cellule di lievito
- Prendete una aliquota di cultura del lievito. Utilizzare un emocitometro o misurare OD600 per determinare il numero totale di cellule di lievito per mL di coltura.
- Prendere un volume di coltura lievito che contiene un numero totale di 5,0 x 107 celle (3,3 unità OD600). Collocare questo volume di coltura in un tubo di microcentrifuga prechilled da 1,5 mL.
- Raccogliere le cellule con centrifugazione a 16.000 x g per 1 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato.
- Aggiungere 1,5 mL di acqua nanopura ghiacciata e lavare le cellule con centrifugazione a 16.000 x g per 1 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato.
- Aggiungere 1,5 mL di soluzione ABC ghiacciata e lavare le cellule con centrifugazione a 16.000 x g per 1 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato. Il pellet cellulare può essere conservato a -80 gradi centigradi prima dell'estrazione dei lipidi.
- Per iniziare l'estrazione dei lipidi, scongelare il pellet cellulare sul ghiaccio.
- Risospendere il pellet cellulare in 200 o più acqua nano-pura ghiacciata. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifugatura superiore a vite in vetro ad alta resistenza da 15 mL con un cappuccio foderato in politetrafluoroetilene. Aggiungere quanto segue a questo tubo: 1) 25 - L della miscela di standard lipidici interni preparati in cloroformio/metanolo (2:1) miscela; 2) 100 L l di 425-600 M di perline di vetro lavate con acido; e 3) 600 l di cloroformio/metanolo (17:1).
- Vorticare il tubo ad alta velocità per 5 min a temperatura ambiente (RT) per disturbare le cellule.
- Vorticare il tubo a bassa velocità per 1 h a RT per facilitare l'estrazione di lipidi.
- Incubare il campione per 15 min sul ghiaccio per promuovere la precipitazione proteica e la separazione delle fasi acquose e organiche l'una dall'altra.
- Centrifugare il tubo in una centrifuga clinica a 3.000 x g per 5 min a RT. Questa fase di centrifugazione permette di separare la fase acquosa superiore dalla fase organica inferiore, che contiene tutte le classi lipidiche.
- Utilizzare una pipetta di vetro borosilicato per trasferire la fase organica inferiore (400 dollari l) ad un altro tubo di centrifuga superiore a vite in vetro ad alta resistenza da 15 mL con un cappuccio foderato in politetrafluoroetilene. Non interrompere le perline di vetro o la fase acquosa superiore durante tale trasferimento. Mantenere la fase organica inferiore sotto il flusso di gas di azoto.
- Aggiungere 300 l of cloroformina-metanolo (2:1) miscela alla fase acquosa superiore rimanente per consentire l'estrazione di sphingolipids e PA, PS, PI e CL. Vorticare vigorosamente il tubo per 5 min a RT.
- Centrifugare il tubo in una centrifuga clinica a 3.000 x g per 5 min a RT.
- Utilizzare una pipetta di vetro borosilicato per trasferire la fase organica inferiore (200 gradi centigradi) formata dopo la centrifugazione nella fase organica raccolta al punto 7.13.
- Utilizzare il flusso di gas di azoto per far evaporare il solvente nelle fasi organiche combinate. Chiudere i tubi contenenti la pellicola lipidica sotto il flusso di gas di azoto. Conservare questi tubi a -80 gradi centigradi.
8. Separazione dei lipidi estratti da LC
- Aggiungere 500 l di miscela di acetonitrile/2-propanol/nano-pura (65:35:5) a un tubo contenente la pellicola lipidica ottenuta al punto 7.16. Vortice il tubo 3x per 10 s a RT.
- Sottoporre il contenuto del tubo alla sonicazione ad ultrasuoni per 15 min. Vortex il tubo 3x per 10 s a RT.
- Prendere 100 l di un campione dal tubo e aggiungerlo a una fiala di vetro con un inserto utilizzato per un pozzo. Eliminare le bolle d'aria nell'inserto prima di scorrendo nella piastra.
- Utilizzare un sistema LC per separare diverse specie di lipidi su una colonna C18 in fase inversa CSH accoppiato a un sistema pre-colonna (vedere Tabella dei materiali). Durante la separazione, mantenere la colonna a 55 gradi centigradi e ad una portata di 0,3 mL/min.
- Utilizzare le fasi mobili costituite dalla miscela A (acetonitrile/acqua [60:40 (v/v)]) e dalla miscela B (isopropanolo/acetonitrile [90:10 (v/v)]). Per una modalità positiva di rilevamento degli ioni genitori creata utilizzando la sorgente iossioni a ionizzazione elettrospray (ESI), la modalità ESI, le fasi mobili A e B contengono il formato di ammonio alla concentrazione finale di 10 mM. Per una modalità negativa di rilevamento degli ioni dei genitori, la modalità ESI (-), le fasi mobili A e B contengono acetato di ammonio alla concentrazione finale di 10 mM.
- Per l'iniezione, utilizzare un volume campione di 10 -L per l'iniezione sia in modalità ESI che in modalità ESI (-).
- Separare diverse specie lipidiche da LC utilizzando il seguente gradiente LC: 0-1 min 10% (fase B); 1-4 min 60% (fase B); 4-10 min 68% (fase B); 10-21 97% (fase B); 21-24 min 97% (fase B); 24-33 min 10% (fase B).
- Eseguire gli spazi vuoti di estrazione come primo campione, tra ogni quattro campioni e come ultimo campione. Sottrarre lo sfondo per normalizzare i dati.
- Un cromatogramma iografico totale rappresentativo dai dati LC/MS dei lipidi estratti dalle cellule del ceppo di tipo selvaggio BY4742 è mostrato nella Figura 1.
9. Analisi spettrometrica di massa dei lipidi separati da LC
- Utilizzare uno spettrometro di massa dotato di una fonte di ioni HESI (ionizzazione elettrospray riscaldata) per analizzare i lipidi separati da LC. Utilizzare le impostazioni fornite nella tabella 2.
- Utilizzare l'analizzatore di trasformazioni Fourier per rilevare gli ioni padre (MS1) con una risoluzione di 60.000 e all'interno dell'intervallo di massa di 150-2.000 Da.
- Utilizzare le impostazioni fornite nella tabella 3 per rilevare gli ioni secondari (MS2).
10. Identificazione e quantificazione di diverse classi e specie lipidiche mediante l'elaborazione di dati grezzi da LC-MS/MS
- Consultare la Tabella dei materiali per il software per eseguire l'identificazione e la quantificazione di diversi lipidi da file LC-MS/MS grezzi. Questo software utilizza il più grande database lipidico, contenente più di 1,5 milioni di precursori di ioni lipidi (MS1) e i loro ioni di frammento previsti (MS2). Il software utilizza anche picchi MS1 per la quantitazione lipidica e MS2 per l'identificazione dei lipidi. Un cromatogramma rappresentativo di due forme di fosfatidilserina isomeriche (34:0) che hanno lo stesso valore m/z ma tempi di conservazione diversi, nonché i relativi spettri MS1 e MS2, sono mostrati rispettivamente nella Figura 2, Figura 3e Figura 4.
- Cerca nei file non elaborati LC-MS contenenti dati MS1 full-scan e dati MS2 dipendenti dai dati per acidi grassi (FFA) gratuiti (non esterificati), cardiolipina (CL), fitoceramide (PHC), fitosphingosina (PHS), fosfatidylcholine (PC), fosfatidylelethano lamina mina (PE), il fosofilylglycerolo (PG), il fosofatidiylinositolo (PI), la fossphatidylserine (PS) e le classi di lipidi triacylglycerolo (TAG) utilizzando una tolleranza m/z di 5 ppm per gli ioni precursori e 10 ppm per gli ioni di prodotto. Altri parametri di ricerca sono riportati nella tabella 4. Seguire le istruzioni fornite nel manuale dell'utente del software. Le identità degli standard lipidici interni e delle specie lipidiche con composizione insolita di acidi grassi devono essere verificate manualmente.
- Per identificare e quantificare diverse classi e specie di lipidi con l'aiuto di alternative open source liberamente disponibili per il software Lipid Search, utilizzare il software Lipid Data Analyzer (http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml), M'mine 2 (http://mzmine.github.io/) o XCMS (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html) per elaborare dati non elaborati da LC-MS/MS.
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Representative Results
Il nostro metodo per una valutazione quantitativa dei principali lipidi cellulari all'interno di una cellula di lievito con l'aiuto di LC-MS/MS era versatile e robusto. Ci ha permesso di identificare e quantificare 10 diverse classi di lipidi nelle cellule S. cerevisiae coltivate nel mezzo YNB minimo sintetico inizialmente contenente il 2% di glucosio. Queste classi lipidiche includono acidi grassi liberi (non esterificati) (FFA), CL, fitoceramide (PHC), fitosphingosine (PHS), PC, PE, PG, PI, PS e TAG (tabella supplementare 1). Sono state identificate e quantificate numerose specie molecolari di ciascuna di queste classi utilizzando questo metodo LC-MS/MS (Tabella supplementare 1).
Anche il nostro metodo LC-MS/MS era sensibile. Infatti, ha permesso l'identificazione e la quantificazione di specie molecolari di lipidi a concentrazioni a partire da 0,165 pmol/ . Questo limite di quantificazione differisce per diverse classi lipidiche all'interno di un'ampia gamma di concentrazioni (Tabella 5).
È importante sottolineare che il nostro metodo ha permesso l'identificazione e la quantificazione di diverse forme isobariche o isomeriche di lipidi. Le forme isobariche dei lipidi sono specie lipidiche con la stessa massa nominale (cioè, somma delle masse degli isotopi più abbondanti) ma diverse masse esatte31. Le forme isomeriche dei lipidi sono specie di lipidi con la stessa formula molecolare ma con struttura chimica diversa31. Ad esempio, l'uso del nostro metodo LC-MS/MS distingue tra PHC (16:0_26:0) e la specie lipidica isobarica PC (16:0_10:0): anche se hanno lo stesso valore di massa nominale di 650, le loro masse esatte sono rispettivamente 650.6457 e 650.4755. Inoltre, questo metodo LC-MS/MS distingue tra due coppie di specie di lipidi isomerici con la stessa formula molecolare ma struttura chimica diversa: 1) PC (18:0_18:1) e PC (20:0_16:1), con formula molecolare (C44H87N18P1) e massa esatta (788.6163); e 2) PE (16:0_16:0) e PE (14:0_18:0), con la formula molecolare (C37H75N1O8P1) e la massa esatta (692.5224).
Il nostro metodo LC-MS/MS può essere utilizzato per aumentare l'efficienza della ionizzazione per i lipidi di tutte le classi, migliorando così l'identificazione e la quantificazione dei principali lipidi cellulari. Tale miglioramento può essere ottenuto utilizzando additivi alternativi della fase mobile per gli Stati membri dell'ESI(tabella 6). Queste fasi alternative includono formate di ammonio, formato di ammonio con acido formico, acetato di ammonio, acetato di ammonio con acido acetico e acetato di ammonio con acido formico. Ciascuno di questi additivi alternativi per la fase mobile può essere utilizzato sia per le colonne LC a fase normale che per quelli in fase inversa (tabella 6).
Un altro vantaggio del nostro metodo LC-MS/MS consiste nella capacità di utilizzare due diversi metodi per la frammentazione degli ioni precursori (MS1) dei lipidi nei prodotti MS2. Questi due metodi sono la dissociazione collisionale ad alta energia (HCD) e la dissociazione indotta da collisioni (CID)32. Abbiamo scoperto che il metodo CID è utile se utilizzato in combinazione con l'additivo di fase mobile in acetato di ammonio per la modalità ESI (-) della SM, in quanto in queste condizioni consente un aumento dell'efficienza della frammentazione degli ioni lipidi MS1 in prodotti MS2 per PHC, CL, FFA, PE, PG, PI e PS (Tabella 7). Al contrario, il metodo HCD è favorevole se utilizzato in combinazione con l'additivo in fase mobile con formato di ammonio per la modalità ESI ( ) dello SM, in quanto in queste condizioni consente un aumento dell'efficienza della frammentazione degli ioni dei lipidi MS1 in prodotti MS2 per PC, PHS e TAG (tabella 8).
Figura 1: Il cromatogramma iografico (TIC) totale derivante dalla cromatografia liquida/spettrometria di massa (LC/MS) dei lipidi estratti dalle cellule del ceppo di tipo selvatico BY4742. Il TIC dei lipidi separati da LC su una colonna in fase inversa CSH C18 e rilevato dalla SM degli ioni dei genitori che sono stati creati utilizzando la modalità di ionizzazione dell'elettrospray negativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: un cromatogramma di due forme di fosfatidilserina isomerica (34:0) che hanno lo stesso valore m/z (M-H) di 762.5294 ma tempi di ritenzione diversi di 7,65 min e 8,49 min. I lipidi sono stati estratti da cellule del ceppo di tipo selvaggio BY4742 e separati dalla cromatografia liquida su una colonna in fase inversa CSH C18. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: spettri MS1 di due specie isomeriche di fosfatidilserina (34:0) che hanno lo stesso valore m/z (M-H) di 762.5294 ma tempi di ritenzione diversi di 7,65 min e 8,49 min. I lipidi sono stati estratti da cellule del ceppo di tipo selvaggio BY4742, separati dalla cromatografia liquida su una colonna in fase inversa CSH C18 (come mostrato nella Figura 2) e rilevati dalla spettrometria di massa degli ioni padre (MS1) che sono stati creati utilizzando la modalità di ionizzazione elettrospray negativa. (A) Lo spettro MS1 di una forma di fosfatidilaserina (34:0) con il valore m/z (M-H) di 762.5294 e il tempo di ritenzione di 7,65 min. (B) Lo spettro MS1 di un modulo di fosfatidilafenina (34:0) con il valore m/z (M-H) di 762.5294 e il tempo di conservazione di 8,49 min.
Figura 4: spettri MS2 di due specie isomeriche di fosfatidilserina (34:0) che hanno lo stesso valore m/z (M-H) di 762.5294 ma tempi di ritenzione diversi di 7,65 min e 8,49 min. I lipidi sono stati estratti da cellule del ceppo di tipo selvaggio BY4742, separati da cromatografia liquida su una colonna in fase inversa CSH C18 (come mostrato nella Figura 2) e rilevati dalla spettrometria di massa di ioni MS1 (come mostrato nella Figura 3). Gli ioni secondari (MS2) sono stati poi rilevati dalla spettrometria di massa. (A) Lo spettro MS2 di una forma di fosfatidilaserina (34:0) con il valore m/z (M-H) di 762.5294 e il tempo di ritenzione di 7,65 min. La perdita di una moiety serine ha prodotto uno ione con il valore m/z (M-H) di 675.6149. (B) Lo spettro MS2 di una forma di fosfatidilaserina (34:0) con il valore m/z (M-H) di 762.5294 e il tempo di ritenzione di 8,49 min. La perdita di una moiety serine ha prodotto uno ione con il valore m/z (M-H) di 675.8843. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Modalità di rilevamento | Classe Lipid | Composizione della coda idrofobica | Valore m/z calcolato | Concentrazione (pmoles/el) |
| Negativo | Cerammide | 18:1_17:0 | 550.5204675 | 226 |
| Negativo | Cardiolipin | 14:0_14:0_14:0_14:0 | 1239.839755 | 196 |
| Negativo | Acido grasso libero | 19:0 | 297.2799035 | 837 |
| Negativo | Fosfilatidylethanolamine | 15:0_15:0 | 662.4766305 | 377 |
| Negativo | Fosshatidililo | 15:0_15:0 | 693.4712115 | 349 |
| Negativo | Fosshatidilinolo | 17:0_20:4 | 871.5342065 | 3 |
| Negativo | Fosfatidilserina | 17:0_17:0 | 762.5290605 | 318 |
| Positivo | Fosfatidilcolina | 13:0_13:0 | 650.4755335 | 385 |
| Positivo | Fitosphingosina | 16:1 | 272.2584055 | 225 |
| Positivo | Triacylglycerolo | 28:1_10:1_10:1 | 818.7232155 | 367 |
Tabella 1: La composizione di una miscela di standard lipidici interni. Gli standard lipidici interni sono stati preparati nella miscela cloroformio/metanolo (2:1). La modalità di rilevamento si riferisce a una modalità positiva o negativa del rilevamento degli ioni padre utilizzando uno spettrometro di massa Orbitrap Velos dotato di sorgente iosa di ionizzazione elettrospray (ESI). I valori m/z calcolati sono per gli addotti dei lipidi.
| Risoluzione FTMS e p | 60000 |
| Gamma di massa (dalton) | 150-2000 |
| Tipo di origine Ion | ESI |
| Temperatura capillare (C) | 300 |
| Temperatura del riscaldatore di origine (C) | 300 |
| Flusso di gas in guaina | 10 |
| Flusso di gas aux | 5 |
| Tensione di polarità positiva (kV) | 3 |
| Tensione di polarità negativa (kV) | 3 |
| Corrente di origine (A) | 100 |
Tabella 2: Le impostazioni dello spettrometro di massa Orbitrap Velos utilizzate per analizzare i lipidi separati da LC. Abbreviazioni: FTMS - p - Spettrometria di massa basata sulla trasformazione di Fourier in modalità ESI (sezione); HESI - ionizzazione elettrospray riscaldata.
| Polarità dello strumento | Positivo | Negativo |
| Tipo di attivazione | Dissociazione in collisione ad alta energia | Dissociazione indotta da collisioni |
| Minimo segnale richiesto | 5000 | 5000 |
| Larghezza isolamento | 2 | 2 |
| Energia da collisione normalizzata | 55 | 35 |
| Stato addebito predefinito | 2 | 2 |
| Tempo di attivazione | 0.1 | 10 |
| Risoluzione FTMS e C | 7500 | |
| Sono stati selezionati 5 picchi più intensi per ms/ms |
Tabella 3: Le impostazioni dello spettrometro di massa Orbitrap Velos utilizzate per rilevare gli ioni secondari (MS2). Abbreviazione: FTMS - C - Spettrometria di massa basata sulla trasformazione in modalità ESI (sezione).
| Identificazione | |
| Database | Orbitrap |
| Rilevamento del picco | Richiamo isotopo (ON) |
| Opzione di ricerca | Ricerca prodotti Orbitrap |
| Tipo di ricerca | Prodotto |
| Tipo di esperimento | LC-MS |
| Tolleranza precursore | 10 ppm |
| Tolleranza al prodotto | Modalità di dissociazione da collisione ad alta energia [ESI)]: 20 ppm |
| Collisione-indotta -dissociazione [modalità ESI (-)]: 0,5 Dalton | |
| Quantificazione | |
| Eseguire la quantitazione | Attivato |
| tolleranza m/z | -5.0; 5,0 USD |
| Tipo di tolleranza | Ppm |
| filtro | |
| Filtro di classificazione superiore | Attivato |
| Filtro nodo principale | Picco isomere principale |
| Soglia punteggio m | 5 |
| Soglia punteggio c | 2 |
| Priorità FFA | Attivato |
| Filtro qualità ID | R: Classe Lipidi e tutti gli acidi grassi sono completamente identificati |
| B: Classe Lipidi e alcuni acidi grassi sono identificati | |
| C: Classe Lipid o FA sono identificati | |
| D: Lipid identificato da altri ioni di frammento (H2O, ecc.) | |
| Classe Lipid | |
| Modalità di dissociazione da collisione ad alta energia [ESI) | PC, TAG |
| Dissociazione indotta da collisione [modalità ESI (-)] | CER, CL, FFA, PE, PG, PI, PS |
| Ioni | |
| Modalità di dissociazione da collisione ad alta energia [ESI) | H; NH4; N. di tasti |
| Dissociazione indotta da collisione [modalità ESI (-)] | - H; - 2H; - HCOO |
Tabella 4: I parametri di ricerca utilizzati per identificare diverse classi e specie di lipidi con l'aiuto del software di identificazione dei lipidi "Lipid Search" (V 4.1). Abbreviazioni: CER - ceramide; CL - cardiolipina; FFA - acido grasso libero (non esterizzato); PC - fosfatidicicolina; PE - fosfatidylethanolamina; PG - fosfatidiylglycerolo; PI - fosfatidilinositolo; PS - fosfatidiylserine; TAG - triacylglycerolo.
Tabella 5: Le concentrazioni più basse di specie molecolari di diverse classi lipidiche che possono essere identificate e quantificate con l'aiuto del nostro metodo LC-MS/MS. Una stima della più bassa concentrazione quantificabile per ogni classe lipidiche si basa sulle aree di picco della SM per il suo standard interno (queste aree di picco di SM e concentrazioni standard di lipidi sono visualizzate in grassetto) e sulla sua forma molecolare rappresentativa presente alla più bassa concentrazione rilevabile. I dati sono presentati come valori medi di due esperimenti indipendenti, per ciascuno dei quali sono state eseguite tre repliche tecniche. Fare clic qui per visualizzare questa tabella (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
| Standard lipidico | Modalità ESI | Amf | AmF/FA | Amac | AmAc/AA | AmAc/FA |
| Phc | - | 74 | 75.2 | 85.8 | 77 | 74.8 |
| Cl | - | 72.9 | 75.1 | 78.3 | 68.4 | 74 |
| Ffa | - | 77.1 | 77.2 | 75.5 | 84 | 72.9 |
| Pe | - | 98 | 96 | 95 | 91.5 | 86 |
| Pg | - | 64 | 45.1 | 75.9 | 60.5 | 55 |
| Pi | - | 79.3 | 76 | 82.5 | 80.3 | 77 |
| Ps | - | 73.7 | 61.6 | 85.8 | 81.4 | 73.7 |
| Pc | + | 93.5 | 86.9 | 69.3 | 60.5 | 62.7 |
| Phs | + | 89.1 | 79.2 | 78.1 | 73.7 | 69.3 |
| TAG | + | 92.4 | 88 | 86.9 | 80.3 | 84.7 |
Tabella 6: Gli effetti degli additivi alternativi della fase mobile per gli Stati membri dell'ESI sull'efficienza della ionizzazione per i lipidi di diverse classi. Diversi lipidi sono stati separati l'uno dall'altro dalla cromatografia liquida in fase inversa. Gli standard lipidici commerciali che appartengono a diverse classi di lipidi sono indicati nella Tabella 1. La modalità di ionizzazione ESI (-) o ESI () è stata utilizzata per gli Stati membri in presenza di diversi additivi per fase mobile. La percentuale di ionizzazione per ogni standard lipidico è indicata come valore medio da tre repliche tecniche. Per ogni lipidico, la percentuale di ionizzazione è stata calcolata in base all'area di picco degli Stati membri. Un valore della massima efficienza di ionizzazione per ogni lipido viene visualizzato in grassetto. Abbreviazioni: AmF - formato di ammonio; AmF/FA - formato di ammonio con acido formico; AmAc - acetato di ammonio; AmAc/AA - acetato di ammonio con acido acetico; AmAc/FA - acetato di ammonio con acido formico; CL - cardiolipina; FFA - acido grasso libero (non esterizzato); PC - fosfatidicicolina; PE - fosfatidylethanolamina; PG - fosfatidiylglycerolo; PHC - fitoceramide; PHS - fitosphingosina; PI - fosfatidilinositolo; PS - fosfatidiylserine; TAG - triacylglycerolo.
| Standard lipidico | Modalità ESI | Amf | Amac |
| Phc | - | 75 | 83.8 |
| Cl | - | 70.9 | 79.3 |
| Ffa | - | 76.1 | 74.5 |
| Pe | - | 98 | 95 |
| Pg | - | 64 | 75.9 |
| Pi | - | 79.3 | 82.5 |
| Ps | - | 71.5 | 84.8 |
| Pc | + | 52.3 | 60.5 |
| Phs | + | 78.4 | 75.2 |
| TAG | + | 65.7 | 69.7 |
Tabella 7: L'effetto del metodo di dissociazione indotta da collisioni (CID) sull'efficienza della frammentazione degli ioni precursori (MS1). Gli standard lipidici commerciali che appartengono a diverse classi di lipidi sono indicati nella Tabella 1. Per la SM è stata utilizzata la modalità di ionizzazione ESI (-) o ESI (AAm), in presenza di un additivo per fase mobile di acetato di ammonio (AmF) o acetato di ammonio (AmAc). La percentuale di ioni lipidi MS1 frammentati in prodotti MS2 è indicata come valore medio da tre repliche tecniche. Per ogni lipidico, la percentuale di ionizzazione è stata calcolata in base all'area di picco MS2. Un valore della percentuale più alta di ioni lipidi MS1 frammentati viene visualizzato in grassetto per ogni lipido (confronto con i dati presentati nella tabella 8). Questo valore è il più alto se l'efficienza della formazione di ioni di prodotto MS2 è la più alta. Abbreviazioni: CL - cardiolipina; FFA - acido grasso libero (non esterizzato); PC - fosfatidicicolina; PE - fosfatidylethanolamina; PG - fosfatidiylglycerolo; PHC - fitoceramide; PHS - fitosphingosina; PI - fosfatidilinositolo; PS - fosfatidiylserine; TAG - triacylglycerolo.
| Standard lipidico | Modalità ESI | Amf | Amac |
| Phc | - | 68.4 | 65.4 |
| Cl | - | 74.3 | 75.2 |
| Ffa | - | 84.2 | 81.2 |
| Pe | - | 85.1 | 73.1 |
| Pg | - | 68.4 | 67.1 |
| Pi | - | 58.7 | 55.8 |
| Ps | - | 67.4 | 68.5 |
| Pc | + | 92.5 | 65.3 |
| Phs | + | 87.1 | 75.1 |
| TAG | + | 91.4 | 84.9 |
Tabella 8: L'effetto del metodo di dissociazione collisionale ad alta energia (HCD) sull'efficienza della frammentazione degli ioni precursori (MS1). Gli standard lipidici commerciali che appartengono a diverse classi di lipidi sono indicati nella Tabella 1. Per la SM è stata utilizzata la modalità di ionizzazione ESI (-) o ESI (AAm), in presenza di un additivo per fase mobile di acetato di ammonio (AmF) o acetato di ammonio (AmAc). La percentuale di ioni lipidi MS1 frammentati in prodotti MS2 è indicata come valore medio da tre repliche tecniche. Per ogni lipidico, la percentuale di ionizzazione è stata calcolata in base all'area di picco MS2. Un valore della percentuale più alta di ioni lipidi MS1 frammentati viene visualizzato in grassetto per ogni lipido (confronto con i dati presentati nella tabella 7). Questo valore è il più alto se l'efficienza della formazione di ioni di prodotto MS2 è la più alta. Altre abbreviazioni: CL - cardiolipina; FFA - acido grasso libero (non esterizzato); PC - fosfatidicicolina; PE - fosfatidylethanolamina; PG - fosfatidiylglycerolo; PHC - fitoceramide; PHS - fitosphingosina; PI - fosfatidilinositolo; PS - fosfatidiylserine; TAG - triacylglycerolo.
Tabella supplementare 1: Un elenco di specie molecolari di 10 diverse classi di lipidi identificate e quantificate nelle cellule di S. cerevisiae con l'aiuto del nostro metodo LC-MS/MS. Queste classi lipidiche includevano acidi grassi liberi (non esterificati), cardiolipina (CL), fitoceramide (PHC), fitosphingosina (PHS), fosfatidinelcolina (PC), fosfati dylethanolamine (PE), fosfatidiylglycerol (PG), fosfatidiylinositolo (PI), fossphatidylserine (PS) e triacylglycerol (TAG). Le cellule di S. cerevisiae sono state coltivate nel mezzo YNB sintetico minimo inizialmente contenente il 2% di glucosio. Le aliquote delle cellule di lievito per l'estrazione dei lipidi e l'analisi LC-MS/MS dei lipidi estratti sono state recuperate nei giorni 1, 2, 3, 4, 6, 8 e 10 di coltura. Vengono mostrate tutte le specie lipidiche di ogni classe lipidica identificate nelle cellule di lievito recuperate in diversi giorni di coltura. Alcune di queste specie lipidiche erano presenti solo in cellule di lievito cronologicamente giovani recuperate nei giorni 1-4 della coltura, altre solo in cellule di lievito cronologicamente vecchie recuperate nei giorni 6-10 di coltura, mentre alcune erano presenti sia in cellule cronologicamente giovani che vecchie di lievito. Viene mostrata l'area di picco di SS più alta per ogni specie lipidica di ogni classe lipidica identificata in un determinato giorno di coltura. Gli standard lipidici di diverse classi lipidiche che sono stati utilizzati per la quantificazione di altre specie all'interno di questa classe lipidia sono visualizzati in colore rosso. I valori m/z calcolati sono per gli addotti dei lipidi. Abbreviazione: ESI (-) - modalità ESI (-) di SM; ESI ( ) - la modalità ESI () di MS. I dati sono presentati come valori medi di due esperimenti indipendenti, per ciascuno dei quali sono state eseguite tre repliche tecniche. Fare clic qui per visualizzare questa tabella (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
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Discussion
Le seguenti precauzioni sono importanti per la corretta implementazione del protocollo descritto di seguito:
1. Il cloroformio e il metanolo sono tossici. Estraggono in modo efficiente varie sostanze dalle superfici, tra cui plasticware di laboratorio e la pelle. Pertanto, gestire questi solventi organici con cautela evitando l'uso di materie plastiche in passaggi che comportano il contatto con cloroformio e/o metanolo, utilizzando pipette di vetro borosilicato per questi passaggi e risciacquando queste pipette con cloroformio e metanolo prima dell'uso.
2. Durante l'estrazione dei lipidi mediante miscela di metanolo/cloroformato (17:1), utilizzare una pipetta di vetro borosilicato per trasferire la fase organica inferiore (400 gradi) a un tubo di centrifuga superiore a vite di vetro ad alta resistenza da 15 ml con un tappo foderato in politeschiofluoroetile. Non interrompere le perline di vetro o la fase acquosa superiore durante tale trasferimento. Mantenere la fase organica inferiore sotto il flusso di gas di azoto.
3. Durante la preparazione del campione per LC-MS/MS, è importante eliminare tutte le bolle d'aria nelle fiale di vetro prima di inserire le fiale in un pozzo.
4. Per ottenere una completa solubilizzazione del formato di ammonio e dell'acetato di ammonio nelle fasi mobili A e B prima della separazione dei lipidi da parte di LC, sciogliere ogni sale in 500 gradi di acqua nanopura prima di mescolare la soluzione con la fase mobile e sonicare per 20 minuti.
5. Non conservare la pellicola lipidida formata dopo l'evaporazione del solvente per un lungo periodo di tempo prima dell'esecuzione. Immagazziniamo questo film a -80 gradi centigradi per non più di una settimana prima di scioglierlo nella miscela acetonitrile/2-propanol/nano-pure water (65:35:5) e poi sottoponendo i lipidi alla miscela LC-MS/MS.
Il metodo LC-MS/MS descritto qui è una tecnica versatile, robusta e sensibile per una valutazione quantitativa di molte specie lipidiche che comprendono il lipidome cellulare del lievito o di qualsiasi altro organismo eucatra. Il metodo consente l'identificazione e la quantificazione di diverse specie di lipidi isobarici o isomeriche, consente di utilizzare additivi di fase mobili alternativi per lo Stato ESI per promuovere la ionizzazione dei lipidi e rendere più efficiente l'identificazione e la quantificazione dei lipidi e può utilizzare sia metodi HCD che CID per la frammentazione o l'attivazione di ioni lipidi MS1.
Usiamo questo metodo LC-MS/MS per studiare i cambiamenti legati all'età nei lipidomi cellulari e organizzativi durante l'invecchiamento cronologico del lievito in erba S. cerevisiae. Utilizziamo anche questo metodo per studiare quanti interventi genetici, dietetici e farmacologici che ritardano l'invecchiamento influenzano la composizione dei lipidi dell'intera cellula S. cerevisiae e dei suoi vari organelli. Grazie alla sua versatilità, robustezza e sensibilità, questo metodo LC-MS/MS può essere utilizzato con successo per la valutazione quantitativa dei lipidomi cellulari e dell'organellar negli organismi eucarioti in tutta la phyla.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Siamo grati agli attuali ed ex membri del laboratorio Titorenko per le discussioni. Riconosciamo il Centro per le applicazioni biologiche della spettrometria di massa e il Centro per la genomica strutturale e funzionale (entrambe all'Università di Concordia) per i servizi eccezionali. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) del Canada (RGPIN 2014-04482) e del Concordia University Chair Fund (CC0113). K.M. è stato sostenuto dal Concordia University Merit Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
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