اختبار العلاجات المستهدفة في السرطان باستخدام تحليل تعديل الحمض النووي الهيكلي وXenografts المستمدة من المريض
Summary
هنا نقدم بروتوكول لاختبار فعالية العلاجات المستهدفة المختارة على أساس التركيبة الجينومية للورم. ويصف البروتوكول تحديد وإعادة التحقق من إعادة ترتيب الحمض النووي الهيكلي، وgragraftment من أورام المرضى في الفئران واختبار الاستجابات للأدوية المقابلة.
Abstract
نقدم هنا نهجا تكامليا لاختبار فعالية العلاجات المستهدفة التي تجمع بين الجيل القادم من التسلسل technolo – gies ، والتحليلات العلاجية المستهدفة ورصد استجابة الدواء باستخدام xenografts المستمدة من المريض (PDX). تم التحقق من صحة هذه الاستراتيجية باستخدام أورام المبيض كمثال. تم استخدام بروتوكول تسلسل الجيل التالي (MPseq) لتحديد التعديلات الهيكلية وتبعه تحليل للتعديلات التي يمكن استهدافها. تم علاج الأورام البشرية التي تزرع في الفئران المناعية بأدوية تم اختيارها استنادًا إلى التحليلات الجينومية. أظهرت النتائج وجود ارتباط جيد بين الاستجابات المتوقعة والاستجابات الملاحظة في نموذج PDX. يمكن استخدام النهج المقدم لاختبار فعالية العلاجات المركبة والمساعدة في العلاج الشخصي للمرضى الذين يعانون من السرطان المتكرر ، وتحديدا في الحالات التي يفشل فيها العلاج القياسي وهناك حاجة لاستخدام الأدوية خارج التسمية.
Introduction
ظهرت xenografts المستمدة من المريض (PDXs) ، والتي يتم إنشاؤها من زرع قطع الورم المريض في الفئران المناعية ، كنموذج قوي قبل الظهر للمساعدة في الرعاية الشخصية المضادة للسرطان. وقد تم تطوير نماذج PDX بنجاح لمجموعة متنوعة من الأورام الخبيثة البشرية. وتشمل هذه سرطانات الثدي والمبيض، سرطان الجلد الخبيث، سرطان القولون والمستقيم، وسرطان غدية البنكرياس، وسرطان الرئة غير صغيرالخلية 1،2،3،4،5. يمكن زرع أنسجة الورم بشكل متقوي أو غير متغاير. الأول، يعتبر أكثر دقة ولكن من الصعب من الناحية الفنية، ينطوي على زرع مباشرة في الجهاز من أصل الورم. ويعتقد أن هذه الأنواع من النماذج لتقليد الأنسجة بالضبط من الورم الأصلي بسبب البيئة الدقيقة “الطبيعية” للورم6,7. على سبيل المثال، زرع العظام في الجراب من المبيض الماوس أدى إلى نشر الورم في تجويف البريتوني وإنتاج استسقاء، نموذجية من سرطان المبيض8. وبالمثل، حقن أورام الثدي في الصدر بدلا من الغدة الثديية في البطن أثرت على معدل النجاح PDX والسلوك9. ومع ذلك، تتطلب نماذج تقويم العظام أنظمة تصوير متطورة لمراقبة نمو الورم. وعادة ما يتم إجراء زرع غير تقليدية للورم الصلب عن طريق زرع الأنسجة في الجناح تحت الجلد من الماوس الذي يسمح لمراقبة أسهل لنمو الورم وأقل تكلفة وتستغرق وقتا طويلا7. ومع ذلك، الأورام التي نمت تحت الجلد نادرا ما تنتشر على عكس ما لوحظ في حالة زرع العظام10.
وقد تبين أن معدل نجاح engraftment تختلف وتعتمد بشكل كبير على نوع الورم. وأفادت التقارير الأورام أكثر عدوانية وعينات الأنسجة التي تحتوي على نسبة أعلى من الخلايا السرطانية أن يكون أفضل معدلات النجاح12,13. واتساقا مع هذا، تبين الأورام المستمدة من المواقع النقيلي لengraft في ترددات من 50-80٪، في حين أن تلك من المواقع الأولية engraft في ترددات منخفضة 14٪12. في المقابل، الأنسجة التي تحتوي على الخلايا النخرية وأقل الخلايا السرطانية القابلة للحياة تغر بشكل سيئ. ويمكن أيضا أن تعزز نمو الورم بإضافة البروتينات مصفوفة غشاء الطابق السفلي في مزيج الأنسجة في وقت الحقن في الفئران14 دون المساس خصائص الورم الأصلي. كما وجد أن حجم وعدد قطع الأنسجة المعدة للزرع تؤثر على معدل نجاح النقش. تم الإبلاغ عن أكبر من الأورام اتخاذ معدلات لزرع في كبسولة تحت الكلى مقارنة زرع تحت الجلد بسبب قدرة كبسولة دون كلوي للحفاظ على الورم الأصلي stroma وتوفير الخلايا القوية المضيفة وكذلك15.
معظم الدراسات استخدام NOD / SCID الفئران المناعية، والتي تفتقر إلى الخلايا القاتلة الطبيعية16 وقد ثبت أن زيادة الورم النقش والنمو والنتلال مقارنة مع سلالات أخرى14. ومع ذلك، هناك حاجة إلى رصد إضافي لأنها قد تتطور الأورام اللمفاوية الزعترة في وقت مبكر من 3-4 شهر من العمر13. في زراعة أورام المبيض التي تزرع في الفئران SCID، تم بنجاح منع نمو الخلايا B من قبل rituximab، ومنع تطور الأورام اللمفاوية ولكن دون التأثير على graftment من أورام المبيض17.
وفي الآونة الأخيرة، NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJl) الفئران, تحمل طفرة فارغة في ترميز الجين سلسلة غاما مستقبلات 2 إنترلوكين2, أصبح سلالة تستخدم في كثير من الأحيان لتوليد نماذج PDX. الأورام من نماذج PDX المنشأة التي تم تمريرها إلى الأجيال القادمة من الفئران وأفيد أن تحتفظ الخصائص النسيجية والجزيئية ل 3 إلى 6 أجيال19,20. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن نتائج العلاج في نماذج PDX تحاكي تلك من المرضى المقابلةلها 2,3,4,21,22,23. وكان معدل الاستجابة للعلاج الكيميائي في نماذج PDX لسرطان الرئة غير الصغيرة وسرطان القولون والمستقيم مماثلة لتلك التي في التجارب السريرية لنفس الأدوية24,25. أظهرت الدراسات التي أجريت في نماذج PDX ، وضعت للمرضى المسجلين في التجارب السريرية ، الاستجابات لاختبار الأدوية المماثلة لتلك التي لوحظت سريريا في المرضى المقابلة2،3،4.
توفر التحليلات الجينية عالية الإنتاجية للورم المريض بالاقتران مع نماذج PDX أداة قوية لدراسة الارتباطات بين التعديلات الجينومية المحددة والاستجابة العلاجية. وقد وصفت هذه في عدد قليل من المنشورات26,27. على سبيل المثال، الاستجابات العلاجية لمثبطات EGFR cetuximab في مجموعة من نماذج PDX القولون والمستقيم تحمل التضخيم EGFR، والاستجابات السريرية الموازية لcexceimab في المرضى28.
هناك بعض التحديات المرتبطة بتطوير وتطبيق نماذج PDX. ومن بين تلك هي عدم تجانس الورم29,30 التي قد تهدد دقة تفسير استجابة العلاج كما استنساخ خلية واحدة مع قدرة تكاثرية أعلى داخل PDX يمكن أن تتفوق على تلك الأخرى31, مما يؤدي إلى فقدان عدم التجانس. بالإضافة إلى ذلك، عندما يتم استخدام الخزعات ورم واحد لتطوير PDX، قد غاب عن بعض مجموعات الخلايا ولن تكون ممثلة في الكسب غير المشروع النهائي. يوصى بأخذ عينات متعددة من نفس الورم للزرع لحل هذه المشكلة. على الرغم من أن أورام PDX تميل إلى احتواء جميع أنواع الخلايا من الورم المانح الأصلي ، يتم استبدال هذه الخلايا تدريجيا من قبل تلك المنشأ مورين3. التفاعل بين مورين ستروما والخلايا السرطانية البشرية في نماذج PDX غير مفهومة جيدا. ومع ذلك, وقد تبين أن الخلايا الهمية لخياب اخصائية الأورام microenvironment33.
على الرغم من هذه القيود، لا تزال نماذج PDX من بين الأدوات الأكثر قيمة للبحث الترجمي بالإضافة إلى الطب الشخصي لاختيار علاجات المرضى. وتشمل التطبيقات الرئيسية لـ PDXs اكتشاف العلامات البيولوجية واختبار المخدرات. كما تستخدم نماذج PDX بنجاح لدراسة آليات مقاومة الأدوية وتحديد استراتيجيات للتغلب على مقاومة الأدوية34,35. النهج الموصوف في هذه المخطوطة يسمح للباحث لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة في الأورام البشرية وتقييم فعالية الأدوية المقابلة في الجسم الحي، في الفئران التي تؤوي الأورام التي تم تصنيفها في البداية بشكل جيني. البروتوكول يستخدم أورام المبيض engrafted intraperitoneally ولكن ينطبق على أي نوع من الورم العدوانية بما فيه الكفاية لتنمو في الفئران2,3,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن وصف النهج والبروتوكولات التي استخدمناها لإجراء “تجربة سريرية” في نماذج PDX التي تستفيد من الخصائص الجزيئية للورم كما تم الحصول عليها من خلال التنميط الجينومي لتحديد أفضل خيار للأدوية للاختبار. وتستخدم حاليا منصات تسلسل متعددة لتوصيف الجينوم للأورام الأولية بما في ذلك تسلسل الجينوم كل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء مركز مايو كلينك للطب الفردي (CIM) الدكتور لين يانغ وفاي ر. هاريس، MS، على المساعدة في إجراء التجارب. وقد دعم هذا العمل السيد والسيدة نيل إي إيكلز هدية إلى مركز Mayo Clinic للطب الفردي (CIM).
Materials
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13, 3989-3998 (2007).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73, 4885-4897 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Weroha, S. J., et al. Tumorgrafts as in vivo surrogates for women with ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 20, 1288-1297 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. Optimizing the development of targeted agents in pancreatic cancer: tumor fine-needle aspiration biopsy as a platform for novel prospective ex vivo drug sensitivity assays. Molecular Cancer Therapeutics. 6, 1079-1088 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Ricci, F., et al. Patient-derived ovarian tumor xenografts recapitulate human clinicopathology and genetic alterations. Cancer Research. 74, 6980-6990 (2014).
- Fleming, J. M., et al. Local regulation of human breast xenograft models. Journal of Cellular Physiology. 224, 795-806 (2010).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, 451-452 (2015).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50, 1-10 (2018).
- Sivanand, S., et al. A validated tumorgraft model reveals activity of dovitinib against renal cell carcinoma. Science Translational Medicine. 4, 137-152 (2012).
- Pavía-Jiménez, A., Tcheuyap, V. T., Brugarolas, J. Establishing a human renal cell carcinoma tumorgraft platform for preclinical drug testing. Nature Protocols. 9, 1848-1859 (2014).
- Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nature Protocols. 7, 1138-1144 (2012).
- Cutz, J. C., et al. Establishment in severe combined immunodeficiency mice of subrenal capsule xenografts and transplantable tumor lines from a variety of primary human lung cancers: potential models for studying tumor progression-related changes. Clinical Cancer Research. 12, 4043-4054 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73, 5315-5319 (2013).
- Butler, K. A., et al. Prevention of Human Lymphoproliferative Tumor Formation in Ovarian Cancer Patient-Derived Xenografts. Neoplasia. 19, 628-636 (2017).
- Cao, X., et al. Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain. Immunity. 2, 223-238 (1995).
- Dobbin, Z. C., et al. Using heterogeneity of the patient-derived xenograft model to identify the chemoresistant population in ovarian cancer. Oncotarget. 5, 8750-8764 (2014).
- Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Davé, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344, 1-12 (2014).
- Rosfjord, E., Lucas, J., Li, G., Gerber, H. P. Advances in patient-derived tumor xenografts: from target identification to predicting clinical response rates in oncology. Biochemical Pharmacology. 91, 135-143 (2014).
- Braekeveldt, N., Bexell, D. Patient-derived xenografts as preclinical neuroblastoma models. Cell and Tissue Research. 372, 233-243 (2018).
- ‘Perez-Soler, R., et al. Response and determinants of sensitivity to paclitaxel in human non-small cell lung cancer tumors heterotransplanted in nude mice. Clinical Cancer Research. 6, 4932-4938 (2000).
- Fichtner, I., et al. Anticancer drug response and expression of molecular markers in early-passage xenotransplanted colon carcinomas. European Journal of Cancer. 40, 298-307 (2004).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21, 1318-1325 (2015).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28, 2595-2605 (2017).
- Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts (“xenopatients”) identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Mengelbier, L. H., et al. Intratumoral genome diversity parallels progression and predicts outcome in pediatric cancer. Nature Communications. 27, 6125 (2015).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168, 613-628 (2017).
- Marusyk, A., et al. Non-cell-autonomous driving of tumour growth supports sub-clonal heterogeneity. Nature. 514, 54-58 (2014).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts reflect the microenvironmental hallmarks of aggressive patient tumours. Cancer Letters. 375, 384-389 (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494, 251-255 (2013).
- Girotti, M. R., et al. Application of Sequencing, Liquid Biopsies, and Patient-Derived Xenografts for Personalized Medicine in Melanoma. Cancer Discovery. 6, 286-299 (2016).
- Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA Research. 19, 395-406 (2012).
- Smadbeck, J. B., et al. Copy number variant analysis using genome-wide mate-pair sequencing. Genes Chromosomes and Cancer. 57, 459-470 (2018).
- Kovtun, I. V., et al. Lineage relationship of Gleason patterns in Gleason score 7 prostate cancer. Cancer Research. 73, 3275-3284 (2013).
- Paster, E. V., Villines, K. A., Hickman, D. L. Endpoints for mouse abdominal tumor models: refinement of current criteria. Comparative Medicine. 59, 234-241 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Cheng, Y., et al. MK-2206, a novel allosteric inhibitor of Akt, synergizes with gefitinib against malignant glioma via modulating both autophagy and apoptosis. Molecular Cancer Therapeutics. 11, 154-164 (2012).
- Rivera, V. M., et al. Ridaforolimus (AP23573; MK-8669), a potent mTOR inhibitor, has broad antitumor activity and can be optimally administered using intermittent dosing regimens. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 1059-1071 (2011).
- Heitjan, D. F., Manni, A., Santen, R. J. Statistical analysis of in vivo tumor growth experiments. Cancer Research. 53, 6042-6050 (1993).
- Vargas, R., et al. Case study: patient-derived clear cell adenocarcinoma xenograft model longitudinally predicts treatment response. NPJ Precision Oncology. 2, 14 (2018).
- Harris, F. R., et al. Targeting HER2 in patient-derived xenograft ovarian cancer models sensitizes tumors to chemotherapy. Molecular Oncology. 13, 132-152 (2019).
- Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer and Metastasis Reviews. 13, 209-222 (1994).
