Testen von gezielten Krebstherapien mit struktureller DNA-Alterationsanalyse und patientenabgeleiteten Xenografts
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Wirksamkeit gezielter Therapien zu testen, die auf der Grundlage der genomischen Zusammensetzung eines Tumors ausgewählt wurden. Das Protokoll beschreibt die Identifizierung und Validierung struktureller DNA-Umlagerungen, die Einplage von Patiententumoren in Mäuse und die Erprobung von Reaktionen auf entsprechende Medikamente.
Abstract
Wir präsentieren hier einen integrativen Ansatz zur Erprobung der Wirksamkeit gezielter Therapien, der die Next Generation der Sequenzierungstechnologien, therapeutische Zielanalysen und die Überwachung der Wirkstoffabhängigkeit mit patientenabgeleiteten Xenografts (PDX) kombiniert. Diese Strategie wurde am Beispiel von Eierstocktumoren validiert. Das Mate-Pair-Protokoll der nächsten Generation (MPseq) wurde verwendet, um strukturelle Änderungen zu identifizieren, und anschließend wurde eine Analyse potenziell zielbarer Änderungen durchgeführt. Menschliche Tumoren, die in immungeschwächten Mäusen angebaut wurden, wurden mit Medikamenten behandelt, die auf der Grundlage der genomischen Analysen ausgewählt wurden. Die Ergebnisse zeigten eine gute Korrelation zwischen den vorhergesagten und den beobachteten Antworten im PDX-Modell. Der vorgestellte Ansatz kann verwendet werden, um die Wirksamkeit von Kombinationsbehandlungen zu testen und personalisierte Behandlungen für Patienten mit wiederkehrendem Krebs zu unterstützen, insbesondere in Fällen, in denen die Standardtherapie fehlschlägt und es notwendig ist, Medikamente außerhalb des Etiketts zu verwenden.
Introduction
Patienten-abgeleitete Xenografts (PDXs), die aus der Implantation von Tumorstücken von Patienten in immundefizienten Mäusen erzeugt werden, haben sich als ein leistungsfähiges präklinisches Modell zur Unterstützung einer personalisierten Krebsbehandlung herauskristallisiert. PDX-Modelle wurden erfolgreich für eine Vielzahl von menschlichen Malignitäten entwickelt. Dazu gehören Brust- und Eierstockkrebs, malignes Melanom, Dickdarmkrebs, Bauchspeicheldrüsenadenokarzinom und nicht-kleinzelliger Lungenkrebs1,2,3,4,5. Tumorgewebe kann orthotopisch oder heterotopisch implantiert werden. Erstere, die als genauer, aber technisch schwierig gelten, beinhaltet eine Transplantation direkt in das Tumororgan. Diese Arten von Modellen werden geglaubt, um genau imitieren Histologie des ursprünglichen Tumors aufgrund der “natürlichen” Mikroumgebung für den Tumor6,7. Zum Beispiel führte die orthotopische Transplantation in die Bursa des Maus-Ovarials zur Tumorverbreitung in die Peritonealhöhle und zur Herstellung von Aszites, typisch für Eierstockkrebs8. In ähnlicher Weise beeinflusste die Injektion von Brusttumoren in die Brust anstelle der Bauchbrustdrüse die PDX-Erfolgsrate und das Verhalten9. Orthotopmodelle erfordern jedoch ausgeklügelte Bildgebungssysteme, um das Tumorwachstum zu überwachen. Die heterotopische Implantation eines soliden Tumors erfolgt in der Regel durch Implantation von Gewebe in die subkutane Flanke einer Maus, was eine einfachere Überwachung des Tumorwachstums ermöglicht und weniger teuer und zeitaufwändigist 7. Allerdings wuchsen Tumore subkutan selten metastasierend, anders als bei der orthotopischen Implantationbeobachtet 10.
Die Erfolgsrate der Transplantation hat sich als variierend erwiesen und hängt stark vom Tumortyp ab. Aggressivere Tumoren und Gewebeproben, die einen höheren Prozentsatz der Tumorzellen enthalten, hatten den Berichten zufolge bessere Erfolgsraten12,13. In Übereinstimmung damit, Tumoren von metastasierenden Stellen abgeleitet wurden gezeigt, um mit Frequenzen von 50-80%, während diejenigen von primären Standorten engraft bei Frequenzen so niedrig wie 14%12. Im Gegensatz dazu, Gewebe mit nekrotischen Zellen und weniger lebensfähige Tumorzellen engraft schlecht. Das Tumorwachstum kann auch durch die Zugabe von Kellermembran-Matrixproteinen in den Gewebemix zum Zeitpunkt der Injektion in Mäuse14 gefördert werden, ohne die Eigenschaften des ursprünglichen Tumors zu beeinträchtigen. Die Größe und Anzahl der gewebeteile, die für die Implantation bestimmt sind, beeinflussen auch die Erfolgsrate der Engraftment. Größere Tumoraufnahmeraten wurden für die Implantation in der subrenalen Kapsel im Vergleich zur subkutanen Implantation aufgrund der Fähigkeit der subrenalen Kapsel berichtet, den ursprünglichen Tumor stroma zu erhalten und die Wirtsstromzellen sowie15zur Verfügung zu stellen.
Die meisten Studien verwenden NOD/SCID immundefizienten Mäusen, denen natürliche Killerzellen16 fehlen und die nachweislich die Tumorengraftment, das Wachstum und die Metastasierung im Vergleich zu anderen Stämmen erhöhen14. Eine zusätzliche Überwachung ist jedoch erforderlich, da sie thymische Lymphome bereits im Alter von3-4Monaten entwickeln können. Bei Eierstocktumortransplantationen, die in SCID-Mäusen angebaut wurden, wurde das Auswachsen von B-Zellen erfolgreich durch Rituximab gehemmt, was die Entwicklung von Lymphomen verhinderte, ohne jedoch die Engraftmentierung von Eierstocktumoren zu beeinträchtigen17.
In jüngerer Zeit, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) Mäuse, die eine Nullmutation im Gen tragen, die die Interleukin-2-Rezeptor-Gammakette18kodiert, wurden zu einem häufig verwendeten Stamm für die Erzeugung von PDX-Modellen. Tumore aus etablierten PDX-Modellen, die an zukünftige Generationen von Mäusen weitergegeben werden, behalten berichtend histologische und molekulare Eigenschaften für 3 bis 6 Generationen19,20. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die Behandlungsergebnisse in PDX-Modellen die ihrer entsprechenden Patienten imitieren2,3,4,21,22,23. Die Ansprechrate auf Chemotherapie in PDX-Modellen bei nicht-kleinen Lungenkrebs und dickdarmen Karzinomen war ähnlich wie in klinischen Studien für die gleichen Medikamente24,25. Studien, die in PDX-Modellen durchgeführt wurden und für Patienten entwickelt wurden, die an klinischen Studien teilnahmen, zeigten Reaktionen auf getestete Medikamente, die denen ähnlich waren, die bei entsprechendenPatienten2,3,4klinisch beobachtet wurden.
Genomanalysen eines Patiententumors mit hohem Durchsatz in Verbindung mit PDX-Modellen bieten ein leistungsfähiges Werkzeug, um Korrelationen zwischen spezifischen genomischen Veränderungen und einer therapeutischen Reaktion zu untersuchen. Diese wurden in einigen Veröffentlichungen26,27beschrieben. Zum Beispiel therapeutische Reaktionen auf den EGFR-Hemmer Cetuximab in einer Reihe von kolorektalen PDX-Modellen, die EGFR-Amplifikation, parallele klinische Reaktionen auf Cetuximab bei Patienten28.
Es gibt einige Herausforderungen, die mit der Entwicklung und Anwendung von PDX-Modellen verbunden sind. Unter diesen ist Tumorheterogenität29,30, die die Genauigkeit der Behandlungsantwort Interpretation als ein einzelner Zellklon mit höherer proliferativer Kapazität innerhalb eines PDX beeinträchtigen kann die anderen31wachsen , was zu einem Verlust der Heterogenität. Darüber hinaus, wenn einzelne Tumorbiopsien verwendet werden, um PDX zu entwickeln, können einige der Zellpopulationen verpasst werden und werden nicht in der endgültigen Transplantation dargestellt werden. Mehrere Proben desselben Tumors werden für die Implantation empfohlen, um dieses Problem zu beheben. Obwohl PDX-Tumoren in der Regel alle Zelltypen des ursprünglichen Spendertumors enthalten, werden diese Zellen nach und nach durch solche murinen Ursprungsersetzt 3. Das Zusammenspiel zwischen muriner Stroma und menschlichen Tumorzellen in PDX-Modellen ist nicht gut verstanden. Dennoch wurde gezeigt, dass Stromalzellen die Tumormikroumgebung33rekapitulieren.
Trotz dieser Einschränkungen gehören PDX-Modelle nach wie vor zu den wertvollsten Werkzeugen für die translationale Forschung sowie zur personalisierten Medizin zur Auswahl von Patiententherapien. Zu den wichtigsten Anwendungen von PDXgehören gehören die Biomarker-Erkennung und Arzneimitteltests. PDX-Modelle werden auch erfolgreich verwendet, um Arzneimittelresistenzmechanismen zu studieren und Strategien zur Überwindung der Arzneimittelresistenz34,35zu identifizieren. Der in diesem Manuskript beschriebene Ansatz ermöglicht es dem Forscher, potenzielle therapeutische Ziele in menschlichen Tumoren zu identifizieren und die Wirksamkeit entsprechender Medikamente in vivo bei Mäusen zubewerten, die transplantierte Tumoren beherbergen, die zunächst genomisch charakterisiert waren. Das Protokoll verwendet Eierstocktumoren, die intraperitoneal transplantiert werden, ist aber auf jede Art von Tumor anwendbar, der ausreichend aggressiv ist, um bei Mäusen zu wachsen2,3,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben den Ansatz und die Protokolle, die wir verwendet haben, um eine “klinische Studie” in PDX-Modellen durchzuführen, die die molekularen Eigenschaften des Tumors nutzt, wie sie durch genomisches Profiling gewonnen werden, um die beste Auswahl an Medikamenten für Tests zu bestimmen. Mehrere Sequenzierungsplattformen werden derzeit für die genomische Charakterisierung von Primärtumoren verwendet, einschließlich der gesamten Genomsequenzierung, RNAseq und kundenspezifischer Genpanels. Für hochgradige ser?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern des Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Dr. Lin Yang und Faye R. Harris, MS, für die Hilfe bei der Durchführung von Experimenten. Diese Arbeit wurde unterstützt von Herrn und Frau Neil E. Eckles’ Gift an das Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM).
Materials
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
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