בדיקת טיפולים ייעודיים בסרטן באמצעות ניתוח שינוי DNA מבנית והמטופל נגזר Xenografts
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבדוק את היעילות של טיפולים ייעודיים שנבחרו על בסיס האיפור גנומית של הגידול. הפרוטוקול מתאר זיהוי ואימות של הסדרים מבניים של ה-DNA, חרט גידולים של חולים לתוך עכברים והתגובות בדיקה לתרופות המתאימות.
Abstract
אנו מציגים כאן גישה אינטגרטיבית לבדיקת יעילות של טיפולים ייעודיים המשלב הדור הבא ברצף technolo-, ניתוחי היעד הטיפולית וניטור תגובת התרופה באמצעות מטופל הנגזר xenografts תלי (PDX). אסטרטגיה זו אומתה באמצעות גידולים בשחלות כדוגמה. פרוטוקול רצף הדור הבא (MPseq) של זוג הזוגות שימש לזיהוי שינויים מבניים ולאחריו ניתוח של שינויים שעלולים לגרום לשימוש בטבלה. גידולים אנושיים שגדלו בעכברים בסיכון חיסוני טופלו תרופות שנבחרו מבוסס על ניתוחים גנומית. תוצאות הפגינו מתאם טוב בין התגובות החזוי והנצפים במודל PDX. הגישה המוצגת ניתן להשתמש כדי לבדוק את היעילות של טיפולים שילוב וסיוע טיפול מותאם אישית עבור חולים עם סרטן חוזרים, במיוחד במקרים שבהם טיפול רגיל נכשלת ויש צורך להשתמש בסמים מחוץ לתווית.
Introduction
המטופל נגזר xenografts תלי (pdxs), אשר נוצר מן ההשתלה של חתיכות הסרטן החולה לתוך עכברים לקויה, התפתחה כמו מודל רב עוצמה פרה לסייע אישית אנטי סרטן טיפול. מודלים PDX פותחו בהצלחה עבור מגוון רחב של ממאירות אנושית. אלה כוללים סרטן השד והשחלות, מלנומה ממאירה, סרטן המעי הגס, אדנוקרצינומה הלבלב, ו סרטן ריאות תאים לא קטנים1,2,3,4,5. רקמת הגידול יכול להיות מושתל אורתולמריחה או הטרועור. לשעבר, נחשב מדויק יותר אבל מבחינה טכנית קשה, כרוך השתלת ישירות לתוך איבר של מוצא הגידול. סוגים אלה של מודלים מאמינים בדיוק לחקות היסטולוגיה של הגידול המקורי בשל “טבעי” מיקרו הסביבה עבור הגידול6,7. לדוגמה, השתלת הנושא אורתוגרקציה לתוך בורסה של השחלה העכבר הביא הפצת הגידול לתוך חלל הצפק וייצור של מיימת, אופייני לסרטן השחלות8. באופן דומה, הזרקה של גידולים בשד לתוך החזה במקום בלוטת הפטמות הבטן השפיעו על שיעור ההצלחה PDX והתנהגות9. עם זאת, מודלים אורתוטופית דורשים מערכות דימות מתוחכמות כדי לפקח על צמיחת הגידול. הטרוההשתלת הגידול מוצק מבוצעת בדרך כלל על ידי השתלת רקמת לאגף תת עורית של העכבר המאפשר ניטור קל יותר של צמיחת הגידול והוא פחות יקר זמן רב7. עם זאת, גידולים הגדלים תת-עורי לעתים נדירות גרורות בניגוד לציין במקרה של השרשה אורתודפית10.
שיעור ההצלחה של החרט הוכח להשתנות ומאוד תלוי בסוג הגידול. גידולים אגרסיביים יותר ודגימות רקמות המכילות אחוז גבוה יותר של תאים סרטניים דווחו יש שיעורי הצלחה טובה יותר12,13. בהתאם למצב זה, גידולים שמקורם באתרים גרוניים הוכחו להיחרט בתדרים של 50 – 80%, בעוד אלה מהאתרים העיקריים העפילו בתדרים נמוך כמו 14%12. לעומת זאת, הרקמה המכילה את התאים נקרוטיק ופחות תאים סרטניים קיימא חרט גרוע. צמיחה הגידול יכול גם להיות מקודם על ידי תוספת של המרתף קרום מטריקס חלבונים לתוך תערובת רקמות בזמן הזריקה לתוך עכברים14 מבלי להתפשר על מאפיינים של הגידול המקורי. הגודל ומספר הרקמה שנועדו לשרשה נמצאו גם הם להשפיע על שיעור ההצלחה של החרט. גידול גדול יותר לקחת-שיעורי דווחו על השרשה בקפסולה תת כליות לעומת השתלת תת עורית בשל היכולת של קפסולת תת כליות לשמור על משתית הגידול המקורי ולספק את התאים סטרומה המארח גם15.
רוב המחקרים להשתמש בעכברים חיסוני SCID הלקוי, אשר חסר תאים הרוצח טבעי16 הוכחו להגדיל את הגידול בתאום, צמיחה גרורות לעומת זנים אחרים14. עם זאת, ניטור נוסף נדרש כפי שהם עשויים לפתח לימפומה הרתי מוקדם ככל 3-4 חודש של גיל13. ב השתלות גידול השחלות גדל בעכברים SCID, הצמיחה של התאים B היה מעוכב בהצלחה על ידי rituximab, מניעת פיתוח של לימפומה אך מבלי להשפיע על העפילה של גידולים בשחלות17.
לאחרונה, NSG (הנהון. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/szj) עכברים, נושא מוטציה null בקידוד הגן של האינטרלוקין 2 שרשרת גמא הקולטן18, הפך להיות זן שימוש תכוף עבור הדור של מודלים pdx. גידולים מדגמי pdx הוקמה לדורות הבאים של עכברים מדווחים לשמור על תכונות היסטולוגית ומולקולרית עבור 3 עד 6 דורות19,20. מחקרים רבים הראו כי התוצאות הטיפול ב pdx מודלים לחקות את אלה של המטופלים המתאימים שלהם2,3,4,21,22,23. שיעור התגובה כימותרפיה ב pdx מודלים עבור סרטן ריאות לא קטן קרצינומות המעי הגס היה דומה לזה בניסויים קליניים עבור תרופות אותן24,25. מחקרים שנערכו בדגמי pdx, שפותחו עבור חולים שנרשמו בניסויים קליניים, הפגינו תגובות תרופות בדוקות דומה לאלה שנצפו קלינית בחולים המתאימים2,3,4.
גבוהה – התפוקה גנומית ניתוח של גידול החולה בשילוב עם מודלים PDX לספק כלי רב עוצמה כדי לחקור את היחסים בין שינויים גנותיים ספציפיים תגובה טיפולית. אלה תוארו במספר פרסומים26,27. לדוגמה, התגובות הטיפוליות ל-egfr מעכב ארביטוקס בקבוצה של מודלים pdx המעי הגס נושא הגברה egfr, וקרב התגובות הקליניות כדי ארביטוקס בחולים28.
ישנם כמה אתגרים הקשורים לפיתוח ויישום של מודלים PDX. בין אלה הוא גידול טרוגניות29,30 זה עלול לפגוע בדיוק של פרשנות תגובת הטיפול כמו שיבוט תא יחיד עם קיבולת ההתרבות גבוה יותר בתוך pdx יכול לעבור את אלה אחרים31, ובכך התוצאה היא אובדן של טרוגניות. בנוסף, כאשר ביופסיות הגידול בודד משמשים לפיתוח PDX, חלק מאוכלוסיית התאים עלולים להיות מחמיץ ולא יהיה מיוצג בשתל הסופי. דגימות מרובות מאותו גידול מומלצות להשתלה כדי לפתור את הבעיה. למרות הגידולים PDX נוטים להכיל את כל סוגי התא של גידול תורם המקורי, תאים אלה הם הוחלף בהדרגה על ידי אלה של מקור murine3. הגומלין בין מסטרומה מורטין ותאי הגידול האנושיים בדגמי PDX לא מובנים היטב. למרות זאת, תאים סטרומה הוכחו באופן מסכם מיקרו סביבה גידול33.
למרות מגבלות אלה, מודלים PDX להישאר בין הכלים החשובים ביותר עבור מחקר טרנסלtional, כמו גם רפואה אישית לבחירת טיפולים החולה. יישומים עיקריים של PDXs כוללים גילוי סמנים ביואריקר ובדיקות סמים. Pdx מודלים משמשים גם בהצלחה כדי ללמוד התנגדות לסמים מנגנונים ולזהות אסטרטגיות כדי להתגבר על עמידות לסמים34,35. הגישה המתוארת בכתב היד הנוכחי מאפשרת לחוקר לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות בגידולים אנושיים ולהעריך את היעילות של התרופות המתאימות בvivo, בעכברים המייצגים גידולים מנופה שgenomically בתחילה. הפרוטוקול משתמש גידולים השחלות המנופה intraperitoneally אבל הוא ישים לכל סוג של הגידול אגרסיבי מספיק כדי לגדול בעכברים2,3,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מתארים את הגישה ואת הפרוטוקולים השתמשנו לבצע “ניסוי קליני” ב PDX מודלים שלוקח את היתרון של מאפיינים מולקולריים של הגידול כפי שהושג על ידי יצירת פרופיל גנומית כדי לקבוע את הבחירה הטובה ביותר של תרופות לבדיקה. פלטפורמות רצף מרובות משמשות כעת עבור אפיון גנומית של גידולים ראשוניים כולל רצף …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי מרכז המרפאה של מאיו עבור הרפואה האישית (CIM) ד ר. לין יאנג ופיי R. האריס, MS, על העזרה בביצוע ניסויים. העבודה הזאת נתמכת על ידי מר וגברת ניל א ‘ מתנה למרכז הקליניקה של מאיו לרפואה אישית (CIM).
Materials
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13, 3989-3998 (2007).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73, 4885-4897 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Weroha, S. J., et al. Tumorgrafts as in vivo surrogates for women with ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 20, 1288-1297 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. Optimizing the development of targeted agents in pancreatic cancer: tumor fine-needle aspiration biopsy as a platform for novel prospective ex vivo drug sensitivity assays. Molecular Cancer Therapeutics. 6, 1079-1088 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Ricci, F., et al. Patient-derived ovarian tumor xenografts recapitulate human clinicopathology and genetic alterations. Cancer Research. 74, 6980-6990 (2014).
- Fleming, J. M., et al. Local regulation of human breast xenograft models. Journal of Cellular Physiology. 224, 795-806 (2010).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, 451-452 (2015).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50, 1-10 (2018).
- Sivanand, S., et al. A validated tumorgraft model reveals activity of dovitinib against renal cell carcinoma. Science Translational Medicine. 4, 137-152 (2012).
- Pavía-Jiménez, A., Tcheuyap, V. T., Brugarolas, J. Establishing a human renal cell carcinoma tumorgraft platform for preclinical drug testing. Nature Protocols. 9, 1848-1859 (2014).
- Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nature Protocols. 7, 1138-1144 (2012).
- Cutz, J. C., et al. Establishment in severe combined immunodeficiency mice of subrenal capsule xenografts and transplantable tumor lines from a variety of primary human lung cancers: potential models for studying tumor progression-related changes. Clinical Cancer Research. 12, 4043-4054 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73, 5315-5319 (2013).
- Butler, K. A., et al. Prevention of Human Lymphoproliferative Tumor Formation in Ovarian Cancer Patient-Derived Xenografts. Neoplasia. 19, 628-636 (2017).
- Cao, X., et al. Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain. Immunity. 2, 223-238 (1995).
- Dobbin, Z. C., et al. Using heterogeneity of the patient-derived xenograft model to identify the chemoresistant population in ovarian cancer. Oncotarget. 5, 8750-8764 (2014).
- Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Davé, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344, 1-12 (2014).
- Rosfjord, E., Lucas, J., Li, G., Gerber, H. P. Advances in patient-derived tumor xenografts: from target identification to predicting clinical response rates in oncology. Biochemical Pharmacology. 91, 135-143 (2014).
- Braekeveldt, N., Bexell, D. Patient-derived xenografts as preclinical neuroblastoma models. Cell and Tissue Research. 372, 233-243 (2018).
- ‘Perez-Soler, R., et al. Response and determinants of sensitivity to paclitaxel in human non-small cell lung cancer tumors heterotransplanted in nude mice. Clinical Cancer Research. 6, 4932-4938 (2000).
- Fichtner, I., et al. Anticancer drug response and expression of molecular markers in early-passage xenotransplanted colon carcinomas. European Journal of Cancer. 40, 298-307 (2004).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21, 1318-1325 (2015).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28, 2595-2605 (2017).
- Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts (“xenopatients”) identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Mengelbier, L. H., et al. Intratumoral genome diversity parallels progression and predicts outcome in pediatric cancer. Nature Communications. 27, 6125 (2015).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168, 613-628 (2017).
- Marusyk, A., et al. Non-cell-autonomous driving of tumour growth supports sub-clonal heterogeneity. Nature. 514, 54-58 (2014).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts reflect the microenvironmental hallmarks of aggressive patient tumours. Cancer Letters. 375, 384-389 (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494, 251-255 (2013).
- Girotti, M. R., et al. Application of Sequencing, Liquid Biopsies, and Patient-Derived Xenografts for Personalized Medicine in Melanoma. Cancer Discovery. 6, 286-299 (2016).
- Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA Research. 19, 395-406 (2012).
- Smadbeck, J. B., et al. Copy number variant analysis using genome-wide mate-pair sequencing. Genes Chromosomes and Cancer. 57, 459-470 (2018).
- Kovtun, I. V., et al. Lineage relationship of Gleason patterns in Gleason score 7 prostate cancer. Cancer Research. 73, 3275-3284 (2013).
- Paster, E. V., Villines, K. A., Hickman, D. L. Endpoints for mouse abdominal tumor models: refinement of current criteria. Comparative Medicine. 59, 234-241 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Cheng, Y., et al. MK-2206, a novel allosteric inhibitor of Akt, synergizes with gefitinib against malignant glioma via modulating both autophagy and apoptosis. Molecular Cancer Therapeutics. 11, 154-164 (2012).
- Rivera, V. M., et al. Ridaforolimus (AP23573; MK-8669), a potent mTOR inhibitor, has broad antitumor activity and can be optimally administered using intermittent dosing regimens. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 1059-1071 (2011).
- Heitjan, D. F., Manni, A., Santen, R. J. Statistical analysis of in vivo tumor growth experiments. Cancer Research. 53, 6042-6050 (1993).
- Vargas, R., et al. Case study: patient-derived clear cell adenocarcinoma xenograft model longitudinally predicts treatment response. NPJ Precision Oncology. 2, 14 (2018).
- Harris, F. R., et al. Targeting HER2 in patient-derived xenograft ovarian cancer models sensitizes tumors to chemotherapy. Molecular Oncology. 13, 132-152 (2019).
- Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer and Metastasis Reviews. 13, 209-222 (1994).
