Summary
Hier presenteren we een protocol om de werkzaamheid van gerichte therapieën geselecteerd op basis van de genomische samenstelling van een tumor te testen. Het protocol beschrijft identificatie en validatie van structurele DNA-herschikkingen, engraftmentatie van tumoren van patiënten in muizen en het testen van reacties op overeenkomstige geneesmiddelen.
Abstract
We presenteren hier een integratieve aanpak voor het testen van de werkzaamheid van gerichte therapieën die de volgende generatie sequencing technolo-gies, therapeutische doelanalyses en drug response monitoring met behulp van patiënt afgeleide xenografts (PDX) combineert. Deze strategie werd gevalideerd met behulp van eierstoktumoren als voorbeeld. Het mate-pair next generation sequencing (Mpeq) protocol werd gebruikt om structurele wijzigingen te identificeren en gevolgd door analyse van potentieel gerichte wijzigingen. Menselijke tumoren gekweekt in immuungecompromitteerde muizen werden behandeld met geneesmiddelen geselecteerd op basis van de genomische analyses. De resultaten toonden een goede correlatie aan tussen de voorspelde en de waargenomen reacties in het PDX-model. De gepresenteerde aanpak kan worden gebruikt om de werkzaamheid van combinatiebehandelingen te testen en gepersonaliseerde behandeling te helpen voor patiënten met terugkerende kanker, met name in gevallen waarin standaardtherapie mislukt en er een noodzaak is om geneesmiddelen off label te gebruiken.
Introduction
Patiënt-afgeleide xenografts (PDXs), die worden gegenereerd uit de implantatie van patiënt tumor stukken in immunodeficient muizen, zijn naar voren gekomen als een krachtig preklinisch model om gepersonaliseerde anti-kanker zorg te helpen. PDX modellen zijn met succes ontwikkeld voor een verscheidenheid van menselijke maligniteiten. Deze omvatten borst- en eierstokkanker, kwaadaardig melanoom, colorectale kanker, alvleesklieradenocarcinoom en niet-kleincellige longkanker1,,2,,3,,4,,5. Tumorweefsel kan orthotopisch of heterotopisch worden geïmplanteerd. De eerste, beschouwd als nauwkeuriger, maar technisch moeilijk, gaat transplantatie rechtstreeks in het orgaan van tumor oorsprong. Deze soorten modellen worden verondersteld om precies na te bootsen histologie van de oorspronkelijke tumor als gevolg van de "natuurlijke" micro-omgeving voor de tumor6,7. Bijvoorbeeld, orthotopische transplantatie in de slijmbeurs van de muis eierstok resulteerde in tumor verspreiding in de buikvliesholte en de productie van ascites, typisch voor eierstokkanker8. Evenzo beïnvloedde injectie van borsttumoren in het borstvuur in plaats van de buikklier het PDX-slagingspercentage en gedrag9. Orthotopische modellen vereisen echter geavanceerde beeldvormingssystemen om de tumorgroei te monitoren. Heterotopische implantatie van vaste tumor wordt meestal uitgevoerd door het implanteren van weefsel in de onderhuidse flank van een muis die het mogelijk maakt voor een gemakkelijkere monitoring van tumorgroei en is minder duur en tijdrovend7. Echter, tumoren gegroeid onderhuids zelden metastaseren in tegenstelling tot zoals waargenomen in het geval van orthotopische implantatie10.
Het slagingspercentage van engraftment is aangetoond dat variëren en sterk afhankelijk van het tumortype. Meer agressieve tumoren en weefselmonsters met een hoger percentage van de tumorcellen werden gemeld aan een betere slagingspercentages12,13hebben . In overeenstemming met deze, tumoren afgeleid van gemetastaste sites werden aangetoond dat engraft op frequenties van 50-80%, terwijl die van primaire sites engraft op frequenties zo laag als 14%12. Weefsel dat necrotische cellen en minder levensvatbare tumorcellen bevat, is daarentegen slecht. Tumorgroei kan ook worden bevorderd door de toevoeging van keldermembraanmateneiwitten in de weefselmix op het moment van de injectie in muizen14 zonder afbreuk te doen aan de eigenschappen van de oorspronkelijke tumor. De grootte en het aantal weefselstukken bestemd voor implantatie bleken ook het slagingspercentage van engraftment beïnvloeden. Grotere tumor take-rates werden gemeld voor implantatie in de sub-nier capsule in vergelijking met onderhuidse implantatie als gevolg van het vermogen van de sub-nier capsule om de oorspronkelijke tumor stroma te handhaven en de gastheer stromalcellenevenals 15.
De meeste studies gebruiken NOD/ SCID immunodeficient muizen, die geen natuurlijke killer cellen16 en is aangetoond dat het verhogen van de tumor engraftment, groei en metastase in vergelijking met andere stammen14. Er is echter extra monitoring nodig omdat ze thymische lymfomen kunnen ontwikkelen vanaf 3-4 maanden13 jaar. Bij eierstoktumortransplantaties gekweekt in SCID muizen, werd de uitgroei van B-cellen met succes geremd door rituximab, het voorkomen van de ontwikkeling van lymfoom, maar zonder invloed op de engraftment van de eierstokkanker tumoren17.
Meer recent, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) muizen, die een null mutatie in het gen coderen van de interleukine 2 receptor gamma keten18, werd een veelgebruikte stam voor de generatie van PDX modellen. Tumoren van gevestigde PDX-modellen die naar toekomstige generaties muizen worden doorgegangerd, behouden naar verluidt histologische en moleculaire eigenschappen gedurende 3 tot 6 generaties19,20. Talrijke studies hebben aangetoond dat de behandelingsresultaten in PDX-modellen die van hun overeenkomstige patiëntennabootsen 2,3,4,21,22,23. Het responspercentage op chemotherapie in PDX-modellen voor niet-kleine longkanker en colorectale carcinomen was vergelijkbaar met die in klinische studies voor dezelfde geneesmiddelen24,25. Studies uitgevoerd in PDX-modellen, ontwikkeld voor patiënten die waren ingeschreven in klinische studies, toonden aan dat er reacties waren op geteste geneesmiddelen die vergelijkbaar zijn met die waargenomen bij overeenkomstige patiënten2,3,4.
Genomische analyses met hoge doorvoer van een patiënttumor in combinatie met PDX-modellen bieden een krachtig hulpmiddel om correlaties tussen specifieke genomische veranderingen en een therapeutische respons te bestuderen. Deze zijn beschreven in enkele publicaties26,27. Bijvoorbeeld, therapeutische reacties op de EGFR-remmer cetuximab in een set van colorectale PDX-modellen met EGFR-versterking, parallelle klinische reacties op cetuximab bij patiënten28.
Er zijn een paar uitdagingen verbonden aan de ontwikkeling en toepassing van PDX-modellen. Onder die is tumor heterogeniteit29,30 die de nauwkeurigheid van de behandeling respons interpretatie kan compromitteren als een eencellige kloon met een hogere proliferative capaciteit binnen een PDX kan ontgroeien de andere31, wat resulteert in een verlies van heterogeniteit. Bovendien, wanneer eentumor biopten worden gebruikt om PDX te ontwikkelen, kunnen sommige van de cel populaties worden gemist en zal niet worden vertegenwoordigd in de uiteindelijke graft. Meerdere monsters van dezelfde tumor worden aanbevolen voor implantatie om dit probleem op te lossen. Hoewel PDX-tumoren de neiging hebben om alle celtypen van de oorspronkelijke donortumor te bevatten, worden deze cellen geleidelijk vervangen door die van murineoorsprong3. Het samenspel tussen murine stroma en menselijke tumorcellen in PDX-modellen is niet goed begrepen. Niettemin, stromalcellen werden aangetoond dat tumor micro-omgeving33recapituleren .
Ondanks deze beperkingen blijven PDX-modellen een van de meest waardevolle instrumenten voor translationeel onderzoek en gepersonaliseerde geneeskunde voor het selecteren van patiënttherapieën. Belangrijke toepassingen van PDX's zijn biomarker discovery en drug testing. PDX-modellen worden ook met succes gebruikt om resistentiemechanismen voor geneesmiddelen te bestuderen en strategieën te identificeren om resistentie tegen geneesmiddelen te overwinnen34,35. De in het onderhavige manuscript beschreven aanpak stelt de onderzoeker in staat om potentiële therapeutische doelen in menselijke tumoren te identificeren en de werkzaamheid van overeenkomstige geneesmiddelen in vivo tebeoordelen, bij muizen die gegrafeerde tumoren herbergen die aanvankelijk genomically werden gekarakteriseerd. Het protocol maakt gebruik van eierstoktumoren geïnnaleerd intraperitoneally, maar is van toepassing op elk type tumor voldoende agressief om te groeien in muizen2,3,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Verse weefsels van instemmende patiënten met eierstokkanker werden verzameld op het moment van debulking chirurgie volgens een protocol goedgekeurd door Mayo Clinic Institutional Review Board (IRB). Alle dierlijke procedures en behandelingen die in dit protocol werden gebruikt werden goedgekeurd door Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en volgde richtlijnen voor dierverzorging.
1. Stuurpaar sequencing en analyses
OPMERKING: Vers of flash bevroren weefsel moet worden gebruikt voor mate pair (Mpeq) sequencing. Paraffine ingebed materiaal is niet geschikt omdat het gefragmenteerd DNA bevat.
- Isoleer DNA uit bevroren tumorweefsel. Gebruik originele menselijke specimen verkregen uit chirurgisch materiaal of biopsie36.
- Gebruik 1000 ng DNA om Mpeq-bibliotheken te maken en sequentie als 2 monsters per rijstrook op de volgende generatie sequencer (zie Tabel van Materialen)36.
- Analyseer gegevens met behulp van een reeks algoritmen om grote chromosomale afwijkingen (verwijderingen, invoegingen, versterkingen, inversies en translocaties) te detecteren zoals eerder beschreven36,37.
2. Selectie van therapeutische doelstellingen
- Gebruik het open access Panda-gereedschap (Pathway and Annotation) of een analoog hulpmiddel om doelgerichte wijzigingen te identificeren (http://bioinformaticstools.mayo.edu/Panda).
- Maak een lijst van genen die door MSeq worden geïdentificeerd als gewijzigd, als een eenvoudig door tabbladen afgebakend bestand, met behulp van standaard geaccepteerde gensymbolen.
OPMERKING: Het opgenomen voorbeeld functies analyse van versterkingen en winsten. - Voeg een '#' teken toe aan de kopregel van de lijst om ervoor te zorgen dat de tabelkop wordt overgebracht naar de weergave routeniveau van de software.
- Upload het bestand door op het tabblad Navigatie instellen uploaden te klikken.
- Wijs één pictogram toe in het menu om de onderliggende gegevens weer te geven door op het keuzepictogram te klikken en vervolgens op het tabblad Afronden te klikken.
- Nadat de annotatiebestanden zijn geüpload, identificeert u een kolom die het aantal geannoteerde genen per traject weergeeft. Dit is de laatste kolom aan de rechterkant.
- Gebruik Pathway Filter linksboven in het hoofdvenster om paden te tonen die genen van belang zijn.
- Identificeer paden die meer geannoteerde genen hebben dan bij toeval wordt verwacht. Gebruik de functie onder het tabblad Verrijking.
- Selecteer een database om potentieel druggable genen weer te geven van Preset Annotation door een geschikt pictogram links van het hoofdvenster te controleren (bijvoorbeeld DGIdb, PharmGKB).
- Selecteer route voor visualisatie door te klikken op de naam die wordt weergegeven op de pagina Pathway Viewer.
OPMERKING: Pictogrammen die elke annotatieset vertegenwoordigen, worden naast het bijbehorende gen weergegeven. Klik op het gen van belang om de bijbehorende GeneCards webpagina te openen. - Selecteer de paden die de geannoteerde genen van belang vertoonden (d.w.z. veranderd in een bepaalde tumor) en "hits" voor potentiële geneesmiddelen voor verdere analyse.
- Maak een lijst van genen die door MSeq worden geïdentificeerd als gewijzigd, als een eenvoudig door tabbladen afgebakend bestand, met behulp van standaard geaccepteerde gensymbolen.
- Gebruik een database met geneesmiddelen die zijn goedgekeurd voor klinische toepassing (https://clinicaltrials.gov/) om de geïdentificeerde doelen te vergelijken.
- Geef prioriteit aan gerichte wijzigingen voor verdere tests in PDX-modellen door een literatuuronderzoek uit te voeren (bijvoorbeeld PubMed) om de relevantie voor de biologie van een bepaald type tumor te bevestigen.
3. Validatie van genomische herschikkingen door PCR en Sanger sequencing
- Ontwerp primers met behulp van sequencing leest verkregen uit Mpeq gegevens.
- Selecteer een splitsing van belang voor de validatie (d.w.z. potentieel therapeutisch doel) op basis van Mpeq-analyses.
- Ontwerp primers richtingsgewijs zodanig dat de amplicon de kruising bevat. Ontwerp 2 primers aan elke kant van de kruising, voor een totaal van 4, om de kans op versterking van de kruising te verhogen.
OPMERKING: Naam primers volgens de zaak en chromosoom locatie. - Gebruik standaard PCR parameters voor het primer ontwerp en een software naar keuze. Selecteer smelttemperatuur (60-62 °C) en het GC-gehalte (40-60%). Zorg ervoor dat de primer sequentie geen primer dimers, palindrooms of haarspeldlussen vormt.
- Bevestig dat de primersequentie geen homologie heeft voor andere delen van het menselijk genoom door het te controleren met blat (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start).
- Voer een PCR uit om de interesseverbinding te versterken.
- Verdun primers met water tot 10 mM en combineer 10 mL van elke primer, zodat elke voorwaartse primer wordt gecombineerd met elke omgekeerde primer in een primer mix.
OPMERKING: Reeksen voor de primers voor het geselecteerde voorbeeld worden weergegeven in tabel 1. - Label 0,2 mL stripbuizen als: C1, T1, C2, T2, C3, T3, C4 en T4 waar C=control human genomic DNA (commercieel), T=Tumor DNA, geïsoleerd van patiënt- of PDX-tumor, en het getal geeft de primermix aan.
- Voeg 1 mL van elke primer mix in de gelabelde buizen.
- Bereid de Taq mastermix door het combineren van reagentia vermeld in tabel 2, waardoor het enzym in de vriezer tot het nodig is, toe te voegen aan het mengsel helemaal.
- Maak 2 master mixen, een voor elke sjabloon DNA, controle menselijk DNA en tumor DNA. Voeg 24 mL van elke Taq master mix toe aan zijn respectievelijke stripbuis. Het totale reactievolume bedraagt 25 mL. Vortex heel kort en draai de stripbuis naar beneden.
- Voer een PCR uit in een thermocycler. Gebruik de parameters in tabel 3. Pas de gloeiende temperatuur zo aan dat deze minstens 1 °C kouder is dan de smelttemperatuur van de primers.
- Bewaar het ingevulde PCR-product op -20 °C (lange termijn) of gekoeld op 4 °C (korte termijn) tot dat nodig is.
- Voer elektroforese uit bij 1-5 V/cm om pcr-product te visualiseren met behulp van een 1,5% agarose gel. Laat 2 mL aliquot van het product worden gebruikt voor Sanger sequencing.
- Verdun primers met water tot 10 mM en combineer 10 mL van elke primer, zodat elke voorwaartse primer wordt gecombineerd met elke omgekeerde primer in een primer mix.
- Voer Sanger-sequencing uit om de kruising te bevestigen en het exacte breekpunt38te identificeren.
- Gebruik het PCR-product als de PCR één product (band) heeft gegenereerd. U de band uit de gel snijden, zuiveren en indienen voor Sanger sequencing samen met de primer die wordt gebruikt voor versterking.
OPMERKING: De tumoren waarvoor genomische analyses werden uitgevoerd, worden vervolgens gebruikt voor implantatie bij muizen.
- Gebruik het PCR-product als de PCR één product (band) heeft gegenereerd. U de band uit de gel snijden, zuiveren en indienen voor Sanger sequencing samen met de primer die wordt gebruikt voor versterking.
4. Tumorengraftment en onderhoud
- Stel voorbereidingen in om tumoren in PDX-muismodellen te steken. Selecteer voor engraftment tumoren waarvoor genomische analyses zullen zijn of zijn uitgevoerd.
- Zorg ervoor dat er een ondersteunende infrastructuur aanwezig is bij de start van de ontwikkeling van PDX-modellen, waaronder speciale laboratorium- en dierfaciliteiten, bekwaam technisch personeel en gedetailleerde standaardwerkprocedures.
- Zorg voor het snelle transport en de verwerking van specimens als snelheid is cruciaal voor de levensvatbaarheid van de cel en succesvolle engraftment.
- Gebruik een steriele omgeving om bacteriële en schimmelverontreiniging voor de verwerking en engrafting van specimens te verminderen.
- Behandel menselijke specimens met de nodige voorzichtigheid, in overeenstemming met het institutionele beleid met betrekking tot potentieel biogevaarlijke materialen, omdat ze door bloed overgedragen ziekteverwekkers kunnen herbergen.
- Bereid het weefsel (0,5-0,7 cm3 in grootte) voor door het chirurgische monster in een voorgekoelde buis van 50 mL met 20 mL weefselkweekmedia te plaatsen.
LET OP: Het tumorweefsel kan vers zijn of worden hersteld van eerder cryopreserved materiaal5. - Bevestig het tumorgehalte in het monster door een patholoog te raadplegen.
- Plaats het tumorweefsel in een schaal met 10-15 mL koude PBS, of weefselkweekmedia zoals RPMI 1640 of DMEM met antibiotica (1% penicilline en streptomycine).
- Identificeer en isoleer levensvatbaar tumormateriaal uit aangrenzend normaal en necrotisch weefsel met de hulp van een patholoog. Gebruik steriele tangen en scalpel om necrotisch materiaal te verwijderen dat door een patholoog wordt opgemerkt.
OPMERKING: De tumor kan intraperitoonaal of onderhuids in de muizen worden geïmplanteerd. Volg stap 4.2 om een intraperitoneale implantatie uit te voeren of ga naar stap 4.3 om een onderhuidse engraftment uit te voeren. In deze studie werden gerichte therapieën geselecteerd op basis van genomische analyses getest in een reeks PDX-modellen voor hoogwaardige sereuze eierstokkanker met intraperitoneale implantatie.
- Bereid het weefsel voor op intraperitoneale (IP) implantatie van het weefsel met steriele tangen en een scalpel op ijs om stukken te maken ongeveer 1-1,5 mm3 in grootte en mengen met koude cultuur medium. Injecteer 0,3–0,5 mL tumordrijfmest met behulp van een naald van 16-17 meter.
LET OP: Alle chirurgische ingrepen worden uitgevoerd met behulp van aseptische technieken. Steriele handschoenen, steriele instrumenten, benodigdheden en geïmplanteerde materialen werden gebruikt om de kans op infectie te verminderen.- Meng de stukken 1:1 met ijskoud cultuurmedium en injecteer 100 mL intraperitoneally in ten minste drie vrouwelijke SCID muizen.
- Snijd het tumorweefsel voor onderhuidse engraftment met behulp van steriele tangen, scalpel, of chirurgische schaar in kleine fragmenten, ongeveer 2 x 2 x 2 mm groot, en breng de gefragmenteerde weefsels naar een voorgekoelde petrischaal op ijs.
- Voeg de koude kelder membraan matrix in de schotel met de gefragmenteerde weefsel (ongeveer 200 mL per 10 stuks weefsel), meng goed, en laat het weefsel fragmenten weken in de koude kelder membraan matrix voor 10 min.
- Verdoven 5 vrouwelijke NOD/SCID muizen om ze voor te bereiden op engraftment.
- Injecteer elke muis intraperitoneally met ketamine (150 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) combinatie.
- Bevestig dat de muis goed verdoofd is door de staartpunt te knijpen met atraumatische tangen.
- Verwijder voorzichtig volledig verdoofde muis uit de kamer en zet op de muis een neuskegel die input heeft van vaporizer en output van afvalgas opruimingssysteem.
- Zet vetzalf op de ogen van de muis om droogte te voorkomen, terwijl onder narcose. Bereid het gebied voor waar de operatie zal worden uitgevoerd. Gebruik aseptische techniek om de operatie uit te voeren.
- Zorg ervoor dat het oppervlak waarop de operatie gaat nemen niet poreus is, verzegeld en vóór de operatie wordt ontsmet.
- Begin met een operatie met steriele (door autoclave, gas of chemische sterilisatie) instrumenten.
- Gebruik handschoenen om instrumenten te hanteren en de steriliteit van de instrumenttips gedurende de hele procedure te behouden door ze onder te dompelen in ethanol tussen de operatiestappen.
- Steriliseren van de chirurgische site door het toepassen van 3 afwisselende scrubs van jodium en alcohol. Gebruik steriele chirurgische schaar en tangen om een 5-10 mm verticale huid incisie te maken op beide flanken van een muis.
- Steek rechte tangen voorzichtig in de onderhuidse ruimte om een zak te creëren die groot genoeg is om een tumorfragment onder het vetkussen te plaatsen.
- Gebruik de steriele rechte tangen om tumorfragmenten in te brengen in eerder voorbereide zak in elk van de 5 muizen.
LET OP: Plaats 3-4 stukken tumorweefsel in één zak. - Sluit de huid incisies met behulp van weefsellijm.
- Intraperitoneally injecteren elke muis met 100 mL rituximab na implantatie om lymfocyten proliferatie remmen.
- Plaats de muis in een kooi onder een warmtelamp gedurende ongeveer 20 min tot hersteld van anesthesie. Controleer de vitale functies van de muis en zorg voor voldoende hydratatie.
- Breng de muis terug naar het gezelschap van andere muizen nadat hij was hersteld van anesthesie en voedsel en water begon te hebben. Zorg voor postoperatieve zorg en monitoring volgens institutionele richtlijnen. Controleer op tekenen van pijn en nood dagelijks gedurende 3 opeenvolgende dagen na de operatie.
OPMERKING: Criteria voor pijn of nood zijn necrose of ulceratie, gewichtsverlies / lichaamsconditie scoren, gedragsverschijnselen zoals activiteitsniveau, motorische functie en houding. - Controleer de muizen routinematig tweewekelijks op tumorvorming totdat de tumoren de grootte van 0,5 cm in diameter bereiken, gemeten door een remklauw.
- Beoordeel de gezondheidsscore van elke muis als afgeleid van uiterlijk, gedrag en lichaamsconditie39. Gebruik scores van ≤6 als criteria voor stervende muizen die moeten worden opgeofferd door inademing van kooldioxide.
5. Het testen van reacties op genomisch geïdentificeerde doelen in PDX-modellen
- Start de geselecteerde gerichte behandelingen wanneer de tumoren voelbaar zijn en bereik 0,5 cm3 zoals gemeten door een echografie.
- Voorafgaand aan het uitvoeren van een echografie van de buik verwijder de muis buikbont en breng steriele gelei smeermiddel.
- Gebruik een ultrasone machine met een transducer om beelden te verkrijgen met de tumor geplaatst in dwarsdoorsnede. Doe 3 metingen per sessie voor elk dier en beperk de waarde voor een nauwkeurigere beoordeling van de tumorgrootte.
- Analyseer de afbeeldingen met behulp van beschikbare software40.
- Toleer chemotherapie bestaande uit een mengsel van carboplatine bij 51 mg/kg en paclitaxel bij 15 mg/kg intraperitoneally (IP) eenmaal per week voor een totale behandelingsduur van 4-6 weken. Zorg ervoor dat het totale volume voor injectie niet meer dan 0,2 mL bedraagt.
- Maak een MK-220641 voorraadoplossing in 30% cyclodextrine (bijvoorbeeld Captisol) en lever via orale gavage gedurende 4 opeenvolgende weken dagelijks 120 mg/kg.
- Bereid de muis voor op orale gavage door deze vast te houden door de huid van de rug te knijpen en terug te pinnen, zodat het hoofd en de ledematen van de muis worden geïmmobiliseerd.
- Steek de gavage sonde in de achterkant van de keel van de muis totdat de sonde de slokdarm bereikt. Zorg ervoor dat de sonde niet te ver wordt ingebracht, omdat de longen van de muis kunnen perforeren, waardoor de dood kan ontstaan.
- Maak een MK-866942 voorraadoplossing in ethanol op 25 mg/mL. Verdun het in een voertuig met 5,2% Tween 80, 5,2% PEG400 in steriel water voor IP-injecties bij 10 mg/kg gedurende 5 dagen om de week, met een totale duur van de behandeling van 4 weken.
OPMERKING: Het volume dat in muizen wordt geïnjecteerd, moet 50-120 mL zijn, afhankelijk van het gewicht van het dier. - Gebruik 7-8 muizen per behandelingsgroep om voldoende statistisch vermogen te hebben om verschillen43,44te detecteren .
- Beoordeel het lichaamsgewicht en de algemene toestand van de muizen in therapie dagelijks. Drugs achterhouden als het gewicht van een dier daalt 20% of meer van hun oorspronkelijke gewicht.
- Beoordeel de tumor grootte wekelijks met behulp van echografie. Zorg ervoor dat het individu het uitvoeren van de monitoring van de tumor groei is verblind voor de behandeling om de onbevooroordeelde score van de reacties te waarborgen.
OPMERKING: Kleinere laboratoria kunnen 2 verschillende mensen in dienst nemen om behandeling en echografie toe te dienen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Weefsel van resected ovariële tumoren op het moment van debulking operaties werden verzameld in overeenstemming met IRB begeleiding en gebruikt voor 1) genomische karakterisering en 2) engraftment in immuungecompromitteerde muizen (Figuur 1). Mate-pair sequencing protocol36,37 werd gebruikt om structurele veranderingen in DNA te identificeren, waaronder verliezen, winsten en versterkingen. Een representatief genoomplotabel ter illustratie van een landschap van genomische veranderingen in één tumor (aangeduid als OC101) wordt weergegeven in figuur 2. Typisch voor hoge rang sereuze subtype tumoren, meerdere winsten (blauwe lijnen) en schrappingen (rode lijnen) werden gevonden, wat wijst op hoge niveaus van genomische instabiliteit, evenals chromosomale verliezen en winsten, indicatief voor aneuploïdie, werden waargenomen. Op een gemiddelde 300-700 veranderingen totaal worden geïdentificeerd in hoge rang sereuze subtype tumoren45. Latere analyses toonden een paar DNA-veranderingen aan die mogelijk gericht waren met klinisch relevante geneesmiddelen. De hoogste wijziging voor therapeutische interventie in de OC101-tumor was een versterking bij chromosoom 17 waarbij ERBB2(figuur 2 en figuur 3A)betrokken waren. ERBB2 is een gen dat codeert voor HER2 receptor die bekend is bij dimerization met EGFR, HER3 of HER4 om RAS /ERK en PI3K/AKT signaleringstrajecten te activeren en celgroei, celmigratie en invasie te bevorderen. HER2-remmers (bijvoorbeeld monoklonale antilichamen pertuzumab en trastuzumab) zijn effectief bij de behandeling van borstkankerpatiënten wanneer tumoren het HER2-eiwit overexpresseren. Anti-HER2 therapie voor eierstokkanker, echter, is niet fda goedgekeurd.
Vergelijking van het genomische profiel van de tumor van donorpatiënten (figuur 1) met dat van een overeenkomstig PDX-model (niet getoond) toonde een opvallende gelijkenis aan, in overeenstemming met alle eerdere studies die de moleculaire nabijheid van oorspronkelijke tumoren aan hun PDX-derivaten rapporteerden.
Om de resultaten van Mpseq op DNA-niveau te valideren, werden verschillende sets van specifieke primers ontworpen voor de randen van versterkt gebied dat het ERBB2-gen bevat, en PCR werd uitgevoerd met behulp van DNA geïsoleerd van de oorspronkelijke tumor en van een tumor die gedurende meerdere generaties in de muizen werd gepropageerd. Een representatieve gelafbeelding van versterkte producten met behulp van twee verschillende sets primers wordt weergegeven in figuur 3B. Er werd geen band gedetecteerd toen normaal gepoold genomic DNA (aangeduid als C), dat geen versterking van de ERBB-locus bevatte, werd versterkt. Zuivering van de producten uit de gel en Sanger sequencing (niet getoond) verder bevestigd de wijziging voorspeld door Mpeq. Verdere validatie werd uitgevoerd door de expressie van HER2-eiwit in de overeenkomstige PDX-tumor te onderzoeken met behulp van immunoblotting. De analyse toonde een hoog niveau van HER2-eiwit aan (het resultaat wordt niet getoond), in overeenstemming met de waargenomen versterking van het ERBB2-gen.
In DNA van een verschillende eierstokkanker (aangewezen T14) talrijke regionale aanwinsten werden waargenomen. Deze omvatten AKT2- en RICTOR-genen(figuur 3C). Beide waren van groot belang vanuit een therapeutisch perspectief als remmers van AKT2 en mTOR, die RICTOR associeert met, zijn beschikbaar en momenteel in klinische proeven. Aangezien er geen mate paar leest verspreid over de nabijheid van beide gen, eenvoudige PCR validatie van de winst zoals gedetecteerd door Mpeq was niet mogelijk. Daarom hebben we het expressieniveau van overeenkomstige eiwitten getest door middel van immunoblotting. Hoge niveaus van AKT en RICTOR werden waargenomen (Figuur 3D) wat suggereert dat behandeling met gerichte geneesmiddelen gerechtvaardigd is.
Om de gevoeligheid van deze tumor voor remmers van AKT en mTOR te testen, werden PDX muizen met intraperitoneally geïmplanteerde T14 tumor uitgebreid en gerandomiseerd om alleen chemotherapie (carboplatine/paclitaxel) of een combinatie van chemotherapie met pan-AKT-remmer MK-220641 of mTOR-remmer MK-866942te ontvangen. Chemotherapie werd gegeven aan muizen in de combinatiearm gedurende 2 weken voorafgaand aan de toevoeging van de gerichte therapie(figuur 4). Echografie metingen werden wekelijks genomen om tumor regressie / groei te controleren.
Elke behandelingsarm bevatte maar liefst 7 muizen. Dit aantal was voldoende om verschillen in reacties tussen de groepen waar te nemen, terwijl de kosten van het onderzoek aanzienlijk lager werden. Minder muizen (drie tot vier) kunnen worden gebruikt in de controle onbehandelde groep, omdat individuele variaties in tumorgroei verwaarloosbaar zijn en de groei wordt genormaliseerd tot een tumorgrootte waarbij de behandeling in andere armen begint.
Er werd geen verschil waargenomen tussen met chemo behandelde en onbehandelde groepen in de eerste 3 weken van observatie (niet getoond). Een significante vermindering van de tumorlast (58% mediaan) werd waargenomen in de chemotherapie behandelde groep tegen het einde van week 6. Een extra voordeel ten opzichte van chemotherapie alleen werd waargenomen in groepen die een combinatie van chemotherapie met gerichte therapieën kregen. Het verschil werd duidelijk in week 4 en 3 voor respectievelijk MK-8669 (figuur 4A) en MK-2206 (figuur 4B).
Dieren werden geëuthanaseerd en tumorweefsel werd verzameld voor moleculaire analyses van de behandeling respons aan het einde van de behandeling proef in week 7. Daartoe werden de hoeveelheden totale en met fosforyleerde S6 kinase (figuur 5A,B), AKT en mTOR (figuur 5C,D) bepaald met behulp van immunoblotting. Ribosomale eiwit S6 kinase is een downstream boodschapper van de AKT-mTOR route, bekend om up-gereguleerd en fosforylated op stimulatie van de AKT-mTOR as door groeifactoren ter bevordering van de cel overleving en groei. Vergelijking van de niveaus van deze eiwitten in onbehandeld of behandeld met chemotherapie PDX tumoren aan muizen die AKT of mTOR-remmers kregen, vertoonden een duidelijke daling in de laatste twee(figuur 5), wat duidt op effectiviteit van de gerichte therapie op moleculair niveau. Aanpassingen aan het behandelingsregiment, voor zover toepassingstiming voor de gecombineerde geneesmiddelen en de duur van de therapie, moeten worden aangebracht en getest om betere reacties te bereiken.
| Naam primer | Volgorde | Primer Mix | Primers gecombineerd | ||
| OC101 17a-17b R1 | CTGGTCCTGGGAAATAGACACTAGATAAATCATC | 1 | OC101 F1 en R1 | ||
| OC101 17a-17b R2 | GCTCAAGACAGTAACACCTAGTTTTGATTCTGC | 2 | OC101 F1 en R2 | ||
| OC101 17b-17a F1 | GGATTACGGGAACGTGCTACCTTG | 3 | OC101 F2 en R1 | ||
| OC101 17b-17a F2 | AATGCCCTAGCAGTTCTATCCCCACTG | 4 | OC101 F2 en R2 | ||
Tabel 1: Primers die worden gebruikt voor de validatie van het OC101chromosoom 17 wijziging.
| Reagens | Hoeveelheid toe te voegen voor 1 reactie (μL) | Hoeveelheid toe te voegen voor 4 reacties (μL). [Vermenigvuldig met 4,3 om genoeg te maken voor elke primer mix (4)] |
| Nuclease-vrij water | 20.45 | 89.94 |
| 10x buffer (Easy A) | 2.5 | 10.75 |
| dPP's 10 mM | 0.5 | 2.15 |
| Sjabloon-DNA (concentratie >10 ng/μL) | 0.3 | 1.29 |
| Taq Polymerase | 0.25 | 1.08 |
Tabel 2: PCR-installatie om een knooppunt te valideren.
| Temp (C) | Tijd | |
| 94 | 5 min | |
| 94 | 40 s | 35 cycli |
| 59 | 40 s | |
| 72 | 2 min | |
| 72 | 5 min | |
| 4 | Houden |
Tabel 3: Fietsomstandigheden voor PCR om een knooppunt te valideren.
Figuur 1: Schematische weergave van de strategie voor genomically-geleide therapie testen met behulp van PDX-modellen voor sereuze eierstokcarcinoom. H&E kleuring van de eierstokkanker tumor wordt getoond (boven). Schaalbalk=100 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Genomische karakterisering van eierstoktumoren met behulp van Mpeq. Genoom plot toont het landschap van structurele veranderingen en kopie nummer veranderingen zoals gedetecteerd door Mpeq. De X-as overspant de lengte van het chromosoom met chromosoompositienummer. Elk chromosoom wordt aangegeven op de rechter- en linker Y-as. De hoogte van de horizontale sporen voor elk chromosoom geeft het aantal reads gedetecteerd voor 30k base pair vensters. DNA-kopienummers worden aangegeven op kleur, met grijs dat de normale 2N-kopiestatus weergeeft, rood dat overeenkomt met verwijderingen en blauw-aan-winsten. Het aansluiten van zwarte lijnen komt overeen met chromosomale herschikkingen. Wijzigingen op ERBB2 locus zijn afgebeeld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Selectie van doelbare wijzigingen en de validatie daarvan. (A) Een close-upsegment van het genoomplot in Fig.1 ter illustratie van een versterking van het ERBB2-gen op chromosoom 17 (in het blauw). Chromosoomnummers zijn zoals aangegeven. (B) Validatieanalyse van breakpoints op ERBB2 locus zoals geïdentificeerd door MPseq met behulp van PCR-versterking. C is een gepoolde genomic DNA controle, OC101 is DNA van patiënt tumor, M is een DNA-ladder. (C) Een close-up van segmenten van het genoomploceel voor een andere eierstoktumor met winsten (aangegeven door blauwe lijn) op de AKT-locus (boven) en bij het RICTOR-gen (onder). Chromosomen zijn zoals aangegeven. (D) Validatieanalyse van expressie van eiwitten van AKT/mTOR-traject door immunoblotting met behulp van tumorweefsel van PDX (T14), genomische veranderingen waarvoor zijn afgebeeld in C. 30 mg totale eiwitten en specifieke antilichamen tegen AKT, RICTOR, p-mTOR werden gebruikt. MAPK diende als laadcontrole. Pos con is een onafhankelijke tumor gebruikt als een positieve controle. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: De vergelijking van de reacties op chemotherapie alleen en gecombineerd met gerichte therapie bij tumorverbergen winsten bij AKT2 en RICTOR genen met overeenkomstige geneesmiddelen. Behandelingsreacties op een combinatie van chemotherapie en anti-mTOR medicijn MK-8669(A) of remmer van pan-AKT MK2206(B)versus chemotherapie alleen. De tijd van toediening voor elke behandeling en de duur worden weergegeven door de pijlen. Volumes worden uitgedrukt als procent van het initiële volume aan het begin van de behandeling als gemiddelde +/- SD. Chemo is chemotherapie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Vergelijking van moleculaire veranderingen die door elke behandeling worden opgewekt, zoals bepaald door immunoblotting-analyse. (A) Niveaus van S6 en fosfo-S6, de downstream effector van AKT-mTOR traject worden weergegeven. Er werd 30 mg totaal eiwit en specifiek antilichaam op S6 en p-S6 gebruikt. GAPDH werd gebruikt als laadcontrole. Kwantificering van eiwitniveaus genormaliseerd tot GAPDH-niveau wordt weergegeven in (B) (C) Niveaus van mTOR, p-mTOR, AKT en p-AKT zoals gedetecteerd door immunoblotting. GAPDH werd gebruikt als laadcontrole. (D) Kwantificering van eiwitniveaus genormaliseerd tot GAPDH-niveau. NT wordt niet behandeld, chemo is chemotherapie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven de aanpak en protocollen die we gebruikten om een "klinische studie" uit te voeren in PDX-modellen die gebruik maken van moleculaire kenmerken van de tumor zoals verkregen door genomische profilering om de beste keuze van geneesmiddelen voor het testen te bepalen. Meerdere sequencing platforms worden momenteel gebruikt voor genomische karakterisering van primaire tumoren, waaronder hele genoom sequencing, RNAseq en aangepaste genpanelen. Voor hoogwaardig sereuze ovariële carcinoom, Mpeq om structurele veranderingen te identificeren, DNA-herschikkingen en kopieernummer veranderingen, is bijzonder nuttig vanwege de hoge mate van genomische instabiliteit waargenomen in dit type tumor. Het tweede voordeel van het Mpeq-platform is dat het het hele genoom dekt, maar aanzienlijk minder kost dan andere uitgebreide sequencing-technologieën. Mpeq is echter niet geschikt voor puntmutatiedetectie omdat de basisdekking niet voldoende is, en slechts 8-10x bereikt. Een van de beperkingen van het gebruik van Mpseq alleen voor genomische karakterisering van een tumor is de aanwezigheid van complexe geclusterde chromosomale herschikkingen, waarvan de analyse niet de expressie van beïnvloede genen van belang voorspelt. Een kruising gedetecteerd door MpPseq voorspeld om een vermeende fusie gen dat valideert in het DNA door PCR kan niet worden uitgedrukt als gevolg van een frame verschuiving of kleine schrappingen en invoegingen in de promotor regio te creëren. Evenzo moeten chromosomale winsten en versterkingen voor potentiële therapeutische doelen zorgvuldig worden beoordeeld en gevalideerd op het RNA- of eiwitniveau om de expressie van het gen van belang te garanderen.
Hoewel de moleculaire samenstelling van de tumor grotendeels wordt bewaard na voortplanting in muizen voor meerdere generaties, kunnen veranderingen in expressieniveaus van belangrijke genen na verloop van tijd optreden als gevolg van tumorevolutie, kloonselectie of adaptieve reactie op de murineomgeving. Zo is validatie van een wijziging die bedoeld is voor therapeutische interventie in zowel de oorspronkelijke donortumor als de PDX-tumor van cruciaal belang. Voor tumor geïsoleerd van PDX-modellen zowel RNA en eiwit kan worden gebruikt om de expressie niveau te ondervragen als het materiaal is overvloedig. Ofwel kan men worden gekozen om de expressie in de oorspronkelijke tumor te controleren, afhankelijk van de beschikbaarheid en het type van het opgeslagen weefsel, en de beschikbaarheid van antilichamen voor de bijbehorende eiwitdetectie. Het PDX-model is specifiek van onschatbare waarde bij het testen van combinatietherapieën, omdat de in vivo-instelling het mogelijk maakt om bijwerkingen te monitoren, evenals doserings- of duuraanpassingen in het behandelingsregime.
De keuze tussen orthotopische en onderhuidse engraftment kan worden gemaakt, afhankelijk van de specifieke vragen die in de studie worden behandeld. Het is echter belangrijk om in gedachten te houden dat de gevoeligheid van xenografted tumoren voor therapeutica kan worden gemoduleerd door de plaats van implantatie46. Aan de andere kant is er nog geen bewijs gemeld over de ontdekking van geneesmiddelen die een therapeutische respons in orthotopische modellen vertonen, maar afwezig zijn in onderhuids geïmplanteerde PDX9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflict hebben.
Acknowledgments
Wij danken de leden van het Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Dr. Lin Yang en Faye R. Harris, MS, voor de hulp bij het uitvoeren van experimenten. Dit werk werd ondersteund door de heer en mevrouw Neil E. Eckles 'Gift aan de Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13, 3989-3998 (2007).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73, 4885-4897 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Weroha, S. J., et al. Tumorgrafts as in vivo surrogates for women with ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 20, 1288-1297 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. Optimizing the development of targeted agents in pancreatic cancer: tumor fine-needle aspiration biopsy as a platform for novel prospective ex vivo drug sensitivity assays. Molecular Cancer Therapeutics. 6, 1079-1088 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Ricci, F., et al. Patient-derived ovarian tumor xenografts recapitulate human clinicopathology and genetic alterations. Cancer Research. 74, 6980-6990 (2014).
- Fleming, J. M., et al. Local regulation of human breast xenograft models. Journal of Cellular Physiology. 224, 795-806 (2010).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, 451-452 (2015).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50, 1-10 (2018).
- Sivanand, S., et al. A validated tumorgraft model reveals activity of dovitinib against renal cell carcinoma. Science Translational Medicine. 4, 137-152 (2012).
- Pavía-Jiménez, A., Tcheuyap, V. T., Brugarolas, J. Establishing a human renal cell carcinoma tumorgraft platform for preclinical drug testing. Nature Protocols. 9, 1848-1859 (2014).
- Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nature Protocols. 7, 1138-1144 (2012).
- Cutz, J. C., et al. Establishment in severe combined immunodeficiency mice of subrenal capsule xenografts and transplantable tumor lines from a variety of primary human lung cancers: potential models for studying tumor progression-related changes. Clinical Cancer Research. 12, 4043-4054 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73, 5315-5319 (2013).
- Butler, K. A., et al. Prevention of Human Lymphoproliferative Tumor Formation in Ovarian Cancer Patient-Derived Xenografts. Neoplasia. 19, 628-636 (2017).
- Cao, X., et al. Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain. Immunity. 2, 223-238 (1995).
- Dobbin, Z. C., et al. Using heterogeneity of the patient-derived xenograft model to identify the chemoresistant population in ovarian cancer. Oncotarget. 5, 8750-8764 (2014).
- Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Davé, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344, 1-12 (2014).
- Rosfjord, E., Lucas, J., Li, G., Gerber, H. P. Advances in patient-derived tumor xenografts: from target identification to predicting clinical response rates in oncology. Biochemical Pharmacology. 91, 135-143 (2014).
- Braekeveldt, N., Bexell, D. Patient-derived xenografts as preclinical neuroblastoma models. Cell and Tissue Research. 372, 233-243 (2018).
- 'Perez-Soler, R., et al. Response and determinants of sensitivity to paclitaxel in human non-small cell lung cancer tumors heterotransplanted in nude mice. Clinical Cancer Research. 6, 4932-4938 (2000).
- Fichtner, I., et al. Anticancer drug response and expression of molecular markers in early-passage xenotransplanted colon carcinomas. European Journal of Cancer. 40, 298-307 (2004).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21, 1318-1325 (2015).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28, 2595-2605 (2017).
- Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Mengelbier, L. H., et al. Intratumoral genome diversity parallels progression and predicts outcome in pediatric cancer. Nature Communications. 27, 6125 (2015).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168, 613-628 (2017).
- Marusyk, A., et al. Non-cell-autonomous driving of tumour growth supports sub-clonal heterogeneity. Nature. 514, 54-58 (2014).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts reflect the microenvironmental hallmarks of aggressive patient tumours. Cancer Letters. 375, 384-389 (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494, 251-255 (2013).
- Girotti, M. R., et al. Application of Sequencing, Liquid Biopsies, and Patient-Derived Xenografts for Personalized Medicine in Melanoma. Cancer Discovery. 6, 286-299 (2016).
- Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA Research. 19, 395-406 (2012).
- Smadbeck, J. B., et al. Copy number variant analysis using genome-wide mate-pair sequencing. Genes Chromosomes and Cancer. 57, 459-470 (2018).
- Kovtun, I. V., et al. Lineage relationship of Gleason patterns in Gleason score 7 prostate cancer. Cancer Research. 73, 3275-3284 (2013).
- Paster, E. V., Villines, K. A., Hickman, D. L. Endpoints for mouse abdominal tumor models: refinement of current criteria. Comparative Medicine. 59, 234-241 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Cheng, Y., et al. MK-2206, a novel allosteric inhibitor of Akt, synergizes with gefitinib against malignant glioma via modulating both autophagy and apoptosis. Molecular Cancer Therapeutics. 11, 154-164 (2012).
- Rivera, V. M., et al. Ridaforolimus (AP23573; MK-8669), a potent mTOR inhibitor, has broad antitumor activity and can be optimally administered using intermittent dosing regimens. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 1059-1071 (2011).
- Heitjan, D. F., Manni, A., Santen, R. J. Statistical analysis of in vivo tumor growth experiments. Cancer Research. 53, 6042-6050 (1993).
- Vargas, R., et al. Case study: patient-derived clear cell adenocarcinoma xenograft model longitudinally predicts treatment response. NPJ Precision Oncology. 2, 14 (2018).
- Harris, F. R., et al. Targeting HER2 in patient-derived xenograft ovarian cancer models sensitizes tumors to chemotherapy. Molecular Oncology. 13, 132-152 (2019).
- Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer and Metastasis Reviews. 13, 209-222 (1994).
